抗TIM-3抗体的制作方法
本发明涉及结合t细胞免疫球蛋白粘蛋白3(tim-3)的抗体。
背景技术：
t细胞耗竭是许多慢性感染和癌症中出现的t细胞功能障碍的状态。它通过t细胞效应子功能不良、抑制性受体的持续表达和与功能性效应子或记忆性t细胞的转录状态不同的转录状态而确定。耗竭阻碍了对感染和肿瘤的最佳控制(ejohnwherry.,自然免疫学“natureimmunology”12,492-499(2011))。
t细胞耗竭的特征在于t细胞功能逐步和渐进性的丧失。在慢性淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒感染期间，耗竭是明确的，并且通常在抗原续存(antigenpersistence)的情况下发生，其在许多慢性感染(包括乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒感染)以及肿瘤转移期间都有出现。耗竭不是均匀的失能定型，因为表型和功能缺陷的等级可以表现出来，这些细胞与原型效应子、记忆和无能t细胞不同。耗竭的t细胞在高等级慢性感染期间最常出现，抗原刺激的水平和持续时间是该过程的关键决定因素(yi等,免疫学“immunology”2010年4月；129(4):474-481)。
循环的人肿瘤特异性cd8+t细胞可能有细胞毒性并且在体内产生细胞因子，这表明了自身和肿瘤特异性的人cd8+t细胞在有效的免疫治疗，例如用肽接种、不完全弗氏佐剂(ifa)和cpg之后或过继转移后可以达到功能性能力。与外周血相比，转移的t细胞有功能缺陷，细胞因子产生异常低，抑制性受体pd-1、ctla-4和tim-3上调。功能缺陷是可逆的，因为从黑素瘤组织分离的t细胞可以在短期体外培养后恢复产生ifn-γ。然而，仍然要确定这种功能障碍是否涉及进一步的分子途径，可能类似于动物模型中限定的t细胞耗竭或无反应性(baitsch等人,jclininvest.2011；121(6):2350-2360)。
程序性细胞死亡1(pd-1)，也称为cd279，是人类中pdcd1基因编码的i型膜蛋白。它有两个配体，pd-l1和pd-l2。
pd-1途径是t细胞衰竭的关键免疫抑制介质。阻断该途径可引起t细胞活化、扩增和效应子功能增强。因此，pd-1负调节t细胞反应。已经将pd-1鉴定为慢性疾病状态中耗竭t细胞的标志物，并且已经显示阻断pd-1：pd-1l的相互作用部分恢复了t细胞功能。(sakuishi等人，jem第207卷，2010年9月27日，第2187-2194页)。
纳武单抗(nivolumab,bms-936558)是2014年7月在日本批准用于治疗黑色素瘤的抗pd-1。其它抗pd-1抗体描述于wo2010/077634，wo2006/121168中。
t细胞免疫球蛋白粘蛋白3(tim-3)是被鉴定为在耗尽的cd8+t细胞上上调的免疫调节因子(sakuishi等人，jem第207卷，2010年9月27日，第2187-2194页)。最初鉴定出tim-3在ifn-γ分泌th1和tc1细胞上选择性表达。tim-3与其配体半乳凝素-9的相互作用触发了tim-3+t细胞的细胞死亡。抗tim-3抗体描述于ngiow等人(癌症研究“cancerres.”2011年5月15日；71(10)：3540-51)和us5,552,156中。
tim-3和pd-1都可以作为t细胞反应的负调节因子，并且对tim-3和pd-1途径的组合靶向在控制肿瘤生长方面比单独靶向途径更有效。(sakuishi等人，jem第207卷，2010年9月27日，第2187-2194页；和ngiow等人，癌症研究“cancerres.”2011年5月15日；71(10)：3540-51)。
tim-3也可以在肿瘤细胞，特别是造血起源的肿瘤细胞表面表达，例如急性骨髓性白血病细胞(kikushige等人，细胞干细胞“cellstemcell”2010；3：7(6)708-17)，因此，在某些情况下，tim-3可能是可能被特异性抗体靶向的肿瘤相关抗原。
技术实现要素：
本发明涉及与tim-3结合的抗体或抗原结合片段。还公开了重链和轻链多肽。抗体、抗原结合片段和多肽可以分离和/或纯化的形式提供，并且可以配制成适合研究、治疗和诊断的组合物。
在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段或多肽是细胞毒性的，例如针对表达tim-3的细胞，例如表达tim-3的t细胞或肿瘤细胞。在一些实施方式中，由于其细胞毒性作用，抗体或抗原结合片段或多肽被用于治疗癌症。适合的癌症包括白血病，例如急性骨髓性白血病。
在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段或多肽可有效恢复t细胞中的t细胞功能，例如，cd8+t细胞，显示t细胞耗竭或t细胞无效能。
本发明的不同方面是基于被称为a3，b10，g6，g7和g9的抗体。本发明的其它方面是基于被称为a11和a11_gi的抗体。
a3
在本发明的一个方面，提供抗体或抗原结合片段，抗体的氨基酸序列可以包含氨基酸序列i)至iii)，或氨基酸序列iv)至vi)，或优选氨基酸序列i)至vi):
