一种苯甲酸衍生物锌配合物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及金属配合物领域，具体涉及一种苯甲酸衍生物锌配合物及其制备方法和应用。

背景领域

蛋白酪氨酸磷酸酶(ptps)是细胞内广泛存在的非金属酶类，与蛋白酪氨酸激酶共同调控细胞内酪氨酸的磷酸化水平，在细胞信号传导和调节过程中发挥重要作用。研究表明，ptps活性紊乱能够引起蛋白酪氨酸磷酸化水平异常，从而引起包括癌症、糖尿病、肥胖、免疫紊乱等在内的多种人类疾病。

在一百多种已经被发现的蛋白酪氨酸磷酸酶中，蛋白酪氨酸磷酸酶1b(ptp1b)是第一个被分离纯化出来的由ptpn1基因编码的非受体ptp，研究显示，ptp1b在胰岛素和瘦素信号中起负调节作用，所以当ptp1b过量表达时，胰岛素受体、胰岛素受体底物以及瘦素等大量去磷酸化，使得胰岛素受体不能与胰岛素结合，导致了胰岛素抵抗，从而引发ⅱ型糖尿病。ptp1b基因敲除小鼠实验表明，小鼠对胰岛素的敏感性明显增强，并对肥胖具有一定的抵抗性，所以ptp1b被认为是治疗ⅱ型糖尿病和肥胖的有效靶点，高效、特异、低毒的ptp1b抑制剂也将有望成为潜在的治疗糖尿病和肥胖的候选药物。

考虑到ptps催化活性位点的保守性，某些ptps抑制剂的选择性研究仍具有一定的挑战，对于ptp1b来说，由于另外一种酪氨酸磷酸酶t细胞ptp(tcptp)与其同源性高达80％以上，所以寻找高选择性的ptp1b抑制剂就显得尤为困难，ptp1b抑制剂的选择性也逐渐成为人们研究的热点。

锌作为人体必需的过渡金属元素，基于锌配合物的ptp1b抑制剂相对于目前已进入临床的抗糖尿病钒配合物，其毒副作用明显降低，所以设计合成能够有效且选择性抑制ptp1b活性的锌配合物，将有望开发出高效、特异、低毒的抗疗糖尿病锌配合物药物。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种苯甲酸衍生物锌配合物及其制备方法，以及将该配合物用作ptp1b抑制剂，进而在制备治疗糖尿病药物中应用。

本发明提供的一种苯甲酸衍生物锌配合物，其分子式为[zn(hl)br2]，其中hl为2-(3-(吡啶-2-基)-1h-吡唑-1-基)苯甲酸，结构式为：

本发明提供的苯甲酸衍生物锌配合物的制备方法，制备步骤如下：

(1)将zn(no3)2·6h2o、kbr、2-(3-(吡啶-2-基)-1h-吡唑-1-基)苯甲酸分别溶于甲醇；

(2)将上述三种溶液置于一个反应容器中，60～80℃加热回流4～6h，得无色澄清溶液，过滤，一周后滤液中析出无色块状晶体。

所述的步骤(1)中zn(no3)2·6h2o、kbr、2-(3-(吡啶-2-基)-1h-吡唑-1-基)苯甲酸物质的量比为2：1：1。

所述反应温度优选为70℃加热回流；所述反应时间优选为5h。

本发明制备的锌配合物属于单斜晶系，空间群为p21/n，晶胞参数：α＝90°，β＝101.266(3)°，γ＝90°。其不对称单元由一个zn²⁺，一个配体和两个br^-组成，中心金属zn²⁺与两个n、两个br^-和一个o配位形成变形的四方锥构型，同时zn²⁺又通过羧基上的羰基氧桥连形成一维链状结构。

本发明的苯甲酸衍生物锌配合物对ptp1b的半数抑制浓度(ic50)为：0.29μm，对tcptp的半数抑制浓度(ic50)为：1.6μm，对ptp1b活性的抑制具有较好的选择性，并通过荧光光谱分析，推测锌配合物作用于ptp1b的活性位点。

与现有技术相比本发明的有益效果：本发明的锌配合物是过渡金属锌zn(no3)2·6h2o、kbr、苯甲酸配体在加热条件下反应得到，制备的方法简单，产物纯度高，产率高，可达70％。

本发明提供的锌配合物能够有效抑制ptp1b和tcptp活性，且抑制ptp1b活性的能力明显强于tcptp，所以该配合物对ptp1b活性的抑制具有高效性和选择性；本发明的锌配合物也将用作治疗ⅱ型糖尿病的潜在药物候选物。

附图说明

图1本发明锌配合物[zn(hl)br2]的配位环境图

图2本发明锌配合物[zn(hl)br2]的一维链状图

图3本发明锌配合物[zn(hl)br2]抑制ptp1b活性的ic50值测定曲线

图4本发明锌配合物[zn(hl)br2]抑制tcptp活性的ic50值测定曲线

图5本发明锌配合物[zn(hl)br2]对ptp1b的荧光滴定光谱图

图6本发明中依次用na3vo4和配合物[zn(hl)br2]滴定ptp1b的荧光谱图

具体实施方式

实施例1.本发明锌配合物[zn(hl)br2]的制备及晶体培养方法。

称取0.0594gzn(no3)2·6h2o溶于5ml甲醇，0.0238g溶于5ml甲醇，0.0265g(2-(3-(吡啶-2-基)-1h-吡唑-1-基)苯甲酸溶于10ml甲醇，将上述三种溶液置于圆底烧瓶中，70℃加热回流5h，得无色澄清溶液，过滤，一周后滤液在室温下析出无色块状晶体。收集晶体分别用水、甲醇各洗涤三次，真空干燥，产率为70％。元素分析c15h11br2n3o2zn：理论值：c,36.73，h,2.26n,8.57；实验值：c,36.86，h,2.23，n,8.74。

