一种水稻纹枯病菌致病相关基因及其应用的制作方法

文档序号：18941625发布日期：2019-10-23 01:11阅读：287来源：国知局

本发明属于生物防治技术领域。更具体地，涉及一种水稻纹枯病菌致病相关基因及其应用。

背景技术：

水稻纹枯病是世界性的水稻三大病害之一，给水稻生产造成了严重的经济损失。目前该病在我国稻区普遍发生，田间一般发病率为20％～70％，严重时高达90％以上甚至绝收。水稻纹枯病菌(r.solaniag1-ia)是一种重要的腐生性土传病原真菌，该菌主要以菌丝和菌核的形式存在于土壤和病残体中。由于寄主范围广、腐生性强、缺乏高水平的抗源、接种鉴定操作困难等原因，目前能稳定高抗纹枯病的水稻品种比较少。

rnai是一种在小干扰rna(rnasmallinterferingrnas,sirnas)的指导下进行的一种同源mrna配对并发生降解的、非常保守的调节机制。rnai目前已经被广泛运用于植物保护领域，如植物抗病毒和害虫防治。病毒诱导基因沉默技术(virus-inducedgenesilencing)简称vigs技术，基于同源rna互补结合降解的rnai原理，是利用植物对病毒的天然防御机制发展的一种瞬时、快速鉴定植物基因功能的技术，是用基因序列验证基因功能的一种反向遗传学方法。然而该技术最大的核心依赖于筛选到精准、合适的水稻纹枯病菌致病相关基因。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有技术中的缺陷和不足，提供一种水稻纹枯病菌致病相关基因，得到该水稻纹枯病菌致病相关基因的沉默靶基因片段rstpp，以该片段为靶点可沉默致病相关基因，从而显著抑制水稻纹枯病菌的致病力。该水稻纹枯病菌致病相关基因及其沉默靶基因片段rstpp在抑制水稻纹枯病菌、制备水稻纹枯病菌抑制剂或构建抗水稻纹枯病菌转基因植物中具有广泛的应用前景。

本发明的第一个目的是提供一种水稻纹枯病菌致病相关基因。

本发明的第二个目的是提供一种水稻纹枯病菌致病相关基因编码蛋白。

本发明的第三个目的是提供所述水稻纹枯病菌致病相关基因的沉默靶基因片段rstpp。

本发明的第四个目的是提供所述水稻纹枯病菌致病相关基因或所述沉默靶基因片段rstpp在防治水稻纹枯病菌或制备水稻纹枯病菌防治产品中的应用。

本发明的第五个目的是提供所述水稻纹枯病菌致病相关基因或所述沉默靶基因片段rstpp在构建抗水稻纹枯病菌转基因植物中的应用。

本发明的第六个目的是提供一种水稻纹枯病菌防治制剂。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明首先提供了一种水稻纹枯病菌致病相关基因，所述水稻纹枯病菌致病相关基因的全长cdna序列如seqidno：1所示，序列长度为3972bp。

所述水稻纹枯病菌致病相关基因的全长dna序列如seqidno：2所示，序列长度为5671bp，包含21个内含子，分别位于第824～138位、233～286位、431～486位、644～688位、739～792位、956～1010位、1064～1115位、1267～1397位、1606～1767位、1885～1926位、2414～2469位、2633～2724位、3012～3061位、3211～3266位、3434～3495位、3792～4085位、4332～4383位、4675～4726位、4804～4966位、5178～5236位、5309～5362位，剪切位置均符合“gt-ag法则”。

所述水稻纹枯病菌致病相关基因的编码序列如seqidno：3所示，序列长度为3972bp。

所述水稻纹枯病菌致病相关基因编码蛋白的氨基酸序列如seqidno：4所示，共为1323个氨基酸，蛋白分子量为144.73kda。

本发明还提供了所述水稻纹枯病菌致病相关基因的沉默靶基因片段rstpp，其dna序列如seqidno：5所示，序列长度为310bp。

所述沉默靶基因片段rstpp是水稻纹枯病菌与致病力有关的基因片段，在水稻纹枯病菌侵染水稻过程的早期显著上调。

另外，所述水稻纹枯病菌致病相关基因或所述沉默靶基因片段rstpp在防治水稻纹枯病菌或制备水稻纹枯病菌防治产品中的应用，以及在构建抗水稻纹枯病菌转基因植物中的应用，均应在本发明的保护范围之内。