i)lc-cdr1:rasqdigsyla(seqidno:6)
ii)lc-cdr2:aastlqs(seqidno:7)
iii)lc-cdr3:qqsyssppt(seqidno:8)
iv)hc-cdr1:gytftsyymh(seqidno:24)或
syymh(seqidno:58)
v)hc-cdr2:iinpsggstsyaqkfqg(seqidno:25)
vi)hc-cdr3:spgvvtalfdy(seqidno:26)
或其变体，其中序列(i)至(vi)的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸替代。
关于本发明的所有方面，在hc-cdr1：syymh(seqidno：58)的实施方式中，该序列可以包含在更大的序列gytftsyymh(seqidno：24)内。
抗体或抗原结合片段可以包含含有以下cdr的至少一个轻链可变区：
lc-cdr1:rasqdigsyla(seqidno:6)
lc-cdr2:aastlqs(seqidno:7)
lc-cdr3:qqsyssppt(seqidno:8)。
抗体或抗原结合片段可以包含含有以下cdr的至少一个重链可变区：
hc-cdr1:gytftsyymh(seqidno:24),或
syymh(seqidno:58)
hc-cdr2:iinpsggstsyaqkfqg(seqidno:25)
hc-cdr3:spgvvtalfdy(seqidno:26)。
抗体可以包含含有cdr的至少一个轻链可变区，如图1或图3所示。抗体可以包含含有cdr的至少一个重链可变区，如图2或3所示。
抗体可以包含至少一个轻链可变区(vl)，其包含seqidno1、6、7、8之一的氨基酸序列，或图1所示的氨基酸序列之一，或与seqidno1、6、7、8之一或图1所示vl链氨基酸序列的氨基酸序列具有至少70％，更优选具有75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
抗体可以包含至少一个重链可变区(vh)，其包含seqidno19、24或58、25、26之一的氨基酸序列，或图2所示的氨基酸序列之一，或与seqidno19、24或58、25、26之一或图2所示vh链氨基酸序列的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
抗体可以包含至少一个轻链可变区(vl)和至少一个重链可变区(vh)，轻链可变区包含seqidno1、6、7、8之一的氨基酸序列，或图1所示的氨基酸序列之一(或与seqidno1、6、7、8之一或图1所示vl链氨基酸序列的氨基酸序列之一具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列)，重链可变区包含seqidno19、24或58、25、26之一的氨基酸序列，或图2所示的氨基酸序列之一(或与seqidno19、24或58、25、26之一或图2所示vh链氨基酸序列的氨基酸序列之一具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列)。
抗体可以任选结合tim-3。抗体可以任选地具有如上所述的氨基酸序列组分。抗体可以是igg。在一个实施方式中，提供了包含与tim-3结合的本文所述的抗体或抗原结合片段的任选分离的体外复合物。
在本发明的一个方面，提供分离的重链可变区多肽，所述重链可变区多肽包含以下cdr：
hc-cdr1:gytftsyymh(seqidno:24),或
syymh(seqidno:58)
hc-cdr2:iinpsggstsyaqkfqg(seqidno:25)
hc-cdr3:spgvvtalfdy(seqidno:26)。
在本发明的一个方面，提供抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含重链和轻链可变区序列，其中：
重链包含分别与gytftsyymh(seqidno:24)或syymh(seqidno:58)、iinpsggstsyaqkfqg(seqidno:25)、spgvvtalfdy(seqidno:26)具有至少85％总体序列同一性的hc-cdr1、hc-cdr2、hc-cdr3，和
轻链包含分别与rasqdigsyla(seqidno:6)、aastlqs(seqidno:7)、qqsyssppt(seqidno:8)具有至少85％总体序列同一性的lc-cdr1，lc-cdr2，lc-cdr3。
在一些实施方式中，序列同一性程度可以是86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
在本发明的另一方面，提供任选分离的抗体或抗原结合片段，其包含重链和轻链可变区序列，其中：
重链序列与重链序列：seqidno：19具有至少85％的序列同一性；和
轻链序列与轻链序列：seqidno：1具有至少85％的序列同一性。
