飞蝗HMGR基因及其dsRNA在飞蝗防治中的应用的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，涉及飞蝗hmgr基因及其dsrna在飞蝗防治中的应用。
背景技术：
：飞蝗(locustamigratoria)喜食小麦、玉米等粮食作物，为迁飞性杂食性害虫，是我国乃至世界范围的重要农业害虫。目前，基于化学农药的害虫防治策略，导致害虫抗药性提高，用药量加大，防治成本提高；农药残留导致环境污染，农产品药物残留危害人类健康；现有的真菌微生物农药起效慢，杀虫效率低。因此，寻找替代化学农药和真菌微生物农药的可持续性、高效性飞蝗防治策略已迫在眉睫。rna干扰(rnainterference，rnai)是一种由小分子双链rna(doublestrandedrna，dsrna)引发的序列特异性转录后基因沉默现象，于2006年获得诺贝尔奖。rna干扰普遍存在于线虫、真菌、昆虫和动植物等多种生物中，具有高效、特异等特点，并渐渐成为一种潜在的害虫防治技术。基于rna干扰技术的害虫防治具有如下优势：1)特异性：dsrna只降解与其同源的mrna，降低了对非靶标生物的毒害效应，特别对高等动物和人类具有较高的安全性；2)高效性：少量的dsrna就能有效地抑制靶基因的表达，且dsrna进入害虫体内可引起全身甚至子代靶基因的沉默。3)安全性：rna在自然界极易降解，无残留，对生态环境和农作物产品无污染，相对安全。目前，基于rna干扰进行害虫防治的基础技术是筛选靶标序列获得具有高致死作用的dsrna。3-羟基-3-甲基戊二酰-coa还原酶(3-hydroxy-3-methylglutarylcoareductase,hmgr)是甲羟戊酸(mevalonate,mva)途径的限速酶，在其作用下，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a(hmg-coa)通过mva途径不可逆的生成mva，mva经焦磷酸化和脱羧作用形成5c的异戊烯基焦磷酸(ipp)，而ipp是萜类化合物合成的共同前体，因此hmgr是细胞质萜类化合物代谢中的重要调控点。萜类化合物，又称类异戊二烯，是一组结构各异且涉及细胞发育许多方面的化合物，在自然界中广泛分布。在昆虫中，由咽侧体分泌的保幼激素(juvenilehormone，jh)是一种倍半萜类化合物，为昆虫体内最为重要的激素之一，它既在昆虫幼虫到蛹或成虫的过程中抑制变态，保持幼虫特征，又在羽化后成虫阶段促进成虫生殖，对昆虫发育、变态与生殖均有重要调控作用。因此，hmgr在调控昆虫体内jh合成中起到关键作用，即hmgr能通过调控萜类前体的合成，控制昆虫jh生物合成原料的来源，进而影响昆虫的生长发育与生殖。因此，利用hmgr重要生物学功能作为害虫防治靶标，安全高效，可为飞蝗的防治提供新策略。技术实现要素：本发明目的在于提供一种飞蝗hmgr基因，可作为药物靶点，进行飞蝗防治。本发明另一目的在于提供基于上述飞蝗hmgr基因合成的dsrna，注射该dsrna至飞蝗体内，可使飞蝗致死，防控飞蝗爆发成灾。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：本发明提供一种飞蝗hmgr基因，其orf序列如seqidno：1所示，orf序列全长2742bp，编码913个氨基酸。本发明提供基于上述飞蝗hmgr基因合成的dsrna，其是由seqidno：9所示的正义链核苷酸序列和seqidno：9的反义链核苷酸序列组成的双链rna。本发明还提供用于合成所述dsrna的引物对，其核苷酸序列分别如seqidno：4和seqidno：5所示。本发明还提供编码所述dsrna的dna分子，其核苷酸序列为两端带有t7启动子的seqidno：6所示序列。本发明还提供含有用于合成所述dsrna的引物对的试剂盒。本发明还提供基于上述飞蝗hmgr基因合成的dsrna的合成方法，包括以下步骤：基于seqidno：1所示的hmgr基因序列，以提取的飞蝗整虫总rna反转录成的cdna为模板，利用seqidno：4和seqidno：5所示的上、下游引物进行pcr扩增，将seqidno：6所示的pcr扩增产物连接入pgem-t载体中获得重组质粒pgem–t–hmgr，再以重组质粒pgem–t–hmgr为模板，用如seqidno：7和seqidno：8所示的带有t7启动子序列的引物对进行pcr扩增得到用于合成dsrna的dna模板，然后以带有t7启动子序列的dna为模板，使用t7ribomaxtmexpressrnaisystem(promega)试剂盒体外转录合成dsrna。本发明还提供上述dsrna在飞蝗防治中的应用。