蜡样芽孢杆菌肠毒素基因的CAMP检测引物组及试剂盒的制作方法

本发明属于细菌基因检测技术领域，尤其涉及蜡样芽孢杆菌肠毒素基因的CAMP检测引物组及试剂盒。

背景技术：

蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)是一种无荚膜，能运动，产芽孢，兼性好氧的，食源性的条件致病菌，广泛分布于空气、土壤、污水以及各类生、熟食品及食品原料中。人们在食用被蜡样芽胞杆菌污染的食品后,一般在8～16h内出现呕吐或腹泻,或两者兼有的中毒症状。呕吐型中毒主要由呕吐毒素引起，而腹泻型则为多种肠毒素的作用。蜡样芽孢杆菌对食品安全及人体健康安全构成了威胁，因此，有必要了解食品中蜡样芽孢杆菌的潜在毒性，同时建立快速且准确的检测方案对其进行监控。

目前我国对蜡样芽孢杆菌肠毒素基因检测方法主要依靠以PCR为代表的变温核酸扩增检测技术，尽管该方法操作简单，但该技术需要精密、复杂的变温仪器，需配备专业操作人员，难以满足快速检测的应用需求。环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是2000年日本荣研化学株式会社开发的替代PCR的核酸扩增方法。该方法主要是利用4种不同的特异性引物识别靶基因的特定区域，在等温条件下进行扩增反应。与PCR技术相比，LAMP反应在恒温水浴中便可完成，仪器设备要求低，较传统PCR和培养法操作简单，不需要专业人员也可准确完成，但其引物设计复杂，同时其产物的自扩增能力导致假阳性问题较为严重，一定程度上限制其应用。而竞争性互补介导核酸恒温扩增技术(competitive annealing mediated isothermal amplification,CAMP)相较于LAMP方法，所需的目标核酸片段较短，引物设计原理更简单，且同样具有很高的特异性及灵敏度。

目前，关于蜡样芽孢杆菌肠毒素基因entFM和bceT的CAMP检测技术还未见报道。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明主要解决的技术问题在于提供一种用于蜡样芽孢杆菌肠毒素基因entFM和bceT检测的CAMP引物组与试剂盒，本发明提供的引物灵敏度和特异性皆很高，可实现对蜡样芽孢杆菌肠毒素基因entFM和bceT快速准确的检测。

一种蜡样芽孢杆菌肠毒素基因的CAMP检测引物组，所述引物组包括两组引物，分别为针对蜡样芽孢杆菌肠毒素基因entFM区片段扩增的引物和针对蜡样芽孢杆菌肠毒素基因bceT区片段扩增的引物；

所述针对蜡样芽孢杆菌肠毒素基因entFM区片段扩增的引物，其顺向引物(entFM-NF)的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，逆向引物(entFM-NR)的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述针对蜡样芽孢杆菌肠毒素基因bceT区片段扩增的引物，其顺向引物(bceT-NF)的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，逆向引物(bceT-NR)的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明提供的CAMP引物组针对蜡样芽孢杆菌肠毒素基因entFM和bceT，由上述的各自所针对的一对引物构成(NF/NR)。具体核苷酸序列如下表1所示：

表1引物序列

一种试剂盒，包括蜡样芽孢杆菌肠毒素基因的CAMP检测引物组。试剂盒中包括若干个装有CAMP工作液的CAMP反应管，工作液为CAMP引物放入DEPC处理水中制成。每个所述CAMP反应管中含有所述引物组中的一组引物。每个试剂盒中同时具备含有entFM引物组的CAMP反应管和含有bceT引物组的CAMP反应管。

优选的，每条引物在所述CAMP工作液中的浓度均为1.5～2.0μM。

优选的，试剂盒中还包括CAMP反应液和CAMP显色液。

进一步地，所述CAMP反应液包括Bst聚合酶、CAMP反应缓冲液和DEPC处理水。其中，CAMP反应缓冲液包括Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4和Triton X-100。