优选地，所述构建抗水稻纹枯病菌转基因植物的方法为：将所述沉默靶基因片段rstpp构建到载体中，然后将该载体转化至植物中，获得抗水稻纹枯病菌转基因植物。

更优选地，所述转基因植物为烟草、水稻或十字花科蔬菜中的任意一种或几种。

本发明还提供了一种水稻纹枯病菌防治制剂，含有可抑制所述水稻纹枯病菌致病相关基因表达的物质。

优选地，含有可靶向所述沉默靶基因片段rstpp从而抑制所述水稻纹枯病菌致病相关基因表达的物质；优选地，所述物质为dsrna或包含该dsrna的重组载体或重组菌。

优选地，所述dsrna的核酸序列如seqidno：6所示。

优选地，所述重组载体为trv2-rstpp载体。

根据本发明提供的水稻纹枯病菌致病相关基因的沉默靶基因片段rstpp，本领域技术人员可以通过以下方法获得与该基因等同的基因：(1)通过数据库检索获得；(2)以沉默靶基因片段rstpp为探针，筛选其它丝核菌基因组文库或cdna文库获得；(3)根据沉默靶基因片段rstpp的序列信息设计寡核苷酸引物，用pcr扩增的方法从丝核菌或其它近缘真菌的基因组、mrna和cdna中获取；(4)在沉默靶基因片段rstpp的基础上，用基因工程方法改造获得；(5)用化学合成的方法获得。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种水稻纹枯病菌致病相关基因及其应用。本发明首先提供了一种水稻纹枯病菌致病相关基因，该水稻纹枯病菌致病相关基因的沉默靶基因片段rstpp在水稻纹枯病菌侵染水稻过程前期被显著诱导表达，以该片段为靶点可沉默致病相关基因从而显著抑制水稻纹枯病菌的致病力。

本发明还提供了一种水稻纹枯病菌防治制剂，含有可抑制水稻纹枯病菌致病相关基因表达的物质；其中，高效沉默靶基因片段rstpp的dsrna能够显著抑制水稻纹枯病菌菌丝的生长，降低水稻纹枯病菌的致病力；基于此，本发明还提供了以dsrna构建得到的重组载体，该重组载体可转化至植物，所得转基因植物受水稻纹枯病菌侵害时，对水稻纹枯病菌具有显著的抗病性。因此，本发明的水稻纹枯病菌致病相关基因及其沉默靶基因片段rstpp在防治水稻纹枯病菌或制备水稻纹枯病菌防治产品，以及在构建抗水稻纹枯病菌转基因植物中，均具有广泛的应用前景。

另外，本发明获得的水稻纹枯病菌致病相关基因是土传真菌病害的致病关键基因，利用该基因构建得到抗水稻纹枯病菌转基因植物品种，可以解决生产上土传真菌病害的难题，有效地防控土传真菌病害，具有重要的推广应用价值。

附图说明

图1是水稻纹枯病菌致病相关基因的沉默靶基因片段rstpp的扩增结果图。

图2是水稻纹枯病菌致病相关基因的沉默靶基因片段rstpp在水稻纹枯病菌侵染水稻过程中的基因表达分析结果图。

图3是水稻纹枯病菌致病相关基因的沉默靶基因片段rstpp转录得到的dsrna对水稻纹枯病菌菌丝生长抑制分析结果图。

图4是vigs载体信息图。

图5是构建得到的trv2-rstpp载体图谱。

图6是trv2-rstpp载体转化至根癌农杆菌gv3101的菌落验证结果图。

图7是烟草体内真菌生物量分析结果图。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1水稻纹枯病菌致病相关基因及其沉默靶基因片段rstpp的克隆

1、实验方法

s1.水稻纹枯病菌rna的提取

水稻纹枯病菌rna的提取使用takara总rna提取试剂盒(货号9769)，具体实验步骤如下：

称取0.1g水稻纹枯病菌菌丝于液氮中迅速研磨成粉末，加入到含有bufferrl裂解液的1.5ml灭菌离心管中，将裂解液12,000rpm，4℃离心5min。将上清液小心吸取到新的1.5ml灭菌离心管中。加入样品裂解步骤中上清液1/2体积的无水乙醇，立即将混合液(含沉淀)全部转入到rnaspincolumn(含2mlcollectiontube)中。12,000rpm，离心1min，弃滤液。依次将500μl的bufferrwa，600μl的rwb缓冲液，600μl的bufferrwb加入至rnaspincolumn中，12,000rpm离心30s，弃滤液。然后空管12,000rpm离心1min。将rnaspincolumn安置于1.5ml的无rnase酶收集管，在rnaspincolumn膜中央处加入50～200μl的无rnase酶水(65℃预热)，室温静置5min。12,000rpm离心2min洗脱rna。