相比现有技术，本发明的有益效果在于：经过多次实验表明，在飞蝗体内注射合成的dsrna能有效的抑制hmgr的基因表达，导致飞蝗无法顺利蜕皮进入下一个龄期，产生致死效应，并且dsrna使用剂量小(6μg)，起效快(处理3天后开始导致飞蝗大量致死)，致死率可达99％，效果显著。另外，用dsrna防治蝗虫，种属特异性强，不会对其他物种造成基因干扰；同时dsrna在自然环境中易降解，对生态环境友好。因此，鉴于本发明的高效性、特异性和安全性，在飞蝗害虫防治方面有广阔的应用前景，对保护我国农业生产、生态安全具有良好的经济效益。附图说明图1为4龄飞蝗注射合成的dsrna48小时后雌性飞蝗和雄性飞蝗中hmgr基因的表达水平分析，其中图1-a为雌虫的hmgr相对表达量，图1-b为雄虫的hmgr相对表达量，图中**p＜0.01，***p＜0.001。图2为4龄飞蝗注射合成的dsrna后存活率统计图。图3为4龄飞蝗注射合成的dsrna后的致死表型，其中3-a为对照组dsgfp的表型图，图3-b为dshmgr的处理组雌虫表型图，图3-c为dshmgr的处理组雄虫表型图。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限定本发明的保护范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例一：飞蝗hmgr基因的序列及其dsrna的获得1.飞蝗hmgr基因序列的获得1.1总rna提取选取生长健康的飞蝗雌雄成虫，提取整虫总rna，具体步骤如下：(1)在液氮中碾磨雌雄成虫整虫至粉末状，加入1mltrizol，剧烈震荡摇匀，室温静置20min，使组织充分裂解。(2)4℃，12000rpm离心5分钟，离心后用移液枪将中间清液的组织裂解液转移至新离心管中；(3)加入500μl氯仿，手动摇匀2分钟，冰浴5分钟，4℃，12000rpm离心15分钟；(4)取上清至新离心管中，加入500μl酸性酚氯仿溶液(sigma-aldrich)，充分混匀2分钟，冰浴5分钟，4℃，12000rpm离心10分钟；(5)取上清至新离心管，加入500μl的异丙醇上下颠倒至充分混匀，-20℃过夜沉淀；(6)4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清保留沉淀；(7)向沉淀中加入500μl75％的冰乙醇洗涤，4℃，12000rpm离心5分钟，弃上清，并重复洗涤一次；(8)在超净工作台中彻底吹干后加入适量的超纯水(rnasefree)溶解。使用1％的琼脂糖凝胶电泳检验rna的完整性，用nanodrop2000(thermofisher)测定rna的浓度。1.2反转录按照天根的fastkingcdna第一链合成试剂盒说明书，将上述所提总rna反转录成第一条cdna，操作如下：(1)取2μg总rna，补水至8μl，震荡混匀，pcr中65℃孵育5分钟，置于冰上；(2)冷却后，加入2μl5×gdnabuffer混匀后离心，pcr中42℃孵育3分钟，置于冰上；(3)配置如表1的反应体系，与(2)中处理好的rna混匀。表1总rna反转录成第一条cdna的反应体系组成成分体积(μl)10×fastrtbuffer2rtenzymemix1fq-rtprimermix1超纯水5总体积10反应条件为：42℃，pcr仪孵育15min，95℃孵育5min。1.3hmgr基因orf序列的获得根据已知昆虫的hmgr蛋白的序列信息，利用同源比对，在飞蝗转录组中进行搜索，获得飞蝗hmgr的转录本，进一步结合飞蝗基因组信息，拼接得到一条完整的飞蝗hmgr基因。采用primerpremier5.0软件设计上、下游引物序列(如seqidno：2和seqidno：3所示)并送往北京六合华大基因科技有限公司合成。pcr扩增hmgr基因的上、下游引物序列如下：hmgr-f(seqidno：2)：5’-atggcggcatcgcgagtgtt-3’；hmgr-r(seqidno：3)：5’-tcacgacttttcttcacttg-3’。以1.2步骤反转录成的cdna作为模板，结合如序列seqidno：2和seqidno：3所示的上、下游引物，通过pcr扩增获得hmgr基因的orf片段，将此片段送北京六合华大基因科技有限公司测序(后续所有引物合成和测序均在北京六合华大基因科技有限公司完成)，其orf序列如seqidno：1所示，orf序列全长2742bp，编码913个氨基酸。2.合成dsrna2.1扩增dsrna的dna模板基于hmgr基因序列seqidno：1，采用primerpremier5.0设计合成dshmgr的dna分子序列(如seqidno：9所示)的上、下游引物，引物序列分别如seqidno：4和seqidno：5所示。