实施例2.本发明配合物[zn(hl)br2]的单晶x-ray衍射试验条件和晶体结构分析。

尝试了各种结晶的方法，通过常温挥发我们得到配合物的单晶。配合物晶体结构的测试是在显微镜下挑选形状规则、比较透明的块状单晶黏于玻璃丝上，用brukerapex-ⅱccd衍射仪在北京同步辐射(bsrf)3w1a线站上进行测试。选用石墨单色器以ω-2θ扫描方式，在室温下收集x-ray衍射数据，晶胞参数通过smart程序确定，并通过saintplus程序对原始数据还原、校正。最终数据使用shelxs-97程序包通过直接法进行解析。最后用shelxl197(sheldrick，2008)程序包对其精修，得到的晶胞参数、键长、键角见表如表1和表2，从晶体解析结果可以看出，本发明制备的锌配合物属于单斜晶系，空间群为p21/n，晶胞参数：α＝90°，β＝101.266(3)°，γ＝90°。其不对称单元由一个zn²⁺，一个配体和两个br^-组成，中心金属zn²⁺与两个n、两个br^-和一个o配位形成变形的四方锥构型(如图1)，同时zn²⁺又通过羧基上的羰基氧桥连形成一维链状结构(如图2)。

表1锌配合物的晶体学数据

表2锌配合物的部分主要键长和键角数据(°)

实施例3.本发明锌配合物对ptp1b和tcptp活性抑制的ic50值测定

ic50测定原理：

蛋白酪氨酸磷酸酶(ptps)能够将其反应底物对硝基苯磷酸二钠盐(pnpp)分解成黄色的对硝基苯酚(pnp)，pnp在405nm处有很强的紫外吸收吸收，其摩尔消光系数ε＝1.78×10⁴(mol^-1·l·cm)^-1，在ptps抑制实验中，可通过检测405nm处吸光度值的变化来间接检测酶活性的变化情况。

在本实验中ptps的活性抑制实验均以pnpp为反应底物，在(20mmmops,50mmnacl,ph＝7.24)的mops缓冲液中进行，最后用2m的naoh终止反应，将酶标仪所测数据用origin程序拟合即可得到配合物抑制酶的半数抑制浓度ic50值。通过ic50值的大小可以判断抑制剂抑制能力的强弱，ic50值越小，说明抑制剂的抑制效果越好。

ic50值测定的实验步骤：在96孔板中，前三排加入含酶的mops缓冲溶液(50mmnacl,20mmmops,ph＝7.24)，为了扣除溶液体系本身吸收对测定结果的影响，在第四排中加入不含酶的mops缓冲溶液，作为空白组。然后在第一列中加入10μldmso溶液作为对照组，之后的每一列中，按照浓度递增的顺序依次加入10μl不同浓度的配合物溶液，将96孔板置于水浴锅中，37℃恒温反应30min后，用2μlpnpp启动反应，约半个小时后，96孔板中的溶液变黄，最后加5μlnaoh(2m)终止反应，然后用酶标仪测量反应体系在405nm处的紫外吸光度值，将数据用origin程序拟合处理后，即可得到配合物抑制ptps活性的ic50值，为了尽可能减少实验误差，每个配合物的ic50值测定结果至少重复三次以上，而且每次配合物可用三天，含酶的mops缓冲溶液需要现配现用。实验结果显示，锌配合物[zn(hl)br2]能够有效抑制ptp1b活性，其ic50值为0.29μm(如图3)，同时该配合物也能抑制tcptp活性，其ic50值为1.6μm(如图4)，比较锌配合物抑制两种酶活性的ic50值大小可以发现，该配合物抑制ptp1b活性的能力约是其抑制tcptp活性能力的6倍，表明该锌配合物对ptp1b的抑制具有较好的选择性。

实施例4.本发明锌配合物对ptp1b的荧光增强作用

蛋白质分子中由于含有酪氨酸和色氨酸残而使其具有天然荧光，当向蛋白溶液中加入一些小分子后，小分子与蛋白分子的结合会影响到蛋白分子微环境的变化，从而引起蛋白分子的荧光变化，可以借助蛋白分子的荧光信号的变化来研究他们的作用模式和机理。所以我们研究了本发明配合物对ptp1b的荧光增强作用。图5所示为扣除了配合物本身的荧光强度之后，配合物滴定ptp1b的荧光光谱图，从图中可以看出随着配合物的浓度逐渐增加，ptp1b在351nm处的荧光强度逐渐增加，直至增加到一定程度后，荧光强度几乎不变，这可能是配合物与ptp1b结合形成的复合物的荧光峰，这个实验结果进一步证明了锌配合物与ptp1b之间的相互作用。

实施例5.本发明锌配合物与ptp1b可能结合位点的研究

众所周知，抑制剂对对酶活性的抑制作用方式有很多种，其中较为常见的就是竞争型抑制，该类抑制剂也称为竞争型抑制剂，它指的是抑制剂与底物在结构上有相似性，与底物竞争性的与酶的活性位点结合，为了证明配合物是否与ptp1b的活性位点结合，如图6所示，首先用钒酸钠滴定ptp1b至荧光强度不变，钒酸钠与ptp1b活性位点完全结合，继续向二者的混合溶液中滴加配合物，发现配合物的加入并没有改变溶液的荧光强度，表明钒酸钠“锁定”ptp1b的活性位点后配合物不能再与ptp1b结合，由此推测出配合物[zn(hl)br2]可能作用于ptp1b的活性位点。