新大肠杆菌表达系统的制作方法

本发明涉及新大肠杆菌表达系统，属于基因工程领域。

背景技术：

在大肠杆菌中为了选择和维持重组质粒，常用抗生素抗性基因作为标记物。然而，抗生素耐药基因的水平转移可导致多药耐药生物的出现。因此，几种维持质粒而不添加抗生素的方法被开发出来。第一种是fabv-三氯生系统，其中三氯生用于维持质粒，但有研究表明它可能有助于细菌耐药性的增加。第二种是基于毒素/抗毒素的系统，该系统中的质粒由毒素和抗毒素之间的平衡维持，这些毒素和抗毒素分别在基因组和质粒中表达；但是，该系统在长时间细胞培养过程中无效。第三种是避免添加抗生素的方法是从染色体中去除一个必需的基因，并将其包含在质粒中。例如，大肠杆菌中的必需基因glya已从染色体上移除并插入到表达载体中，但在含甘氨酸的培养基中生长时，表达载体可能丢失。必需基因tpia编码磷酸三糖异构酶，对embden-meyerhof-parnas途径的关键步骤进行催化。有研究将基因tpia已从染色体上移除并插入到表达载体中，但tpia的高表达可能影响细胞内代谢。大肠杆菌中必需基因dapd的启动子已被lac启动子取代，因此，它与含有laco位点的质粒共同消除对laci的抑制作用。但这种重组菌株必须在规定的培养基中生长。

必需基因lpxa，与基因lpxb、lpxd和fabz位于同一操纵子中，编码对脂质a生物合成途径中的第一反应进行催化的udp-n-乙酰葡萄糖胺乙酰转移酶。一般来说，细胞分裂和存活需要lpxa以及lpxa的过度表达对细胞生长没有影响。本发明以大肠杆菌为载体，建立了大肠杆菌lpxa缺失突变株，并利用该系统提高大肠杆菌l-苏氨酸的产量。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一种大肠杆菌表达系统，含有缺失lpxa的大肠杆菌及携带seqidno.1所示基因的质粒。

在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌的出发菌株包括但不限于e.colibl21、e.colibl21(de3)、e.colijm109、e.colidh5α、e.colitop10、e.colimg1655、e.colitwf006中的任一种。

本发明的第二个目的是提供一种表达载体，携带seqidno.1所示基因。

本发明的第三个目的是提供所述大肠杆菌表达系统在表达目的基因方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是将目的基因与所述质粒连接，并在所述缺失lpxa的大肠杆菌中表达。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为prsfcmlpxa。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将目的基因与所述载体连接，转入至敲除了lpxa的大肠杆菌中。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将目的基因与所述载体连接，在转入宿主细胞的同时，将宿主细胞基因组上的lpxa基因敲除。

在本发明的一种实施方式中，所述目的基因是编码目的产物的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述lpxa基因敲除是采用pcas9cre和ptf-a-ud进行敲除。

本发明的第四个目的是提供应用上述任一所述方法构建的基因工程菌。

本发明还要求保护所述方法在发酵生产有机酸、蛋白质、氨基酸、多糖等方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是用于构建产l-苏氨酸的大肠杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是将l-苏氨酸合成关键基因thra、thrb和thrc及l-苏氨酸输出基因rhta与prsfcmlpxa连接，转化至敲除了lpxa的大肠杆菌mg1655中，获得大肠杆菌mg1655△lpxa/prsflpxa-thrabc-rhta，并以大肠杆菌mg1655△lpxa/prsflpxa-thrabc-rhta为发酵微生物，发酵生产l-苏氨酸。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是将l-苏氨酸合成关键基因thra、thrb和thrc及l-苏氨酸输出基因rhta与prsfcmlpxa连接，转化至敲除了lpxa的大肠杆菌twf006中，获得大肠杆菌twf006△lpxa/prsflpxa-thrabc-rhta，并以大肠杆菌twf006△lpxa/prsflpxa-thrabc-rhta为发酵微生物，发酵生产l-苏氨酸。