具体地，所述CAMP反应液体系中各组分如下，体积为25μL：

20mM Tris-HCl(pH8.8)；10mM KCl；10mM(NH4)2SO4；2～20mM MgSO4；0.1～0.5％Triton X-100；0.2～1M甜菜碱；1～1.6mM dNTP；5～10U Bst DNA聚合酶。

进一步地，所述CAMP显色液为Sybr green I，Eva green，羟基萘酚蓝(HNB)和铬黑T(EBT)等中的一种或数种。

在进行检测时，可以使用1～4μL的引物组工作液与CAMP反应液组成25μL的检测混合液。CAMP显色液加入量可以是100～150μmol/L检测混合液。

本发明还提供了蜡样芽孢杆菌肠毒素基因的检测方法，包括以下步骤：

1)将核酸样本、CAMP反应液、DEPC处理水加入CAMP反应管，得到扩增反应液；

2)将步骤1)中获得的扩增反应液61～65℃反应20～60mi n，根据显色结果判断是否是蜡样芽孢杆菌，以及判断其是否含有肠毒素基因entFM和/或bceT。

优选的，步骤2)的工作条件为，扩增反应液64℃反应60min。

本发明的有益效果如下：

本发明基于CAMP技术，针对蜡样芽孢杆菌肠毒素基因entFM和bceT的两个特异保守区域分别设计一对引物。本发明提供的引物组敏感性高、特异性强，由其制成的试剂盒能够快速、准确的检测样品中是否含有蜡样芽孢杆菌，同时判断其是否含有产毒基因entFM和bceT。并且，由于本发明提供的引物组具有极高的特异性，在CAMP扩增所需时间短，进一步缩短了检测的时间，简化了操作。由于本发明提供的方法或试剂盒无需昂贵的仪器、也无需复杂的操作就可完成对蜡样芽孢杆菌肠毒素基因entFM和bceT的快速准确检测，因此，适用于专业程度不高的食品企业、监管部门等地的现场快速检测。本发明所提供的可视化试剂盒将为现场检测提供极大便利，将其制备成为试剂盒可实现对蜡样芽孢杆菌肠毒素基因entFM和bceT的快速准确检测。

附图说明

图1为本发明实施例1中的荧光强度随反应时间变化的曲线图；

图2为本发明实施例1中的溶解曲线图；

图3为本发明实施例2中的荧光强度随反应时间变化的曲线图；

图4为本发明实施例2中的熔解曲线图；

图5为本发明实施例3中的检测结果示意图；

图6为本发明实施例4中的检测结果示意图。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，具体可参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中，Bst DNA聚合酶的供应商为NEW ENGLAND Biolabs，Sybr Green I的供应商为Thermo Fisher，Eva Green的供应商为Biotum,羟基萘酚蓝(HNB)的供应商为Fluka，铬黑T(EBT)的供应商为Aladdin。

实施例1

一种检测蜡样芽孢杆菌的试剂盒，包括蜡样芽孢杆菌肠毒素基因的CAMP检测引物组，所述引物组包括两组引物，分别为针对蜡样芽孢杆菌肠毒素基因entFM区片段扩增的引物(entFM-NF；entFM-NR)和针对蜡样芽孢杆菌肠毒素基因bceT区片段扩增的引物(bceT-NF；bceT-NR)；

试剂盒中包括若干个装有CAMP工作液的CAMP反应管，CAMP工作液为上述引物组放入DEPC处理水中制成；试剂盒中同时具备含有entFM引物组的CAMP反应管和含有bceT引物组的CAMP反应管。含有entFM引物组的CAMP反应管，其中entFM-NF与entFM-NR的浓度均为1.6μM，工作液体积1μL；含有bceT引物组的CAMP反应管，其中bceT-NF和和bceT-NR的浓度均为1.6μM,工作液体积1μL。