在一些实施方式中，序列同一性程度可以是86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
在一些实施方式中，抗体、抗原结合片段或多肽还包含在cdr之间的可变区重链框架序列，按照hcfr1：hc-cdr1：hcfr2：hc-cdr2：hcfr3：hc-cdr3：hcfr4排列。框架序列可以源自人共识框架序列。
在本发明的一个方面，提供分离的轻链可变区多肽，任选地与本文所述的重链可变区多肽组合，所述轻链可变区多肽包含以下cdr：
lc-cdr1:rasqdigsyla(seqidno:6)
lc-cdr2:aastlqs(seqidno:7)
lc-cdr3:qqsyssppt(seqidno:8)
在一些实施方式中，抗体、抗原结合片段或多肽还包含在cdr之间，可变区轻链框架序列，按照lcfr1:lc-cdr1:lcfr2:lc-cdr2:lcfr3:lc-cdr3:lcfr4排列。框架序列可以源自人共识框架序列。
b10
在本发明的一个方面，提供抗体或抗原结合片段，抗体的氨基酸序列可以包含氨基酸序列i)至iii)，或氨基酸序列iv)至vi)，或优选氨基酸序列i)至vi):
i)lc-cdr1:rasqsvgsyla(seqidno:9)
ii)lc-cdr2:datnrat(seqidno:10)
iii)lc-cdr3:qhrrt(seqidno:11)
iv)hc-cdr1:ggsigssdyywg(seqidno:27),或
ssdyywg(seqidno:59)
v)hc-cdr2:siyysgstyynpslks(seqidno:28)
vi)hc-cdr3:gehrgefdy(seqidno:29)
或其变体，其中序列(i)至(vi)的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸替代。
关于本发明的所有方面，在hc-cdr1:ssdyywg(seqidno:59)的实施方式中，该序列可以包含在更大的序列ggsigssdyywg(seqidno:27)内。
抗体或抗原结合片段可以包含含有以下cdr的至少一个轻链可变区：
lc-cdr1:rasqsvgsyla(seqidno:9)
lc-cdr2:datnrat(seqidno:10)
lc-cdr3:qhrrt(seqidno:11)
抗体或抗原结合片段可以包含含有以下cdr的至少一个重链可变区：
hc-cdr1:ggsigssdyywg(seqidno:27),或
ssdyywg(seqidno:59)
hc-cdr2:siyysgstyynpslks(seqidno:28)
hc-cdr3:gehrgefdy(seqidno:29)
抗体可以包含含有cdr的至少一个轻链可变区，如图1或图3所示。抗体可以包含含有cdr的至少一个重链可变区，如图2或3所示。
抗体可以包含至少一个轻链可变区(vl)，其包含seqidno2、9、10、11之一的氨基酸序列，或图1所示的氨基酸序列之一，或与seqidno2、9、10、11之一或图1所示vl链氨基酸序列的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
抗体可以包含至少一个重链可变区(vh)，其包含seqidno20、27或59、28、29之一的氨基酸序列，或图2所示的氨基酸序列之一，或与seqidno20、27或59、28、29之一或图2所示vh链氨基酸序列的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
抗体可以包含至少一个轻链可变区(vl)和至少一个重链可变区(vh)，轻链可变区包含seqidno2、9、10、11之一的氨基酸序列，或图1所示的氨基酸序列之一(或与seqidno2、9、10、11之一或图1所示vl链氨基酸序列的氨基酸序列之一具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列)，重链可变区包含seqidno20、27或59、28、29之一的氨基酸序列，或图2所示的氨基酸序列之一(或与seqidno20、27或59、28、29之一或图2所示vh链氨基酸序列的氨基酸序列之一具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列)。
抗体可以任选地结合于tim-3。抗体可以任选地具有如上所述的氨基酸序列组分。抗体可以是igg。在一个实施方式中，提供了包含与tim-3结合的本文所述抗体或抗原结合片段的任选分离的体外复合物。
在本发明的一个方面，提供分离的重链可变区多肽，所述重链可变区多肽包含以下cdr：
hc-cdr1:ggsigssdyywg(seqidno:27)，或
ssdyywg(seqidno:59)
hc-cdr2:siyysgstyynpslks(seqidno:28)
hc-cdr3:gehrgefdy(seqidno:29)
在本发明的一个方面，提供抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包括重链和轻链可变区序列，其中，