s2.cdna第一链的合成

以步骤s1得到的水稻纹枯病菌的总rna为模板，利用tarakaprimescript反转录试剂盒(货号6210a)合成cdna，具体实验步骤如下：

在微量离心管中加入2000ngtotalrna、1μloligodt、1μldntp(10mm)、补充无rnase酶水至10μl。轻轻混匀，离心数秒后，65℃保温5min，冰上迅速冷却。依次加入4μl5×primescriptiibuffer、0.5μlrnaseinhibitor(40u/μl)、1μlprimescriptiirtase(200u/μl)、补充无rnase酶水至20μl，缓慢混匀。42℃保温50min，95℃保温5min(酶失活)，冰上冷却后-20℃保存备用。

s3.cdna靶标克隆

以步骤s2得到的水稻纹枯病菌cdna为模板，设计沉默靶基因片段rstpp克隆引物4214f/4214r(如seqidno：7～8所示)，使用擎科(货号tp001)高保真聚合酶，进行pcr扩增反应。反应条件为：98℃，2min；98℃，10s，58℃，15s，40个循环；最后72℃，10min。

引物4214f(seqidno：7)：acgctgctgatgacggaa；

引物4214r(seqidno：8)：agacggctaacgatgggtaa。

然后，使用tae缓冲液制作1.0％的琼脂糖凝胶，将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳。使用axygenpcr纯化试剂盒进行pcr产物纯化、测序。

2、实验结果

水稻纹枯病菌致病相关基因的全长cdna序列如seqidno：1所示，其全长dna序列如seqidno：2所示，其编码序列如seqidno：3所示，其氨基酸序列如seqidno：4所示；水稻纹枯病菌致病相关基因的沉默靶基因片段rstpp的扩增结果如图1所示，可以看出，应用沉默靶基因片段rstpp克隆引物4214f/4214r，可以扩增出单一、明亮的条带。经过序列对比，将该基因归于海藻糖-6-磷酸磷酸酶基因家族，因此命名为水稻纹枯病菌海藻糖-6-磷酸磷酸酶基因。

水稻纹枯病菌致病相关基因的沉默靶基因片段rstpp的dna序列如seqidno：5所示；dsrna的核酸序列如seqidno：6所示。

实施例2水稻纹枯病菌致病相关基因的沉默靶基因片段rstpp在水稻纹枯病菌侵染水稻过程中的表达分析

s1.水稻纹枯病菌接种体的制备

首先使用pda平板将本实验室保存的水稻纹枯病菌菌株gd118活化，黑暗条件下，28℃培养2d。同时将水稻谷粒浸泡24h后放入250ml锥形瓶中，121℃，30min，高压蒸汽灭菌。将灭菌后的谷粒均匀平铺在培养2d后的pda平板上，黑暗条件下，28℃培养7d至谷粒表面布满菌丝及菌核，即可用于接种。

s2.水稻的种植和水稻纹枯病菌的接种

分别使用10％的次氯酸钠、30％的双氧水对水稻种子(中抗品种9311)进行消毒，再将种子置于无菌培养皿内，使用无菌水浸泡3d以上直至发芽，然后将发芽的种子转移至含有10cm厚无菌土的方盆(长：80cm；宽：40cm；高：15cm)内。接种选择水稻三叶一心期，在盆内无水干燥条件下，使用步骤s1制备得到的接种体进行接种，在水稻茎基部放置两枚接种体，温度30℃、湿度90％以上利于发病。

s3.样品的荧光定量pcr分析

为了验证不同基因在水稻纹枯病菌侵染水稻过程中的表达量，选取了接种后的6个时间点10h，18h，24h，32h，48h，72h后，收集活体接种的水稻茎基部作为样品。使用takaraminibestplantrnaextractionkit(货号9769)进行不同时间的水稻样品总rna的提取，具体方法同“实施例1的步骤s1”。利用tarakaprimescript反转录试剂盒(货号6210a)进行rna反转录，具体方法同“实施例1的步骤s2”，将反转录所得的cdna产物稀释10倍后，作为模板，利用primerpremier5.0软件设计扩增沉默靶基因片段rstpp的荧光定量pcr引物f/r(如seqidno：9～10所示)，进行实时荧光定量pcr。

