一种用于汞离子检测的核酸蛋白复合物变构型微生物全细胞传感器的构建及其应用的制作方法

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种新型的检测汞离子的微生物全细胞荧光传感器。

背景技术：

汞是常见的重金属，元素符号hg，在化学元素周期表中位于第6周期、第iib族，是常温常压下唯一以液态存在的金属。汞是银白色闪亮的重质液体，化学性质稳定，不溶于酸也不溶于碱。汞常温下即可蒸发，汞蒸气和汞的化合物多有剧毒(慢性)。汞的使用历史悠久，用途广泛，污染情况较为严峻。汞金属在自然环境中不断积聚，造成水体、土壤、大气污染。汞与其他重金属一样不能被微生物代谢，也无法参与到环境的化学降解中，从而长期存在于环境中并对生态系统造成重大的危害。环境中存在的汞同样威胁人体健康，它们会通过两种方式进入人体：一是重金属污染的水和食物被人直接食用；另一种是通过食物链富集，最后进入人体。汞蒸气和汞盐(除了一些溶解度极小的如硫化汞)都是剧毒的，口服、吸入或接触后可以导致脑和肝损伤。汞破坏中枢神经系统，对口、粘膜和牙齿有不良影响。长时间暴露在高汞环境中可以导致脑损伤和死亡。近些年来，汞污染事件频发，且危害广、规模大、治理难、影响深远。快速且准确的检测技术对于汞中毒、汞污染事件的发生有着重要的预防作用。目前，高灵敏度的光谱技术满足了金属的精确检测的需要，如原子吸收光谱法(faas,etaas)，电感耦合等离子体光发射(icp-aes)，电感耦合等离子质谱法(icp-ms)，气相色谱法等。这些分析方法虽然能够对环境中的汞离子进行有效分析，而且测量精度可达到mg/kg。然而，这些分析方法成本高、耗时长，不仅需要昂贵仪器的支持，而且还需要复杂的预处理过程和较大的样本量，不适合现场、在线分析检测，难以适应环境及市场产品的现场抽查、生产企业自查及产品进出口快速通关的要求。因此，研究人员致力于探索易使用、性价比高、快速、灵敏的重金属检测替代方法。

微生物传感器是一种生物传感器，它是以微生物细胞为感应元件，利用微生物本身的机制，将其报告元件结合，从而检测各种物理、化学和生物物质[8]。微生物传感器可以在检测过程中将生物信息转化为可测量的信号进行定性或定量分析。因为微生物具有种类多、分布广、表面积大、繁殖能力强、适应性强、代谢活跃等优点，越来越多地被开发为具有检测能力的传感器。随着相关理论和技术的发展，微生物传感器已被应用于医药、农业和生物技术领域等。

研究发现微生物体内具有天然的重金属离子抵抗机制(heavymetalresistancesystem)，这一机制能够识别细胞内特定的金属离子，并开启相应功能基因的表达，通过催化、外排和螯合三种方式解除重金属离子对微生物的毒性。重金属抵抗机制为微生物传感器的构建提供了识别元件。利用这一机制，研究人员构建了针对重金属离子的微生物传感器，并在微量检测的应用中有着不俗的表现。通过优化汞离子微生物传感器的技术和方法，完善传感器的检测效果，不仅可以使其应用于更为严苛的环境和更为精确的检测中，并且可以将这种技术方法通用化，制造出更多针对不同重金属的传感器，更好地预防重金属污染事件的发生和自然环境的恶化。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种简单易行、便于携带、快速准确、成本低廉的新型的检测汞离子的微生物荧光传感器以及其使用方法。

本发明提供了微生物全细胞传感器，包含一种汞离子诱导的荧光蛋白报告质粒，是一个由组成型启动子调控转录的merr基因，由merr蛋白特异性结合的多核苷酸序列和该序列直接调控的荧光蛋白基因作为核心元件的重组质粒。

在本发明的一些具体实施方案中，将荧光蛋白报告质粒转化到宿主细菌中，宿主细菌包括但不限于大肠杆菌。

在本发明的一些具体实施方案中，所述组成型启动子序列包括但不限于序列seqidno:1，seqidno:2，seqidno:3。

在本发明的一些具体实施方案中，所述merr基因，其序列为seqidno:4。

在本发明的一些具体实施方案中，所述merr蛋白特异性结合多核苷酸序列，其序列为seqidno:5。

在本发明的一些具体实施方案中，所述荧光蛋白，包括但不限于绿色荧光蛋白，红色荧光蛋白。

本发明还提供了所述微生物全细胞传感器的检测方法，使用merr蛋白及特定的多核苷酸序列形成的复合物，控制荧光蛋白基因的转录，将汞离子浓度信号转化为荧光强度信号获得待测样本中汞离子浓度的方法。优选待测样本为牛奶。