重链包含分别与ggsigssdyywg(seqidno:27)或ssdyywg(seqidno:59),siyysgstyynpslks(seqidno:28),gehrgefdy(seqidno:29)具有至少85％总体序列同一性的hc-cdr1,hc-cdr2,hc-cdr3，和轻链包含分别与rasqsvgsyla(seqidno:9),datnrat(seqidno:10),qhrrt(seqidno:11)具有至少85％总体序列同一性的lc-cdr1，lc-cdr2，lc-cdr3。
在一些实施方式中，序列同一性程度可以是86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
在本发明的另一方面，提供任选分离的抗体或抗原结合片段，其包含重链和轻链可变区序列，其中：
重链序列与重链序列：seqidno：20具有至少85％的序列同一性；和
轻链序列与轻链序列：seqidno：2具有至少85％的序列同一性。
在一些实施方式中，序列同一性程度可以是86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
在一些实施方式中，抗体、抗原结合片段或多肽还包含在cdr之间d可变区重链框架序列，按照hcfr1:hc-cdr1:hcfr2:hc-cdr2:hcfr3:hc-cdr3:hcfr4排列。框架序列可以源自人共识框架序列。
在本发明的一个方面，提供分离的轻链可变区多肽，任选地与本文所述的重链可变区多肽组合，所述轻链可变区多肽包含以下cdr：
lc-cdr1:rasqsvgsyla(seqidno:9)
lc-cdr2:datnrat(seqidno:10)
lc-cdr3:qhrrt(seqidno:11)
在一些实施方式中，抗体、抗原结合片段或多肽还包含在cdr之间的可变区轻链框架序列，按照lcfr1:lc-cdr1:lcfr2:lc-cdr2:lcfr3:lc-cdr3:lcfr4排列。框架序列可以源自人共识框架序列。
g6
在本发明的一个方面，提供抗体或抗原结合片段，抗体的氨基酸序列可以包含氨基酸序列i)至iii)，或氨基酸序列iv)至vi)，或优选氨基酸序列i)至vi):
i)lc-cdr1:rssqsllhsngynyld(seqidno:12)
ii)lc-cdr2:lgsnras(seqidno:13)
iii)lc-cdr3:mqgthwppt(seqidno:14)
iv)hc-cdr1:ggsisssnwws(seqidno:30),或
ssnwws(seqidno:60)
v)hc-cdr2:eiyhsgstnynpslks(seqidno:31)
vi)hc-cdr3:vvavagtvdy(seqidno:32)
或其变体，其中序列(i)至(vi)的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸替代。
关于本发明的所有方面，在hc-cdr1:ssnwws(seqidno:60)的实施方式中，该序列可以包含在更大的序列ggsisssnwws(seqidno:30)内。
抗体或抗原结合片段可以包含含有以下cdr的至少一个轻链可变区：
lc-cdr1:rssqsllhsngynyld(seqidno:12)
lc-cdr2:lgsnras(seqidno:13)
lc-cdr3:mqgthwppt(seqidno:14)
抗体或抗原结合片段可以包含含有以下cdr的至少一个重链可变区：
hc-cdr1:ggsisssnwws(seqidno:30),或
ssnwws(seqidno:60)
hc-cdr2:eiyhsgstnynpslks(seqidno:31)
hc-cdr3:vvavagtvdy(seqidno:32)
抗体可以包含含有cdr的至少一个轻链可变区，如图1或图3所示。抗体可以包含含有cdr的至少一个重链可变区，如图2或3所示。
抗体可以包含至少一个轻链可变区(vl)，其包含seqidno3,12,13,14之一的氨基酸序列，或图1所示的氨基酸序列之一，或与seqidno3,12,13,14之一或图1所示vl链氨基酸序列的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
抗体可以包含至少一个重链可变区(vh)，其包含seqidno21,30或60,31,32之一的氨基酸序列，或图2所示的氨基酸序列之一，或与seqidno21,30或60,31,32之一或图2所示vh链氨基酸序列的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
抗体可以包含至少一个轻链可变区(vl)和至少一个重链可变区(vh)，轻链可变区包含seqidno3,12,13,14之一的氨基酸序列，或图1所示的氨基酸序列之一(或与seqidno3,12,13,14之一或图1所示vl链氨基酸序列的氨基酸序列之一具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列)，重链可变区包含seqidno21,30或60,31,32之一的氨基酸序列，或图2所示的氨基酸序列之一(或与seqidno21,30或60,31,32之一或图2所示vh链氨基酸序列的氨基酸序列之一具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列)。