以步骤1.2反转录成的cdna为模板，利用如seqidno：4和seqidno：5所示的上、下游引物进行pcr扩增，反应体系如表2所示。dshmgr-f(seqidno：4)：5’-tccgctacttctgtctcttct-3’；dshmgr-r(seqidno：5)：5’-cacacactgttctaaacttcga-3’。表2以cdna为模板进行pcr扩增的反应体系组成成分体积(μl)10×taqbuffer2dntp(2.5mm)1.6dna模板1.5上游引物(10μm)0.8下游引物(10μm)0.8taqenzyme0.1超纯水13.2总体积20反应条件为：(1)95℃，5min；(2)95℃，30s；58℃，30s；72℃，2.5min；35个循环；(3)72℃延伸10min；4℃保存。将pcr扩增获得的单一产物连接入pgem-t(tiangen)载体中，获得重组质粒pgem–t–hmgr。测序结果表明，pcr扩增产物大小为549bp，其核苷酸序列如seqidno：6所示。以上述获得的重组质粒pgem–t–hmgr为模板，用带有t7启动子序列的引物对dshmgr-t7-f/dshmgr-t7-r(如seqidno：7和seqidno：8所示)进行pcr扩增，得到用于合成dsrna的dna模板(即两端带有t7启动子的seqidno：6所示序列)。pcr反应体系和条件同上(表2)。使用svgelandpcrclean-upsystem(promega)试剂盒纯化目的片段。nanodrop2000测浓度，并确定其浓度在125ng/μl-1mg/μl。合成dsrna的dna模板的上、下游引物序列为序列seqidno：4和序列seqidno：5的5’端加上t7启动子序列，具体如下(下划线标记t7启动子序列)：dshmgr-t7-f(seqidno：7)：5’-taatacgactcactataggtccgctacttctgtctcttct-3’；dshmgr-t7-r(seqidno：8)：5’-taatacgactcactataggcacacactgttctaaacttcga-3’。2.2dsrna的合成以步骤2.1获得的两端带有t7启动子序列的dna为模板，使用t7ribomaxtmexpressrnaisystem(promega)试剂盒体外转录合成dsrna。体外转录反应体系如表3所示。表3体外转录反应体系反应条件为：37℃，60min；70℃，10min；25℃，30min。2.3dsrna的纯化(1)向步骤2.2的反应体系里加160μlnuclease-free水和200μl酸性酚氯仿，充分混匀后放置冰上5min；(2)4℃，13000g离心10min，吸取上清液体放入新的1.5ml离心管；(3)向上清液体里加入0.1倍体积醋酸钠(3.0m，ph5.2)和2.5倍体积的无水乙醇，充分混匀后，放置冰上冰浴5min；(4)4℃，13000g离心10min，弃上清；(5)加入500μl预冷的75％乙醇，4℃，13000g离心10min，弃上清；(6)重复步骤(5)，75％乙醇再洗涤一遍；(7)放入超净工作台干燥20min，加入40μlnuclease-free水，放在冰上溶解20min，混匀，nanodrop2000测浓度，放入-20℃待用。将获得的dsrna进行测序。测序结果表明：飞蝗hmgr基因dsrna为双链rna，由正义链和反义链组成，其正义链的核苷酸序列如seqidno：9所示，其反义链的核苷酸序列为seqidno：9的反向互补序列。实施例二：飞蝗hmgr基因合成dsrna致死飞蝗实验1.飞蝗dsrna注射选取生长健康、大小一致的4龄0天飞蝗为实验材料，雌雄各半，随机分为dshmgr处理组和dsgfp对照组(因飞蝗体内没有绿色荧光蛋白gfp的基因，因此可将其作为阴性对照)，每组30头幼虫，包含雌虫15头，雄虫15头，重复3次，每组共注射90头幼虫。用10μl规格微量进样器将6μgdsrna从飞蝗腹部第三体节注入飞蝗体内。将注射后的飞蝗放置于通风良好的金属笼中(25cm×25cm×25cm)饲养，温度为30±2℃，光周期为14l:10d，饲喂新鲜的麦苗和麦麸，每天两次。注射后每半天观察并统计幼虫死亡率。2.hmgr基因干扰效率检测注射dsrna48h后，分别在dshmgr处理组和dsgfp对照组随机挑取雌虫5头，雄虫5头，以检测hmgr在雌虫和雄虫中的干扰效率。取整虫虫体研磨，然后分别提取总rna，并反转成第一条cdna，方法同实施例一。