试剂盒中包括CAMP反应液，CAMP反应液包括Bst聚合酶、CAMP反应缓冲液和DEPC处理水。其中，CAMP反应缓冲液包括Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4和Triton X-100。

试剂盒中包括显色液Sybr Green I和Eva Green。

使用上述试剂盒中的Sybr Green I显色液验证对蜡样芽孢杆菌肠毒素基因entFM的扩增反应。

反应溶液体系共25μL，组合如下：

20mM Tris-HCl(pH8.8)；10mM KCl；10mM(NH4)2SO4；6mM MgSO4；0.1％Triton X-100；1M甜菜碱；1.4mM dNTP；8U Bst DNA聚合酶；1μL SYBR Green I；1μL核酸样本；

引物：含有entFM引物组的CAMP工作液1μL；

靶:Bacillus cereus-entFM dsDNA/GenBank:AY789084.1；

同时设置无靶对照组。

反应条件如下：

1)将核酸样本、CAMP反应液、DEPC处理水加入含有entFM引物组的CAMP反应管，得到扩增反应液；

2)设置Applied Biosystems QuantStudio 5 Real-Time PCR反应温度恒定为64℃，反应时间为60min，根据显色结果判断是否是蜡样芽孢杆菌，以及判断其是否含有肠毒素基因entFM。

SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。

荧光强度随反应温度变化的曲线如图1，溶解曲线如图2所示。将荧光检测应用于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断结果。

实施例2

使用实施例1中的试剂盒进行下述反应。

使用试剂盒中的Eva Green显色液验证对蜡样芽孢杆菌肠毒素基因bceT的扩增反应。

反应溶液体系共25μL，组合如下：

20mM Tris-HCl(pH8.8)；10mM KCl；10mM(NH4)2SO4；6mM MgSO4；0.1％Triton X-100；1M甜菜碱；1.4mM dNTP；8U Bst DNA聚合酶；1μL Eva green；1μL核酸样本；

引物：含有bceT引物组的CAMP工作液1μL；

靶:Bacillus cereus-bceT dsDNA/GenBank:D17312.1；

同时设置无靶对照组。

反应条件如下：

1)将核酸样本、CAMP反应液、DEPC处理水加入含有bceT引物组的CAMP反应管，得到扩增反应液；

2)设置Applied Biosystems QuantStudio 5 Real-Time PCR反应温度恒定为63℃，反应时间为60min，根据显色结果判断是否是蜡样芽孢杆菌，以及判断其是否含有肠毒素基因bceT。

Eva Green同SYBR Green I类似，是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对PCR等核酸扩增反应的抑制远小于后者。在游离状态下，Eva Green发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，Eva Green的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链DNA数量。

荧光强度随反应温度变化的曲线如图3，溶解曲线如图4所示。将荧光检测应用于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断结果。

实施例3

一种检测蜡样芽孢杆菌的试剂盒，包括蜡样芽孢杆菌肠毒素基因的CAMP检测引物组，所述引物组包括两组引物，分别为针对蜡样芽孢杆菌肠毒素基因entFM区片段扩增的引物(entFM-NF；entFM-NR)和针对蜡样芽孢杆菌肠毒素基因bceT区片段扩增的引物(bceT-NF；bceT-NR)；

试剂盒中包括若干个装有CAMP工作液的CAMP反应管，CAMP工作液为上述引物放入DEPC处理水中制成；试剂盒中同时具备含有entFM引物组的CAMP反应管和含有bceT引物组的CAMP反应管。含有entFM引物组的CAMP反应管，其中entFM-NF与entFM-NR的浓度均为2.0μM，工作液体积2.0μL；含有bceT引物组的CAMP反应管，其中bceT-NF和和bceT-NR的浓度均为2.0μM,工作液体积4μL。

试剂盒中包括CAMP反应液，CAMP反应液包括Bst聚合酶、CAMP反应缓冲液和DEPC处理水。其中，CAMP反应缓冲液包括Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4和Triton X-100。