抗体可以任选地结合于tim-3。抗体可以任选地具有如上所述的氨基酸序列组分。抗体可以是igg。在一个实施方式中，提供了包含与tim-3结合的本文所述的抗体或抗原结合片段的任选分离的体外复合物。
在本发明的一个方面，提供分离的重链可变区多肽，所述重链可变区多肽包含以下cdr：
hc-cdr1:ggsisssnwws(seqidno:30),或
ssnwws(seqidno:60)
hc-cdr2:eiyhsgstnynpslks(seqidno:31)
hc-cdr3:vvavagtvdy(seqidno:32)
在本发明的一个方面，提供抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含重链和轻链可变区序列，其中：
重链包含分别与ggsisssnwws(seqidno:30)或ssnwws(seqidno:60),eiyhsgstnynpslks(seqidno:31),vvavagtvdy(seqidno:32)具有至少85％总体序列同一性的hc-cdr1,hc-cdr2,hc-cdr3，和轻链包含分别与rssqsllhsngynyld(seqidno:12)、lgsnras(seqidno:13)、mqgthwppt(seqidno:14)具有至少85％总体序列同一性的lc-cdr1，lc-cdr2，lc-cdr3。
在一些实施方式中，序列同一性程度可以是86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％。
在本发明的另一方面，提供任选分离的抗体或抗原结合片段，其包含重链和轻链可变区序列，其中：
重链序列与重链序列：seqidno：21具有至少85％的序列同一性；和
轻链序列与轻链序列：seqidno：3具有至少85％的序列同一性。
在一些实施方式中，序列同一性程度可以是86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
在一些实施方式中，抗体、抗原结合片段或多肽还包含可变区重链框架序列，在cdr之间，按照hcfr1:hc-cdr1:hcfr2:hc-cdr2:hcfr3:hc-cdr3:hcfr4排列。框架序列可以源自人共识框架序列。
在本发明的一个方面，提供分离的轻链可变区多肽，任选地与本文所述的重链可变区多肽组合，所述轻链可变区多肽包含以下cdr：
lc-cdr1:rssqsllhsngynyld(seqidno:12)
lc-cdr2:lgsnras(seqidno:13)
lc-cdr3:mqgthwppt(seqidno:14)
在一些实施方式中，抗体、抗原结合片段或多肽还包含在cdr之间的可变区轻链框架序列，按照lcfr1:lc-cdr1:lcfr2:lc-cdr2:lcfr3:lc-cdr3:lcfr4排列。框架序列可以源自人共识框架序列。
g7
在本发明的一个方面，提供抗体或抗原结合片段，抗体的氨基酸序列可以包含氨基酸序列i)至iii)，或氨基酸序列iv)至vi)，或优选氨基酸序列i)至vi):
i)lc-cdr1:rasqsvsssyla(seqidno:15)
ii)lc-cdr2:gassrat(seqidno:16)
iii)lc-cdr3:qqygsspit(seqidno:17)
iv)hc-cdr1:gytftsyymh(seqidno:24),或
syymh(seqidno:58)
v)hc-cdr2:iinpsggstsyaqkfqg(seqidno:25)
vi)hc-cdr3:dqyssgwyyygmdv(seqidno:33)
或其变体，其中序列(i)至(vi)的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸替代。
关于本发明的所有方面，在hc-cdr1:syymh(seqidno:58)的实施方式中，该序列可以包含在更大的序列gytftsyymh(seqidno:24)内。
抗体或抗原结合片段可以包含含有以下cdr的至少一个轻链可变区：
lc-cdr1:rasqsvsssyla(seqidno:15)
lc-cdr2:gassrat(seqidno:16)
lc-cdr3:qqygsspit(seqidno:17)
抗体或抗原结合片段可以包含含有以下cdr的至少一个重链可变区：
hc-cdr1:gytftsyymh(seqidno:24),或
syymh(seqidno:58)
hc-cdr2:iinpsggstsyaqkfqg(seqidno:25)
hc-cdr3:dqyssgwyyygmdv(seqidno:33)
抗体可以包含含有cdr的至少一个轻链可变区，如图1或图3所示。抗体可以包含含有cdr的至少一个重链可变区，如图2或3所示。