引物f(seqidno：9)：caccttggtcacttcaagca；

引物r(seqidno：10)：ccacctatgcaagggctgt。

引物的特异性通过凝胶电泳、测序和溶解曲线检验。荧光定量pcr反应体系为20μl，包含10μlbio-radcfxreal-timepcrsystem、0.2μm上/下游引物、2μlcdna模板和适量的纯水。每个样品进行三次技术重复。

水稻纹枯病菌的内参基因使用gapdh进行样品间的基因表达的均一化处理，应用引物gapdhf/gapdhr(如seqidno：11～12所示)，结果采用2^-δδct法进行分析。

引物gapdhf(seqidno：11)：ggtcggcaaagtcataccat；

引物gapdhr(seqidno：12)：tctgcgtccttcttggagata。

2、实验结果

水稻纹枯病菌致病相关基因的沉默靶基因片段rstpp在水稻纹枯病菌侵染水稻过程中的基因表达分析结果如图2所示，可以看出，沉默靶基因片段rstpp在水稻纹枯病菌侵染水稻的过程前期被诱导表达，在侵染后第18h时的表达量最高。

实施例3水稻纹枯病菌致病相关基因的沉默靶基因片段rstpp双链rna的合成和抑菌实验

1、实验方法

s1.沉默靶基因片段rstpp双链rna的体外合成

使用t7rnapolymerase(thermofisherscientific,catalognumber:ep011)合成靶基因rstpp得双链rna(dsrna)。通过在任一扩增引物的5'末端添加t7启动子序列，可以使用pcr将t7rna聚合酶启动子添加到任何dna序列中。最小的t7rna聚合酶启动子序列是：5'-taatacgactcactatagg-3'。在上下游引物5'末端分别添加t7启动子序列，得到引物t7-4214f/t7-4214r(如seqidno：13～14所示)。

引物t7-4214f(seqidno：13)：taatacgactcactataggacgctgctgatgacggaa；

引物t7-4214r(seqidno：14)：taatacgactcactataggagacggctaacgatgggtaa。

以水稻纹枯病菌的cdna为模板进行pcr扩增，得到dsrna的模板，经过转录纯化后，得到沉默靶基因片段rstpp的dsrna。

s2.dsrna对水稻纹枯病菌的抑制分析

使用pdb培养基培养水稻纹枯病菌菌株gd118的新鲜菌丝，取极少量新鲜菌丝与30μl步骤s1得到的dsrna(浓度为800ng/μl)孵育12h后，转移至1/4营养浓度的pda平板上，28℃条件下黑暗培养36h，测量培养基上单个菌落直径，同时使用不含dsrna的无菌水作为阴性对照。每次处理重复三次，实验重复三次。

2、实验结果

水稻纹枯病菌致病相关基因的沉默靶基因片段rstpp转录得到的dsrna对水稻纹枯病菌菌丝生长抑制分析结果如图3所示，可以看出，与不接种dsrna相比，接种dsrna时的水稻纹枯病菌菌落直径显著减小；说明沉默靶基因片段rstpp的dsrna可显著抑制水稻纹枯病菌的生长。

实施例4trv2-rstpp载体构建和转化烟草研究

1、实验方法

s1.trv2-rstpp载体构建及农杆菌转化

根据水稻纹枯病菌致病相关基因的编码序列，设计引物两端包含ecori和bamhi酶切位点的特异性引物vigs-4214f/vigs-4214r(如seqidno：15～16所示)。

引物vigs-4214f(seqidno：15)：ccggaattcacgctgctgatgacggaa；

引物vigs-4214r(seqidno：16)：cgcggatccagacggctaacgatgggtaa。

以水稻纹枯病菌cdna为模板，利用擎科(货号tp001)高保真酶进行pcr扩增，将扩增产物回收后，和载体pyl156同时在37℃下双酶切5h。将酶切后的目的片段和载体利用t4dna连接酶，16℃过夜连接，将连接好的产物转化入e.coildh5α感受态，测序确定无误后，扩繁提取质粒，保存备用。