试剂盒中包括显色液羟基萘酚蓝(HNB)。

使用上述试剂盒对蜡样芽孢杆菌肠毒素基因entFM的可视化检测。

反应溶液体系共25μL，组合如下：

20mM Tris-HCl(pH8.8)；10mM KCl；10mM(NH4)2SO4；2mM MgSO4；0.5％Triton X-100；0.2M甜菜碱；1.0mM dNTP；5U Bst DNA聚合酶；120μM羟基萘酚蓝(HNB)；2μL核酸样本；

引物：含有entFM引物组的CAMP工作液2μL；

靶:Bacillus cereus-entFM dsDNA/GenBank:AY789084.1；

同时设置无靶对照组。

反应条件如下：

1)将核酸样本、CAMP反应液、DEPC处理水加入含有entFM引物组的CAMP反应管，得到扩增反应液；

2)设置Applied Biosystems QuantStudio 5 Real-Time PCR反应温度恒定为61℃，反应时间为40min，根据显色结果判断是否是蜡样芽孢杆菌，以及判断其是否含有肠毒素基因entFM。

羟基萘酚蓝(HNB)是应用于CAMP技术中可视化检测的指示剂。其原理为：当发生核酸体外扩增反应时会产生大量不溶副产物焦磷酸镁，从而导致镁离子减少，而HNB为镁离子指示剂故可监测有无扩增反应发生。当CAMP未发生扩增反应时，体系中镁离子浓度高，反应液呈紫色；当CAMP发生扩增反应时，体系中镁离子浓度低，反应液呈蓝色。

结果判断：蓝色为阳性，紫色为阴性。结果在图5中显示，各反应管的标记数字分别对应样品如下：

1-3：Bacillus cereus-entFM dsDNA检测的阴性结果

4-6：Bacillus cereus-entFM dsDNA检测的阳性结果。

注：由于申请文件附图要求为黑白，特此说明：图5中，1-3号为紫色，4-6号为蓝色。如有需要，可提供原彩图。

实施例4

使用实施例3中的试剂盒对蜡样芽孢杆菌肠毒素基因bceT的可视化检测。

反应溶液体系共25μL，组合如下：

20mM Tris-HCl(pH8.8)；10mM KCl；10mM(NH4)2SO4；20mM MgSO4；0.5％Triton X-100；0.5M甜菜碱；1.6mM dNTP；10U Bst DNA聚合酶；150μM羟基萘酚蓝(HNB)；2μL核酸样本；

引物：含有bceT引物组的CAMP工作液4μL；；

靶:Bacillus cereus-bceT dsDNA/GenBank:D17312.1；

同时设置无靶对照组。

反应条件如下：

1)将核酸样本、CAMP反应液、DEPC处理水加入含有bceT引物组的CAMP反应管，得到扩增反应液；

2)设置Applied Biosystems QuantStudio 5 Real-Time PCR反应温度恒定为65℃，反应时间为30min，根据显色结果判断是否是蜡样芽孢杆菌，以及判断其是否含有肠毒素基因bceT。

结果判断：蓝色为阳性，紫色为阴性。结果在图6中显示，各反应管的标记数字分别对应样品如下：

1-3：Bacillus cereus-bceT dsDNA检测的阴性结果。

4-6：Bacillus cereus-bceT dsDNA检测的阳性结果。

注：由于申请文件附图要求为黑白，特此说明：图6中，1-3号为紫色，4-6号为蓝色。如有需要，可提供原彩图。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 沈阳农业大学

<120> 蜡样芽孢杆菌肠毒素基因的CAMP检测引物组及试剂盒

<141> 2019-07-25

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

cttttaaagc accagtgtta acaacacgaa acacaacaac caactac 47

<210> 2

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

gttgttaaca ctggtgcttt aaaagactcc accgattaca gcg 43

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

tcacaccaac catcagctca tttgggcaat gaaagggta 39

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

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