抗体可以包含至少一个轻链可变区(vl)，其包含seqidno4,15,16,17之一的氨基酸序列，或图1所示的氨基酸序列之一，或与seqidno4,15,16,17之一或图1所示vl链氨基酸序列的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％,80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
抗体可以包含至少一个重链可变区(vh)，其包含seqidno22,24或58,25,33之一的氨基酸序列，或图2所示的氨基酸序列之一，或与seqidnoseqidno22,24或58,25,33之一或图2所示vh链氨基酸序列的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
抗体可以包含至少一个轻链可变区和至少一个重链可变区，轻链可变区包含seqidno4,15,16,17之一的氨基酸序列，或图1所示的氨基酸序列之一(或与seqidno4,15,16,17之一或图1所示vl链氨基酸序列的氨基酸序列之一具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列)，重链可变区包含seqidno22,24或58,25,33之一的氨基酸序列，或图2所示的氨基酸序列之一(或与seqidno22,24或58,25,33之一或图2所示vh链氨基酸序列的氨基酸序列之一具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列)。
抗体可以任选结合tim-3。抗体可以任选地具有如上所述的氨基酸序列组分。抗体可以是igg。在一个实施方式中，提供了包含与tim-3结合的本文所述的抗体或抗原结合片段的任选分离的体外复合物。
在本发明的一个方面，提供分离的重链可变区多肽，所述重链可变区多肽包含以下cdr：
hc-cdr1:gytftsyymh(seqidno:24),或
syymh(seqidno:58)
hc-cdr2:iinpsggstsyaqkfqg(seqidno:25)
hc-cdr3:dqyssgwyyygmdv(seqidno:33)
在本发明的一个方面，提供抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含重链和轻链可变区序列，其中：
重链包含分别与gytftsyymh(seqidno:24)或syymh(seqidno:58)、iinpsggstsyaqkfqg(seqidno:25)、dqyssgwyyygmdv(seqidno:33)具有至少85％总体序列同一性的hc-cdr1,hc-cdr2,hc-cdr3，和轻链包含分别与rasqsvsssyla(seqidno:15)、gassrat(seqidno:16)、qqygsspit(seqidno:17)具有至少85％总体序列同一性的lc-cdr1，lc-cdr2，lc-cdr3。
在一些实施方式中，序列同一性程度可以是86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
在本发明的另一方面，提供任选分离的抗体或抗原结合片段，其包含重链和轻链可变区序列，其中：
重链序列与重链序列：seqidno：22具有至少85％的序列同一性；和
轻链序列与轻链序列：seqidno：4具有至少85％的序列同一性。
在一些实施方式中，序列同一性程度可以是86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
在一些实施方式中，抗体、抗原结合片段或多肽还包含在cdr之间的可变区重链框架序列，按照hcfr1：hc-cdr1：hcfr2：hc-cdr2：hcfr3：hc-cdr3：hcfr4排列。框架序列可以源自人共识框架序列。
在本发明的一个方面，提供分离的轻链可变区多肽，任选地与本文所述的重链可变区多肽组合，所述轻链可变区多肽包含以下cdr：
lc-cdr1:rasqsvsssyla(seqidno:15)
lc-cdr2:gassrat(seqidno:16)
lc-cdr3:qqygsspit(seqidno:17)
在一些实施方式中，抗体、抗原结合片段或多肽还包含在cdr之间的可变区轻链框架序列，按照lcfr1:lc-cdr1:lcfr2:lc-cdr2:lcfr3:lc-cdr3:lcfr4排列。框架序列可以源自人共识框架序列。
g9
在本发明的一个方面，提供抗体或抗原结合片段，抗体的氨基酸序列可以包含氨基酸序列i)至iii)，或氨基酸序列iv)至vi)，或优选氨基酸序列i)至vi):
i)lc-cdr1:rasqsvsssyla(seqidno:15)
ii)lc-cdr2:gassrat(seqidno:16)
iii)lc-cdr3:qqygsspit(seqidno:17)
iv)hc-cdr1:gytftsyymh(seqidno:24),或
syymh(seqidno:58)
v)hc-cdr2:iinpsggstsyaqkfqg(seqidno:25)