s2.根癌农杆菌感受态的制备及电击转化

将根癌农杆菌单菌落接于4ml含rif(25μg/ml)的lb液体培养基中，28℃，200r/min振荡培养2d。取培养液3ml的接种量转接至200mllb培养液中，200r/min，28℃振荡培养至对数生长期(细胞浓度od600为0.5～0.6左右)。离心弃去废液，收集菌体。用预冷的无菌双蒸水将菌液重悬洗涤3次，后用2ml无菌预冷的10％(w/v)甘油重悬菌体。取100μl菌悬液于1.5ml离心管，于-70℃保存备用。加3μl质粒于菌液中，轻轻混匀并转移至无菌预冷的电击杯中，电击后迅速加入1mllb液体培养基，混匀并转移细胞至1.5ml的离心管中，在28℃摇床中200r/min培养2～3h；取100μl菌液涂布于含rif(25μg/ml)和kan(50μg/ml)的lb平板中，倒置放于28℃培养箱中培养2天，观察转化子生长情况，取未质粒dna的农杆菌在同样电击条件下的结果作为对照。挑取单菌落使用pyl156载体引物pyl156f/pyl156r进行pcr验证，载体引物pyl156f/pyl156r的序列如seqidno：17～18所示。

引物pyl156f(seqidno：17)：aattcactgggagatgatacgctg；

引物pyl156r(seqidno：18)：cctatggtaagacaatgagtcggc。

s3.农杆菌培养和烟草瞬时转化

农杆菌单克隆加入5ml的液体lb培养基(25μg/mlrif和50μg/mlkan)中，放于28℃摇床中进行200r/min过夜培养，将1ml菌液加入50mllb(25μg/mlrif和50μg/mlkan)中，放于28℃摇床中进行200r/min振荡培养。当培养物od600到0.5～0.6时，以6000rpm低温离心5min收集菌体，弃去废液。将菌体重悬于注射基质(10mmmes、10mmmgcl2、100μm乙酰丁香酮)中，使od600为0.8～1.0。把两种农杆菌菌株(trv1与trv2+靶基因片段)以1：1混合，室温静置3～5h，不要摇动。最后利用注射器将含有注射基质的农杆菌注射于最嫩的叶片中。

s4.烟草致病力检测和生物量测定

从注射后的第10天起，本氏烟草的白化现象就非常明显，这表明了在本氏烟草体内vigs载体已经产生出大量dsrna，并发挥着干扰作用。因此，我们选择了从注射vigs系列载体后的第10天，进行活体接种。对接菌后的第4天(post-inoculationday，dpi)、第5天和第6天进行本氏烟草的病情指数统计，通过统计叶片病斑和凋萎叶片的数量进行致病力的检测。提取接种水稻纹枯病菌8d后本氏烟草(转基因植物和阴性对照)中根茎(营养土以上0～3cm处)的总dna，以水稻纹枯病菌内部转录间隔区序列为靶标片段，设计特异性引物rsf/rsr(如seqidno：19～20所示)。同时，以烟草actin基因为内参基因，应用引物ef1a/ef1b(如seqidno：21～22所示)，具体方法同实施例2的步骤s3，结果采用2-δδct法进行分析。

引物rsf(seqidno：19)：gccttttctaccttaatttggcag；

引物rsr(seqidno：20)：gtgtgtaaattaagtagacagcaaatg；

引物ef1a(seqidno：21)：tggtgtcctcaagcctggtat；

引物ef1b(seqidno：22)：acgcttgagatccttaaccgc。

2、实验结果

vigs载体信息图如图4所示，构建得到的trv2-rstpp载体图谱如图5所示，trv2-rstpp载体转化至根癌农杆菌gv3101的菌落验证结果如图6所示，可以看出，扩增出单一、明亮的条带，说明trv2-rstpp载体已转化至根癌农杆菌gv3101。烟草体内真菌生物量分析结果如图7所示，可以看出，与未接种水稻纹枯病菌的烟草相比，接种水稻纹枯病菌时，烟草体内的真菌生物量显著降低。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>华南农业大学