有益效果：本研究开发了一种新的大肠杆菌表达系统，即lpxa缺失突变体含有一个携带lpxa突变基因的载体。为了开发该系统，构建了三个质粒pcas9cre,ptf-a-ud,和prsfcmlpxa。质粒pcas9cre拥有酶cas9、λ-red重组系统和酶cre，可在42℃生长去除；ptf-a-ud含有敲除染色体lpxa所需的几个dna片段，可通过添加异丙基硫代半乳糖苷去除；prsfcmlpxa含有lpxa突变体lpxa123和氯霉素抗性基因camr。当大肠杆菌用这三种质粒转化时，可以有效地去除菌株染色体lpxa和质粒prsfcmlpxa上camr，从而产生含有prsflpxa的大肠杆菌lpxa突变体。lpxa对大肠杆菌的生长是必不可少的，它从染色体迁移到组成表达载体是维持载体不添加抗生素的理想策略。prsflpxa中的lpxa123可以补充染色体lpxa的缺失，并提供维持质粒prsflpxa的强选择性压力。本发明以产l-苏氨酸为例，验证了所述表达系统在野生型大肠杆菌mg1655和大肠杆菌twf006产l-苏氨酸方面的用途，有助于为其它发酵产物的生物合成提供参考。

附图说明

图1为本发明的表达系统；(a)三种质粒pcas9cre,ptf-a-ud,和prsfcmlpxa的图谱；(b)表达系统在大肠杆菌中的应用示意图；(c)mg16551655△lpxa中表达质粒prsflpxa的稳定性研究；(d)mg1655/prsfcm、mg1655/prsfcmlpxa、mg1655△lpxa/prsfcmlpxa和mg1655△lpxa/prsflpxa细胞生长曲线的比较。

具体实施方式

(1)lb培养基：10g·l^-1蛋白胨，10g·l^-1氯化钠，5g·l^-1酵母粉，lb固体培养基需另加16g·l^-1琼脂粉。灭菌条件：121℃，20min。该培养基主要用于大肠杆菌的基础培养，同时也用作摇瓶发酵时的种子培养基。

(2)摇瓶发酵培养基：30.0g·l^-1葡萄糖，2.0g·l^-1酵母粉，25.0g·l^-1(nh4)2so4，2.0g·l^-1柠檬酸，7.46g·l^-1kh2po4，2.0g·l^-1mgso4·7h2o,5mg·l^-1，feso4·7h2o，5mg·l^-1mnso4·4h2o，20g·l^-1caco3，ph6.8。灭菌条件为115℃，15min。

在培养和筛选过程中根据需要添加诱导剂或抗生素：异丙基硫代半乳糖苷(iptg：0.5mmol·l^-1)，阿拉伯糖(30mmol·l^-1)，三氯生(100mg·l^-1)，卡那霉素(50mg·l^-1)，壮观霉素(50mg·l^-1)。

表1具体实施方式中所涉及的引物

实施例1：质粒系统构建

ptf-a123的构建方法为：以大肠杆菌mg1655为模板，通过引物lpxa3-f/lpxaa-r扩增并使用sgrna3-f/sgrna3-r突变得到lpxa123基因(seqidno.1所示)，再lpxa123基因插入ptargetf。

质粒pcas9cre(公开于论文《multigeneeditingintheescherichiacoligenomeviathecrispr-cas9system》中)，是在pcas9的基础上，将cre插入bglii位点；cre是通过引物cre-f2和cre-r，从pkd-cre中扩增出cre片段，然后再使用引物cre-f1和cre-r进行扩增，得到pcas9cre。