vi)hc-cdr3:dlysygfyyygmdv(seqidno:34)
或其变体，其中序列(i)至(vi)的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸替代。
关于本发明的所有方面，在hc-cdr1:syymh(seqidno:58)的实施方式中，该序列可以包含在更大的序列gytftsyymh(seqidno:24)内。
抗体或抗原结合片段可以包含含有以下cdr的至少一个轻链可变区：
lc-cdr1:rasqsvsssyla(seqidno:15)
lc-cdr2:gassrat(seqidno:16)
lc-cdr3:qqygsspit(seqidno:17)
抗体或抗原结合片段可以包含含有以下cdr的至少一个重链可变区：
hc-cdr1:gytftsyymh(seqidno:24),或
syymh(seqidno:58)
hc-cdr2:iinpsggstsyaqkfqg(seqidno:25)
hc-cdr3:dlysygfyyygmdv(seqidno:34)
抗体可以包含含有cdr的至少一个轻链可变区，如图1或图3所示。抗体可以包含含有cdr的至少一个重链可变区，如图2或3所示。
抗体可以包含至少一个轻链可变区(vl)，其包含seqidno5,15,16,17之一的氨基酸序列，或图1所示的氨基酸序列之一，或与seqidno5,15,16,17之一或图1所示vl链氨基酸序列的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
抗体可以包含至少一个重链可变区(vh)，其包含seqidno23,24或58,25,34之一的氨基酸序列，或图2所示的氨基酸序列之一，或与seqidnoseqidno23,24或58,25,34之一或图2所示vh链氨基酸序列的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％,99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
抗体可以包含至少一个轻链可变区和至少一个重链可变区，轻链可变区包含seqidno5,15,16,17之一的氨基酸序列，或图1所示的氨基酸序列之一(或与seqidno5,15,16,17之一或图1所示vl链氨基酸序列的氨基酸序列之一具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列)，重链可变区包含seqidno23,24或58,25,34之一的氨基酸序列，或图2所示的氨基酸序列之一(或与seqidno23,24或58,25,34之一或图2所示vh链氨基酸序列的氨基酸序列之一具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列)。
抗体可以任选结合tim-3。抗体可以任选地具有如上所述的氨基酸序列组分。抗体可以是igg。在一个实施方式中，提供了包含与tim-3结合的本文所述的抗体或抗原结合片段的任选分离的体外复合物。
在本发明的一个方面，提供分离的重链可变区多肽，所述重链可变区多肽包含以下cdr：
hc-cdr1:gytftsyymh(seqidno:24),或
syymh(seqidno:58)
hc-cdr2:iinpsggstsyaqkfqg(seqidno:25)
hc-cdr3:dlysygfyyygmdv(seqidno:34)
在本发明的一个方面，提供抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含重链和轻链可变区序列，其中：
重链包含分别与gytftsyymh(seqidno:24)或syymh(seqidno:58),iinpsggstsyaqkfqg(seqidno:25),dlysygfyyygmdv(seqidno:34)具有至少85％总体序列同一性的hc-cdr1,hc-cdr2,hc-cdr3，和轻链包含分别与rasqsvsssyla(seqidno:15)、gassrat(seqidno:16)、qqygsspit(seqidno:17)具有至少85％总体序列同一性的lc-cdr1，lc-cdr2，lc-cdr3。
在一些实施方式中，序列同一性程度可以是86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
在本发明的另一方面，提供任选分离的抗体或抗原结合片段，其包含重链和轻链可变区序列，其中：
重链序列与重链序列：seqidno：23具有至少85％的序列同一性；和
轻链序列与轻链序列：seqidno：5具有至少85％的序列同一性。
在一些实施方式中，序列同一性程度可以是86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
在一些实施方式中，抗体、抗原结合片段或多肽还包含在cdr之间可变区重链框架序列，按照hcfr1:hc-cdr1:hcfr2:hc-cdr2:hcfr3:hc-cdr3:hcfr4排列。框架序列可以源自人共识框架序列。