<120>一种水稻纹枯病菌致病相关基因及其应用

<160>22

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>4014

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

atgccggttttgggtcacgtagctggcgaggttgtctttgccgaagttctggttactcca60

accggggtgagcaaaggctgcgggattgtggaattcagtacacatgaagaggctcagcgt120

gccattcgagacttatccgaaacgccacttctgggtcgccctatttttattcgtgaggac180

cgcgaatccgaagcccgattcggcgcaccatcggtacctggcaagatgggagctgcaatg240

gcgcacacagggtattctacccctcctccacgttcggcacttgcaggtaccaatcctggt300

aatcagctctatgtcggcaacttgccctaccaagcgggctggcaagacctcaaggacctt360

ttccgtactgccggcgccatcgttcgtgctgacattaacgttggctatgacggacgtcct420

aagggcagcggcaccgttatattcgagactgccaaggatgcgcaagcagctattcaaatg480

tacaacggatatgactggtacgggcggatcattgaggttcgtgaggaccgttacgctggt540

ctctcaggcggacgagggcgtggccgcggtcgtggctctgaccgtggtttccgtggcggc600

cgcggggggtatggcggtcgcggagggtatggtggcgtgtcaaatgccgatttatatgcc660

gattattctggtcctgaccagcaaatgggtggtggattcggtgcaatgcctgaacctagc720

caacaaattatggttcgcaacctcccttggtcgactctcaacgatgacctagtagaacta780

tttgagactactgggaatgtcgagcaggccgagattctctatgatggctcccgttccaag840

ggcgctggagttgtccagttctcgacagtagaggaagcagaaactgcgattggagaacga900

agggctaatcatcgcgggaatattagatgtgcgcttcaacgatcgatggcacgaattcac960

ttcctcctctgcgaagggcggtcaaacagcccttgcataggtgggcaacaggctgaatcg1020

ggagagaactggtcccatctacagtgcctctctcggttgtgcggaggatggttaagatcc1080

gtgtcagatgagttggatggcacgttcgtaaggttccggtccagcccgtatttacctgaa1140

tacgtacgggatgacgctgctgatgacggaaacggtaatccatcgattacattagtcgag1200

gcgccctaccagaataggcgcatatataaggtctaagcattcggtgttacaactccaaga1260

ccacgatcgagagaacttactctagcgatggacgacttttccgcatcgacacagaatcgg1320

aagcgcgagcccgctgggccggaatcgctcgaagatattcgcgcagccattgcaaacatc1380

gaggccgactaccgggcgaagggtgtcactctaagtggccgcatcgtgcacgcatgtcac1440

tacttacccatcgttagccgtctgaatactggcgagacaccaagagtcgaacgcagcggc1500

ctcgctacgcctccccgcacccccgattttttgccccgctctccagaacctgatgtcgta1560

tcccctggcccttctctcgacggagcgattctcgaccaggagaagagtgcgccccctcgc1620

tgggtactagcacctcgtcggggtcactcgactatgacctctggcatccgctccctgtct1680

gcaacacacgaacaattaattgttggatggactggggaattccgcagcattgcatctgac1740

gaaaagattgcaacaaactccgtgaccgatagcgaccgggcgttgctcgagacagaaatt1800

gaaagctacaagccatctgacgcagagaatccagaaaaaatcacctacaagcccgtgtgg1860

ctggacgacgcgatttctgcggggcactatgaaggatattgtaagactaacgttacttcc1920

gaaatccctgttaaagacgagggcttttcggcttacaaacaagcaaaccaagcatatgcc1980

aatgcaattcttgcgatcctcaaaccgggcgaccttgtttgggtccatgactaccattta2040

ctccttgttcctcgtatggttcgtaccggcgctccggaggcacacattggactttttgtc2100

catacacctttccccagtagtgaagtcttccgttgcctcccaaggagaaaggaaatctta2160

gatgggatgcttggcgccaatctggtctgcttccagacgtactcgtattctcgtcacttt2220

gcctccacttgcatcagggtttgtggatatgaagctgccccacttggtatcgatgtacat2280

ggagcgctagttgcaatctctcatagtcctgttggaattgacgctgttcgcgttgaacgg2340

gactctcaacgtcctggtattcagcccaaactccagtccctgcgctccatctatcaaggc2400

aagaagatcatcgttggtagggataaacttgatgcagtgaaaggcgtcgtccagaagctt2460

cgtgcttttgaaaaactcctgcaagactatcccgaatggatcggaaacgtggttacatct2520

cctgctctgactgattcccctaaacttgagcgtcaagtttcggaactggtagcccacata2580

aatggcgaatatggttcactcgactttattccggttcatcactatcaccaaacaattaag2640

aaagacgaattctacgcacttctttcggttgcagacctggcgctcatcacacccttgcgt2700

gacggaatgaacaccacttcaatggaattcgtcatctgccaacagcgcacggggaaaagc2760

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