用于检测绵羊肺炎支原体的组合物、试剂盒和方法与流程

本发明涉及分子生物技术领域，具体地涉及一种绵羊肺炎支原体快速检测的组合物、试剂盒和方法。

背景技术：

羊支原体肺炎(Mycoplasma pneumonia of sheep and goats，MPSG)是通过空气、飞沫、饮水等途径传播的高接触性传染病，主要临床症状有喘气、咳嗽、高热、渐进性消瘦和慢性增生性间质性肺炎等。目前已发现的引起羊支原体肺炎的病原菌有绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae，MO)、山羊支原体山羊亚种(Mycoplasma capricolum subsp.capricolum，Mcc)、丝状支原体山羊亚种(Mycoplasma mycoides subsp.capri，Mmc)等，其中MO是常见的致病菌之一，该病在我国广泛分布和流行，感染率较高，严重影响羊养殖业，所以建立准确检测MO的方法至关重要，对羊支原体肺炎的防控具有重要意义。

目前检测羊支原体肺炎的方法大致包括以下。培养法是是检测病原体存在的直接证据，是检测MO的金标准。一旦检出，即可确诊。可分为一般的固体培养法和快速培养法。然而由于MO生长缓慢，从临床样本中初次分离一般需要盲传2～4代才能通过显微镜在固体培养基上看到菌落，需要数日才能得到检测结果，不仅检出率低，而且存在耗时过多、中间环节复杂、培养条件要求高等缺陷，给MO的临床分离带来了一定的困难，不适合临床快速诊断。血清学检测技术具有特异性较高、灵敏度较好、快速、易于操作等优点，非常适合临床样本的快速检查和大规模的流行病学调查，但是支原体肺炎类大多具有共同抗原，容易造成假阳性的实验结果。免疫组化技术是一门将组织学与免疫学相结合的技术，是在组织细胞原位，通过抗原-抗体特异性结合反应和组织化学显色反应，借助可见的标记物对相应抗原或抗体进行定位、定性和定量检测，但对于病情不重或者选择病灶部位出现偏差较大时，免疫组化则难以检测到羊支原体的存在。在众多检测方法中，多聚酶链式反应是简便且行之有效的检测方法。PCR法检测快速、特异性和敏感性高，检测样本不需要是活体，不受患者免疫功能、病程、感染程度、有无使用药物治疗及未达到血清检测水平的影响，使早期诊断和抗生素的正确选择成为可能。对早期及未生成抗体者及抗体已消失的感染患者有积极的意义；有助于早期诊断，及时治疗，并且不存在交叉反应和放射性污染，易标准化。虽然PCR法检测快速，在某种意义上可替代培养法，但其高敏感性也使PCR法对实验环境和仪器要求比较高，存在着技术条件要求高、操作复杂、不易普及的问题，一般基层实验室难以开展，且价格也相对较高。

技术实现要素：

为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明提供一种快速、特异检测绵羊支原体肺炎的组合物、试剂盒和方法。具体地，本发明包括以下内容：

本发明的第一方面，提供用于检测绵羊肺炎支原体的组合物，其包括能够与绵羊肺炎支原体的转酮醇酶基因选择性杂交的第一寡核苷酸、第二寡核苷酸和可选的第三寡核苷酸。

本发明中，第一寡核苷酸的长度一般为25～35nt，优选为26～30nt。优选地，第一寡核苷酸的序列如SEQ ID No.1所示。本发明中，第二寡核苷酸的长度一般为25～35nt，优选为26～30nt。在某些实施方案中，第二寡核苷酸的5’端没有任何修饰。在另外的实施方案中，本发明的第二寡核苷酸的5’端带有Biotin标记。优选地，第二寡核苷酸的序列如SEQ ID No.2所示，且在5’端带有Biotin标记。本发明中，第三寡核苷酸的长度一般为40～55nt，优选40～50nt。第三寡核苷酸的5’端带有检测标记，例如FAM荧光基团。第三寡核苷酸的3’端带有终止磷酸基团。第三寡核苷酸的序列中间含有THF切割位点。优选地，第三寡核苷酸的序列如SEQ ID No.3所示，且在5’端带有FAM，在3’端带有终止磷酸基团和在第29-30位碱基之间为idSp。

本发明中，第一寡核苷酸能够与转酮醇酶基因5’端的第一区域选择性杂交，第二寡核苷酸能够与转酮醇酶基因3’端的第二区域选择性杂交，第三寡核苷酸能够与转酮醇酶基因的第三区域选择性杂交。其中，第一区域与第二区域之间最近的距离在50bp～1000bp之间，优选70～800bp，更优选100～500bp，例如100～200bp。此处最近的距离是指第一区域3’端最后一个碱基与第二区域5’端第一个碱基之间的距离。第三区域位于第一区域和第二区域之间。此处第三区域优选与第一区域或第二区域之间不存在重叠。

本发明的第二方面，提供用于检测绵羊肺炎支原体的试剂盒，其包含本发明所述的第一方面的组合物。在上文中，已对组合物进行了详细说明，在此不再赘述。下面说明本发明试剂盒的其他部分。