质粒prsfcmlpxa由多个步骤构建：首先，用引物a-cmr-f和a-cmr-r从pacycduet-1中扩增出cmr序列，用引物a-rsf-f和a-rsf-r,从prsfduet-1中扩增出rsf-ori序列，将它们连接在一起形成质粒prsf1。其次，将引物对pj23119a-f/pj23119a-r(bglii,saliandecorv)、pj23119b-f/pj23119b-r(ecorv,bamhi和ncoi)、terminator-f/terminator-r(ncoi和ecori)和pampr-f/pampr-r(ecori,saci和psti)一起退火并插入prsf1中，形成质粒prsf2。第三，将引物对loxple-f/loxple-r(smai和xhoi)和loxpre-f/loxpre-r(hindiiiandpsti))退火，连接到prsf2，形成质粒prsfcm。最后，用引物lpxa-f/lpxa-r从ptf-a123中扩增lpxa123序列，并连接到prsfcm中，得到质粒prsfcmlxpa。

质粒ptf-a-ud是在ptf-a123的基础上去除lpxa123并插入lpxa-ud片段。具体步骤为：通过pcr，利用引物m-lpxa123-f和m-lpxa123-r去除lpxa123，用引物lpxa-u-f和lpxa-u-r，以mg1655基因组为模板扩增得到lpxa上游片段lpxa-u，用引物lpxa-d-f和lpxa-d-r，以mg1655基因组为模板扩增得到lpxa下游片段lpxa-d，然后以片段lpxa-u与片段lpxa-d为模板用重叠pcr技术连接两片段，最后加入引物a-lpxa-ud-f和a-lpxa-ud-r，扩增得到lpxa-ud片段并连接到saci位点，构建获得ptf-a-ud。

实施例2：突变株的获得

将80ul大肠杆菌电转感受态细胞(培养至od600＝5)与500ngpcas9cre、500ngprsfcmlpxa和500ngptf-a-ud混合，转移到预冷的电穿孔试管中，在冰上孵育30分钟。使用基因脉冲电穿孔系统将混合物点击两次(2.2kv，3.4ms)，然后立即与加入10mm阿拉伯糖额1ml培养基混合，30℃孵育2h。然后转入含有50mg/l卡那霉素和50mg/l大观霉素的5mllb试管培养基中，30℃孵育4h。再取10ul培养基转入含有50mg/l卡那霉素和0.5mmiptg的5mllb试管培养基中，30℃孵育4h。然后将10ul培养液移入含有0.5mmiptg的5mllb试管培养基中，42℃孵育4h。将细胞培液涂布在lb板上，37℃孵育过夜。利用引物lpxa-final-f和lpxa-d-r，通过pcr验证了正确的转化体。

实施例3：野生型大肠杆菌mg1655的l-苏氨酸的生物合成

该表达系统用于提高野生型大肠杆菌mg1655菌株的l-苏氨酸产量。将l-苏氨酸合成关键基因thra(序列如seqidno.2所示)、thrb(序列如seqidno.3所示)和thrc(序列如seqidno.4所示)及l-苏氨酸输出基因rhta(序列如seqidno.5所示)分别插入到prsfcm和prsfcmlpxa中，得到质粒prsfcm-thrabc-rhta和prsfcmlpxa-thrabc-rhta。这些质粒转化至大肠杆菌菌株mg1655，分别产生mg1655/prsfcm、mg1655/prsfcmlpxa、mg1655/prsfcm-thrabc-rhta、mg1655/prsfcmlpxa-thrabc-rhta、mg1655△lpxa/prsfcmlpxa、mg1655△lpxa/prsflpxa-thrabc-rhta。