按照天根superreal荧光定量预混试剂增强版(sybrgreen)试剂盒(pf205)说明书方法，采用如seqidno：10、seqidno：11所示的hmgr上下游引物及如seqidno：12、seqidno：13所示的β-actin上下游引物，在lightcycler96(roche)上进行qrt-pcr反应，分别检测目的基因(hmgr)和内参基因(β-actin)的相对表达量，然后按照2-δδct法进行计算，分析基因沉默效率。结果如图1所示，与dsgfp对照组相比，无论在雌性飞蝗还是在雄性飞蝗中，dshmgr处理组的hmgr表达量均极显著降低，表明hmgr被有效沉默。qrt-pcr反应引物序列如下：hmgr-qrt-f(seqidno：10)：5’-taaaggagcgaatgaggaatc-3’；hmgr-qrt-r(seqidno：11)：5’-agagcagacatgagggagagtt-3’。β-actin-qrt-f(seqidno：12)：5’-aattaccattggtaacgagcgatt-3’；β-actin-qrt-r(seqidno：13)：5’-tgcttccatacccaggaatga-3’。qrt-pcr反应体系如表4所示。表4qrt-pcr反应体系反应条件为：(1)95℃预变性10min；(2)95℃，10s；58℃，30s；72℃，30s，共40个循环；(3)溶解曲线分析，95℃，60s；65℃，30s；95℃，30s。3.注射dsrna后飞蝗死亡率统计及表型观察4龄幼虫注射dsrna后，注射dsrna的dsgfp对照组5天后开始蜕皮并全部成功蜕皮进入5龄，且体态生命力正常，与正常发育的5龄幼虫无明显差异。注射dsrna的dshmgr处理组共60头，存活率统计结果如表5和图2所示，可以看出，飞蝗注射dsrna后，在第3天开始大量死亡，死亡率达50％，第4天死亡率超过90％，第5天几乎全部死亡，死亡率达99％。表型图如图3所示。由图3可以看出，dshmgr处理组注射dsrna后，幼虫因无法正常蜕皮，最终导致死亡。表5注射dsrna后飞蝗存活率统计结果以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本
技术领域：
的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理上所作的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。sequencelisting<110>河南大学<120>飞蝗hmgr基因及其dsrna在飞蝗防治中的应用<130>2019<160>13<170>patentinversion3.3<210>1<211>2742<212>dna<213>hmgr基因的orf序列<400>1atggcggcatcgcgagtgttcggcgcgcacggcgagctgtgcgccagccacccctgggag60gtgatcgtggccacgctgacgctggccatcagcatgctgacggtggagcagcgagccggc120ggcgccaccaggctgcccgtcgccgccgcagcagcctcccaggccgaggagtacagcgct180gccgccgacatgatcatgatgacggtcatccgctgcgtcgccgtgctgtactgctattac240cagttctgcaggctccacaagctgggctccaaatacattctcggtattgcaggactcttt300acagtcttctccagttttgtattcagcactagtgtcatcaatgttcttcacagtgacata360tctgatctcaaagatgctttatttttcttcctattgctgattgatctttctaaagcaagt420gctttagctcaattggccctaagtgccagcaacactgaagaagtgcgacgtaatattgct480cgtgggatggcaactctgggacctgccctcacactggatacacttgttgaggcacttgtt540attggtgttgggactctctcaggtgttcgcaggctggagatactgtgctgctttgcttgc600atgtctgttattgttaattatatcgtcttcatgacattctatccagcatgtctttctctt660atcttagagttatcaagagctggtaagcatggcaggcctgcttggcaggaacgttcagct720atagtgcgtcatgtgctccaggaggaaaagccaaatccagtggtgcagagagtcaaagtg780ataatgtctgcaggtcttgtgttggttcatgcacatagtcggtggggactgggcggtgac840gatacaggcagtgtgccttctgtggctgtcccgggaacatccctgccattggtggtttcc900tccgctacttctgtctcttctactgctgtctacaaccacactgatgacttcacagcatcc960tccatccgcgagtacctcctcaggtggctgactgtgagtgctgaccacatcgtcattctt1020atcctcctgttagcacttgctgtaaagtttgttttctttgagagtgacgaggatatccga1080gaacaaatgctggtgtctgaccgagctagtgacagggaacggagacacagaagttacagc1140catggacacgcccttgatcgtatgcgaccaatgcttgaacctggttgggtcgaggtccca1200tctcgagaagaattcattgcaattaacacagagcacaaatcagtccaaactgatcatcag1260gatgagcagcagaagccagaggaacaacagcaagtacaacctgaagaagtcaaacatgtg1320actgaagcacctccaacatgtcagcaaccacagcaagatgttgcagcttcagaaataata1380atgaataagatacctgttgatgacaataaagaggagccacaagtttgtcgaagtttagaa1440cagtgtgtggatatatataggtccaaggagggagcagcagctttaacagatgaagaaatg1500cttcagcttgttcgagctagcgtggtaccttcttatcaactggaagcagttgttaaggat1560cctgagagaggtgttggcattcgcagaaagctttttgatgctcacaaacctggtgcactt1620tcagatctaccgtatactggctacgactattcaaaggtgcttggagcatgctgtgaaaat1680gttgtgggctacttgccagtaccagtaggtattgctggtcctttgttattggatggtcaa1740caagtgcatattcctatggctacaacagagggctgcttggtggccagcactaatcgtggc1800tgccgtgcgttgctttcgtgtggtgtcacatcccgtgtcgttgctgatggtatgacacgt1860gggccagttgtccgcttcccatctgcagcaagagccagtgaggctatgatgtggatgcaa1920acaccagaaaactttgagggcatcaaagctagctttgatggtactagccgatttgcacgc1980ctaattaagttgcatgtacgcattgcagggaggcatctgtttgtgagatttgtagctacc2040acaggtgatgccatgggcatgaacatgttgtcaaagggcactgaagttgctttgggattt2100gttcagaaaacatttccagacatggaactactcagtcttagtggaaatttctgcactgac2160aagaagccagcagctgttaactggattgaaggccgagggaagtctgttgtctgtgaagcc2220gttgtgcctggggaagtggtgtcaaaagtgcttaaaacgacagtgcaagctcttgttgat2280gtaaatgttagcaagaatatgataggctctgctgtggctggaagtgtgggtggatttaat2340gcacatgctgcaaatatagtaactgccatcttcatagcaacaggccaggaccctgcacag2400aatgtgagtagcagcaactgtatgacactaatggaaccatggggagagggaggcaaggat2460cttcatgtgtcgtgtacaatgccatctcttgaaattggaactgttggtggcggcacagtt2520ctgcctgcacagggtgcttgccttgccatgttgggtgttaaaggagcgaatgaggaatca2580ccaggagaaaatgctaaaatgttagcaaggatagtatgtggcactgtactagccggagaa2640ctctccctcatgtctgctctagctgcaggtcacctagtacgatcccacctgaggcataac2700agggcctctgttacttcaagaccaagtgaagaaaagtcgtga2742<210>2<211>20<212>dna<213>hmgr-f<400>2atggcggcatcgcgagtgtt20<210>3<211>20<212>dna<213>hmgr-r<400>3tcacgacttttcttcacttg20<210>4<211>21<212>dna<213>dshmgr-f<400>4tccgctacttctgtctcttct21<210>5<211>22<212>dna<213>dshmgr-r<400>5cacacactgttctaaacttcga22<210>6<211>549<212>dna<213>cdna模板扩增产物<400>6tccgctacttctgtctcttctactgctgtctacaaccacactgatgacttcacagcatcc60tccatccgcgagtacctcctcaggtggctgactgtgagtgctgaccacatcgtcattctt120atcctcctgttagcacttgctgtaaagtttgttttctttgagagtgacgaggatatccga180gaacaaatgctggtgtctgaccgagctagtgacagggaacggagacacagaagttacagc240catggacacgcccttgatcgtatgcgaccaatgcttgaacctggttgggtcgaggtccca300tctcgagaagaattcattgcaattaacacagagcacaaatcagtccaaactgatcatcag360gatgagcagcagaagccagaggaacaacagcaagtacaacctgaagaagtcaaacatgtg420actgaagcacctccaacatgtcagcaaccacagcaagatgttgcagcttcagaaataata480atgaataagatacctgttgatgacaataaagaggagccacaagtttgtcgaagtttagaa540cagtgtgtg549<210>7<211>40<212>dna<213>dshmgr-t7-f<400>7taatacgactcactataggtccgctacttctgtctcttct40<210>8<211>41<212>dna<213>dshmgr-t7-r<400>8taatacgactcactataggcacacactgttctaaacttcga41<210>9<211>549<212>rna<213>dsrna正义链<400>9uccgcuacuucugucucuucuacugcugucuacaaccacacugaugacuucacagcaucc60uccauccgcgaguaccuccucagguggcugacugugagugcugaccacaucgucauucuu120auccuccuguuagcacuugcuguaaaguuuguuuucuuugagagugacgaggauauccga180gaacaaaugcuggugucugaccgagcuagugacagggaacggagacacagaaguuacagc240cauggacacgcccuugaucguaugcgaccaaugcuugaaccugguugggucgagguccca300ucucgagaagaauucauugcaauuaacacagagcacaaaucaguccaaacugaucaucag360gaugagcagcagaagccagaggaacaacagcaaguacaaccugaagaagucaaacaugug420acugaagcaccuccaacaugucagcaaccacagcaagauguugcagcuucagaaauaaua480augaauaagauaccuguugaugacaauaaagaggagccacaaguuugucgaaguuuagaa540cagugugug549<210>10<211>21<212>dna<213>hmgr-qtr-f<400>10taaaggagcgaatgaggaatc21<210>11<211>22<212>dna<213>hmgr-qtr-r<400>11agagcagacatgagggagagtt22<210>12<211>24<212>dna<213>β-actin-qtr-f<400>12aattaccattggtaacgagcgatt24<2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