本发明的试剂盒还可包括以政府机构规定的形式与调控制造、使用或销售诊断试剂盒相关的注意事项。试剂盒还可提供有使用、储存和故障排除的详细说明书。试剂盒还可任选地设置在适合的优选用于以高通量设置的机器人操作的装置中。

本发明试剂盒的组分可提供为干粉。当试剂和/或组分提供为干粉时，粉末可通过添加适合的溶剂来恢复原状。预期该溶剂还可设置于另一容器中。容器通常会包括至少一种小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器和/或其它容器手段，其中可选等分地放置溶剂。试剂盒还可包括用于包含无菌、药学上可接受的缓冲液和/或其它溶剂的第二容器手段。

在试剂盒中存在超过一种组分的情况下，该试剂盒还通常会包含可单独放置另外的组分的第二、第三或其它另外的容器。另外，可在容器中包含各多种组分的组合。

本发明的试剂盒还可包括保持或维持DNA的组分，例如抗核酸降解的试剂。此类组分可为例如或无RNase或具有抗RNase的保护的核酸酶。本文所述的任何组合物或试剂可为试剂盒中的组分。

本发明的第三方面，提供用于检测绵羊肺炎支原体的方法，其包括以下步骤：

(1)提供来源于绵羊的生物样本的模板；

(2)使模板与组合物组成反应体系，在34℃～42℃下反应5～20分钟得到扩增产物；

(3)使扩增产物与带有标记的测流层析试纸条接触，当在检测线和质控线处都显示红色时，判定所述生物样本为阳性样本，当在质控线处显示红色而检测线未显色时，判定所述生物样本为阴性样本，当质控线不显示红色时证明试纸条失效。

本发明的生物样本指源自待检测的绵羊的体液或分泌物。优选地，生物样本源自患有相关疾病的绵羊。其中体液的实例包括但不限于囊液、鼻液和关节液、乳液等。优选地，本发明的生物样本为绵羊鼻液。作为模板的物质可以是DNA也可以是RNA。

与一般的PCR反应不同，本发明的反应体系在恒定温度下进行，且反应温度较低，一般在34℃～42℃的温度环境中进行，并且反应时间也只需5～20分钟，优选12～18分钟。最优选地实施方案中，本发明的反应温度为39℃，反应时间为15分钟。

在示例性实施方案中，本发明的反应体系(不包括模板)包括：

转酮醇酶是在戊糖磷酸循环以及光合成的还原型戊糖磷酸循环中起着重要作用的酶。广泛存在于细菌、酵母、菠菜和肝脏中。本发明研究发现在MO中同样存在转酮醇酶，并进一步发现该酶的基因存在种内保守性和种间特异性，特别是能够满足MO与临床株SC01的种内保守性，以及与丝状支原体山羊亚种标准株PG3、山羊支原体山羊肺炎亚种标准株F38、牛支原体标准株PG45、无乳支原体标准株PG2、肺炎链球菌、克雷伯氏菌、绿脓杆菌、居泉沙雷菌、牛沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、巴氏杆菌等致病菌的种间特异性。基于该发现，本发明设计针对该基因的特定区域的重组聚合扩增反应的寡核苷酸序列。

本发明的组合物不仅可以检测出绵羊肺炎支原体标准株Y98，还可以检测出临床株SC01。当这些组合物用于MO的检测时，可做到羊肺炎支原体种内保守性以及羊肺炎支原体与其他致病菌种间的特异性，具有优异的技术效果。

进一步地，本发明进一步优化了反应体系，并且得到最佳反应时间与最佳反应温度，从而使检测的特异性、敏感性、重复性与稳定性均大大提升，建立得到特异性好、敏感性高、且可以稳定重复的绵羊肺炎支原体快速检测方法。

另外，本发明的所建立的方案在检测MO时方法操作简单，便捷省时，无需大型的实验仪器设备，非常适合没有任何实验基础的人员操作在野外或现场快速检测，值得推广使用。

附图说明

图1：针对转酮醇酶基因的扩增反应的时间反应梯度结果观察示意图。

图2：针对转酮醇酶基因的扩增反应的温度反应梯度结果观察示意图。

图3：针对转酮醇酶基因的扩增反应的特异性反应结果观察示意图。1：绵羊肺炎支原体标准株Y98；2：绵羊肺炎支原体SC01株；3：丝状支原体山羊亚种标准株PG3；4：山羊支原体山羊肺炎亚种标准株F38；5：牛支原体标准株PG45；6：无乳支原体标准株PG2；7：肺炎链球菌；8：克雷伯氏菌；9：绿脓杆菌；10：居泉沙雷菌；11：牛沙门氏菌；12:大肠杆菌；13：金黄色葡萄球菌；14：巴氏杆菌；15：无模板对照。

图4：针对转酮醇酶基因的扩增反应的敏感性反应结果观察示意图。1：1.9×10¹⁰；2：1.9×10⁹；3:1.9×10⁸；4：1.9×10⁷；5：1.9×10⁶；6：1.9×10⁵；7：1.9×10⁴；8：1.9×10³；9：1.9×10²；10：1.9×10¹；11：1.9×10⁰；C：无模板对照。

图5：针对转酮醇酶基因的扩增反应的批内重复性结果观察示意图。

图6：针对转酮醇酶基因的扩增反应的批间重复性结果观察示意图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于重量的百分数。

需要说明的是，本发明的组合物中的寡核苷酸与一般PCR的引物和探针不同。传统的引物或探针均不能用于本发明的常温下的重组聚合反应(RPA)。这是因为在常温下进行的扩增，其DNA的解链与PCR完全不同。传统估算的熔点不适用于这个系统。另外，传统的PCR引物由于长度不足，用于本发明的重组聚合反应时效率过低。此外，目前的探针也不适用于本发明的反应，特别是目前用到了聚合酶5’-3’核酸酶活性的探针系统，这样的酶活性与本发明的反应根本不兼容。针对本发明的重组聚合反应目前还没有相应的引物或探针设计标准。

实施例1

本实施例为基于特异性基因转酮醇酶的扩增反应的体系。具体如下：

(1)本发明的检测体系包括：

其中，Primer free Rehydration buffer为已知可商购产品。

上述buffer中含有反应所需的全部酶和试剂，只需在其中加入模板和相应的寡核苷酸即可。在反应前需加入例如1.25μl的醋酸镁(MgOAc)至混合物体系中启动反应。反应后得到扩增产物，此时产物可使用带有标记的测流层析试纸条进行检测。当检测产物与试纸条结合时，阳性样本会在检测线和质控线处都显示红色，而阴性样本只会在指控线处显示红色，当质控线不显示红色时证明试纸条失效，为无效的检测结果。

(2)最佳反应时间的探索

选择转酮醇酶基因进行下述重组聚合扩增的实验条件，设计下述寡核苷酸进行重组聚合扩增反应，从而建立快速检测MO的方法，具体实验过程如下：

MTKF的序列如下：

TAATTTCAAACTTGGAGCCTACTTAGCTC(包含SEQ ID No.1)

MTKR的序列如下：

(Biotin)TCCTTACTTCGAAAGCCAATTTCATCAAG(包含SEQ ID No.2)

MTKP的序列如下：

(FAM)ACCGGTAGTGAGTTAGGACTGGCAAAAGAA/idSp/TCGCTCAAAAGTTAG(P)(包含SEQ ID No.3)。

反应体系：

将上述反应液混合后加入反应管中充分混匀，加入1μL的待测模板和1.25μL MgOAC，涡旋后简短离心，放于39℃水浴锅中，反应10min。反应结束后，取5μL反应液与100μL检测缓冲液于无菌的1.5mL离心管中充分混匀，将测流层析试纸条插入混合液中，即可观察反应结果。

建立反应体系后，设置0min～45min时间梯度反应探索其最佳反应时间，发现反应5min即可产生在测流层析试纸条上肉眼可见的检测结果，为使反应更加稳定，设定15min为最佳反应时间。检测结果见图1所示。

(3)最佳反应温度的探索

以15min为最佳反应时间，设置34℃～42℃反应温度梯度，发现其在34℃～42℃内均可发生反应，检测结果见图2所示，反应结果中39℃时检测线的红色较深，所以选择在39℃为最佳反应温度。

(4)检测的特异性

以15min为最佳反应时间，39℃为最佳反应温度，检测本发明的反应的特异性，检测结果见图3所示，与PCR的检测结果相同，仅能检测出绵羊肺炎支原体标准株Y98以及临床株SC01，不能检测出其余致病菌。

(5)检测的敏感性

在特异性良好的前提下，克隆转酮醇酶基因的目的片段，计算其拷贝数，并进行10倍梯度稀释，发现本发明的反应可检出的最低限度为10¹copies/μL，检测结果见图4所示。

(6)检测的稳定性

在探究了反应的特异性和敏感性后，需对反应的稳定性进行检测。故选择1.9×10⁷、1.9×10⁶、1.9×10⁵三个不同浓度的阳性质粒标准品，在同一条件下重复三次，观察批内的重复效果，批内稳定性检测结果见图5所示；取上述3个不同浓度的阳性质粒标准品，在同一个实验中重复三次，观察批间的重复效果，批内稳定性检测结果见图6所示。

建立方法后，对我区32个临床样本进行检测，发现本发明第二扩增体系的检出阳性样本19个，将临床样本用传统的分子生物学检测方法进行检测，发现检测结果与PCR检测结果的符合率为94％。

本发明通过对特异性基因转酮醇酶的设计重组聚合扩增反应的特异性引物和探针，对最佳反应时间与最佳反应温度、检测的特异性、敏感性、重复性与稳定性均进行了探索，找到了最佳反应条件，建立的特异性好、敏感性高、且可以稳定重复的MO快速检测方法。本发明所建立的检测MO的方法操作简单，便捷省时，无需大型的实验仪器设备，非常适合没有任何实验基础的人员操作，是值得推广使用的。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

序列表

<110> 宁夏大学

<120> 用于检测绵羊肺炎支原体的组合物、试剂盒和方法

<130> BH1900144-1

<141> 2019-07-09

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

taatttcaaa cttggagcct acttagctc 29

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

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<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

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