以mg1655/prsfcmlpxa、mg1655△lpxa/prsfcmlpxa、mg1655/prsfcm-thrabc-rhta、mg1655/prsfcmlpxa-thrabc-rhta、mg1655△lpxa/prsfcmlpxa--thrabc-rhta和mg1655△lpxa/prsfcmlpxa-thrabc-rhta为对照，比较mg1655/prsfcm--thrabc-rhta、mg1655/prsfcmlpxa-thrabc-rhta的生长和l-苏氨酸的产量，36小时后，mg1655/prsfcmlpxa、mg1655/prsfcmlpxa、mg1655△lpxa/prsfcmlpxa、mg1655/prsfcm-thrabc-rhta、mg1655/prsfcmlpxa-thrabc-rhta、mg1655△lpxa/prsfcmlpxa-thrabc-rhta和mg1655△lpxa/prsfcmlpxa-thrabc-rhta的od600分别为5.63、6.12、6.02、5.18、5.70、6.40和6.46。这表明，无论是在质粒中lpxa的过度表达，还是lpxa从染色体转移到质粒，都会轻微增加大肠杆菌的细胞生长。mg1655/prsfcm、mg1655/prsfcmlpxa、mg1655△lpxa/prsfcmlpxa、mg1655/prsfcm-thrabc-rhta、mg1655/prsfcmlpxa-thrabc-rhta、mg1655△lpxa/prsfcmlpxa-thrabc-rhta和mg1655△lpxa/prsflpxa-thrabc-rhta的l-苏氨酸产量分别为0.071、0.077、0.076、0.134、0.113、0.136和0.149g/l。这表明基因簇thrabc，rhta的表达，而不是基因lpxa的表达，在这些大肠杆菌mg1655重组菌株中起到了促进l-苏氨酸产生的重要作用。

实施例4：产l-苏氨酸大肠杆菌twf006的l-苏氨酸的生物合成

该表达系统用于提高野生型大肠杆菌twf006菌株的l-苏氨酸产量。将l-苏氨酸合成关键基因thra、thrb和thrc及l-苏氨酸输出基因rhta分别插入到prsfcm和prsfcmlpxa中，得到质粒prsfcm-thrabc-rhta和prsfcmlpxa-thrabc-rhta。这些质粒转化至大肠杆菌菌株twf006，分别产生twf006/prsfcm、twf006/prsfcmlpxa、twf006/prsfcm-thrabc-rhta、twf006/prsfcmlpxa-thrabc-rhta、twf006△lpxa/prsfcmlpxa、twf006△lpxa/prsflpxa-thrabc-rhta。以twf006/prsfcmlpxa、twf006△lpxa/prsfcmlpxa、twf006/prsfcm-thrabc-rhta、twf006/prsfcmlpxa-thrabc-rhta、twf006△lpxa/prsfcmlpxa--thrabc-rhta和twf006△lpxa/prsfcmlpxa-thrabc-rhta为对照，分析了twf006/prsfcm--thrabc-rhta、twf006/prsfcmlpxa-thrabc-rhta的生长和l-苏氨酸的产量，36小时后，twf006/prsfcmlpxa、twf006/prsfcmlpxa、twf006△lpxa/prsfcmlpxa、twf006/prsfcm-thrabc-rhta、twf006/prsfcmlpxa-thrabc-rhta、twf006△lpxa/prsfcmlpxa-thrabc-rhta和twf006△lpxa/prsfcmlpxa-thrabc-rhta的od600分别为17.58,17.81,17.31,16.89,17.88,18.19和18.92。twf006/prsfcm、twf006/prsfcmlpxa、twf006△lpxa/prsfcmlpxa、twf006/prsfcm-thrabc-rhta、twf006/prsfcmlpxa-thrabc-rhta、twf006△lpxa/prsfcmlpxa-thrabc-rhta和twf006△lpxa/prsflpxa-thrabc-rhta的l-苏氨酸产量分别为10.44,10.89,10.67,13.10,13.08,13.32和13.75g/l。这再次证明，无论是在质粒中过度表达lpxa，还是lpxa从染色体转移到质粒，都不会影响大肠杆菌的细胞生长，基因簇thrabc，rhta的表达，而不是基因lpxa的表达，在这些大肠杆菌重组菌株中起到了促进l-苏氨酸产生的重要作用。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

sequencelisting

<110>江南大学

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