在本发明的一些具体实施方案中，所述检测方法的反应体系如下：

微生物传感器培养液(od600为0.2-0.6)1-8ml

新鲜的培养基1-8ml

检测样品100-200μl

孵育时间为1h-5h。

在本发明的一些具体实施方案中，将微生物全细胞传感器的荧光强度和汞离子浓度制成工作曲线，从而通过检测荧光强度达到检测样品中汞离子浓度的目的。

本发明的检测汞离子的微生物传感器可以通过建立标准曲线，实现对样品中的汞离子快速准确的定性和定量检测。

本发明利用合成生物学改造大肠杆菌，通过使其响应汞离子，表达绿色荧光蛋白，从而达到检测汞离子的作用。本发明的使用方法保留了微生物细胞传感器的快速的优点，同时弥补了其易受干扰的缺点，提高了样品检测的准确性。

本发明实现了样品需求量少、检测时间短、灵敏度高，检测范围广等特点，便于携带和野外检测，成本低廉，可批量生产。并且，在一定范围的汞离子范围内，本发明可实现肉眼检测，将可进一步使用在野外的检测环境下，给传统环境检测带来变革。

本发明的微生物荧光传感器，其特征在于，包括大肠杆菌dh5α，大肠杆菌作为宿主细胞承载重组质粒。

所述的重组质粒是由含有汞抵抗系统mer启动子、汞抵抗系统调控基因merr、绿色荧光蛋白基因egfp和组成型启动子串联序列的pentr质粒。

构建该微生物荧光传感器的具体操作步骤为：

1.组成型启动子、merr基因和pmer导入pegfp质粒

组成型启动子和pmert、merr基因和egfp报告基因由公司合成。在本发明的重组质粒中，利用bglii和hindiii酶向包含egfp报告基因的pmbg的插入合成的基因和启动子，调控蛋白基因merr由组成型启动子控制，egfp基因由特异性启动子pmert控制。

所述的新型微生物传感器的使用方法，包括工程菌株的制备方法、菌种复苏方法以及检测方法。

2.重组质粒的转化

感受态大肠杆菌从-80℃冰箱中取出，置于冰盒中，加入10μl重组质粒。将大肠杆菌置于冰盒中5min后，放入42℃水浴90s。取出感受态加入200μllb培养基后，在37℃摇床中生长40min。将转化后的大肠杆菌涂布在加入卡那霉素的固体lb培养基上，过夜培养。取阳性菌落进行菌落pcr，测序验证。得到检测汞离子的微生物荧光传感器。

所述的检测样品的前处理方法，其特征在于，可快速简单的去除样品中的杂质，不影响样品中汞离子的含量，帮助汞离子微生物传感器实现准确的检测。

附图说明

图1重组质粒图谱；

图2相对荧光强度与不同浓度hg2+在不同检测条件下的关系曲线；

图3相对荧光强度与不同浓度hg2+在不同抗生素浓度下的关系曲线；

图4相对荧光强度与牛奶和超纯水中不同浓度hg2+的关系曲线。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：新型的检测汞离子的微生物荧光传感器的性能检测

第一步：接种传感器细胞单菌落于50ml盛有lb培养基的三角瓶中，添加卡那霉素到终浓度为50μg/ml，37℃，200rpm过夜培养；

第二步：取1ml的上述菌液到20ml的新鲜lb培养基中，37℃，200rpm培养至od600＝0.6；

第三步：取5ml菌液，5ml新鲜lb培养基，与100μl汞标准溶液混合，37℃，200rpm诱导2h；

第四步：取2ml上述诱导后的菌液于2ml离心管中，12000g离心2min，加入200μl0.9％生理盐水，吹打涡旋；

第五步：取全黑底透96孔板，向其中加入诱导原液和浓缩液各200μl，使用酶标仪进行检测；

第六步：根据标准样品诱导下传感器细胞的相对荧光强度，制作相对荧光强度和汞离子浓度的标准曲线。

实施例2：新型的检测汞离子的微生物荧光传感器对含汞牛奶标准样品的检测

第一步：接种传感器细胞单菌落于50ml盛有lb培养基的三角瓶中，添加卡那霉素到终浓度为50μg/ml，37℃，200rpm过夜培养；

第二步：取1ml的上述菌液到20ml的新鲜lb培养基中，37℃，200rpm培养至od600＝0.6；

第三步：取待测牛奶样品，12000g离心5min，取分离后的牛奶溶液，待用；

第四步：取5ml菌液，5ml新鲜lb培养基，分别与100μl汞标准溶液、待测牛奶样品混合，37℃，200rpm诱导2h；

第五步：取2ml上述诱导后的菌液于2ml离心管中，12000g离心2min，加入200μl0.9％生理盐水，吹打涡旋；

第六步：取全黑底透96孔板，向其中加入诱导原液和浓缩液各200μl，使用酶标仪进行检测；

第七步：根据标准样品诱导下传感器细胞的相对荧光强度，制作相对荧光强度和汞离子浓度的标准曲线，利用标准曲线计算牛奶样品中的汞离子浓度。

序列表

<110>中国农业大学

<120>一种用于汞离子检测的核酸蛋白复合物变构型微生物全细胞传感器的构建及其应用

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<213>人工序列(artificialsequence)

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