在本发明的一个方面，提供分离的轻链可变区多肽，任选地与本文所述的重链可变区多肽组合，所述轻链可变区多肽包含以下cdr：
lc-cdr1:rasqsvsssyla(seqidno:15)
lc-cdr2:gassrat(seqidno:16)
lc-cdr3:qqygsspit(seqidno:17)
在一些实施方式中，抗体、抗原结合片段或多肽还包含在cdr之间可变区轻链框架序列，按照lcfr1:lc-cdr1:lcfr2:lc-cdr2:lcfr3:lc-cdr3:lcfr4排列。框架序列可以源自人共识框架序列。
a11
在本发明的一个方面，提供抗体或抗原结合片段，抗体的氨基酸序列可以包含氨基酸序列i)至iii)，或氨基酸序列iv)至vi)，或优选氨基酸序列i)至vi):
i)lc-cdr1:sgsssnignnyvs(seqidno:47)
ii)lc-cdr2:gnnwrps(seqidno:48)
iii)lc-cdr3:etwdsslsagv(seqidno:49)
iv)hc-cdr1:ggsfsgyyws(seqidno:52),或
gyyws(seqidno:61)
v)hc-cdr2:einhsgstnynpslks(seqidno:53)
vi)hc-cdr3:gyvagfdy(seqidno:54)
或其变体，其中序列(i)至(vi)的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸替代。
关于本发明的所有方面，在hc-cdr1:gyyws(seqidno:61)的实施方式中，该序列可以包含在更大的序列ggsfsgyyws(seqidno:52)内。
抗体或抗原结合片段可以包含含有以下cdr的至少一个轻链可变区：
lc-cdr1:sgsssnignnyvs(seqidno:47)
lc-cdr2:gnnwrps(seqidno:48)
lc-cdr3:etwdsslsagv(seqidno:49)
抗体或抗原结合片段可以包含含有以下cdr的至少一个重链可变区：
hc-cdr1:ggsfsgyyws(seqidno:52),或
gyyws(seqidno:61)
hc-cdr2:einhsgstnynpslks(seqidno:53)
hc-cdr3:gyvagfdy(seqidno:54)
抗体可以包含含有cdr的至少一个轻链可变区，如图1或图3所示。抗体可以包含含有cdr的至少一个重链可变区，如图2或3所示。
抗体可以包含至少一个轻链可变区(vl)，其包含seqidno45,46,47,48,49之一的氨基酸序列，或图1所示的氨基酸序列之一，或与seqidno45,46,47,48,49之一或图1所示vl链氨基酸序列的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
抗体可以包含至少一个重链可变区(vh)，其包含seqidno50,51,52或61,53,54之一的氨基酸序列，或图2所示的氨基酸序列之一，或与seqidno50,51,52或61,53,54之一或图2所示vh链氨基酸序列的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
抗体可以包含至少一个轻链可变区和至少一个重链可变区，轻链可变区包含seqidno45,46,47,48,49之一的氨基酸序列，或图1所示的氨基酸序列之一(或与seqidno45,46,47,48,49之一或图1所示vl链氨基酸序列的氨基酸序列之一具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列)，重链可变区包含seqidno50,51,52或61,53,54之一的氨基酸序列，或图2所示的氨基酸序列之一(或与seqidno50,51,52或61,53,54之一或图2所示vh链氨基酸序列的氨基酸序列之一具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列)。
抗体可以任选结合tim-3。抗体可以任选地具有如上所述的氨基酸序列组分。抗体可以是igg。在一个实施方式中，提供了包含与tim-3结合的本文所述的抗体或抗原结合片段的任选分离的体外复合物。
在本发明的一个方面，提供分离的重链可变区多肽，所述重链可变区多肽包含以下cdr：
hc-cdr1:ggsfsgyyws(seqidno:52),或
gyyws(seqidno:61)
hc-cdr2:einhsgstnynpslks(seqidno:53)
hc-cdr3:gyvagfdy(seqidno:54)
在本发明的一个方面，提供抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含重链和轻链可变区序列，其中：
重链包含分别与ggsfsgyyws(seqidno:52)或gyyws(seqidno:61),einhsgstnynpslks(seqidno:53),gyvagfdy(seqidno:54)具有至少85％总体序列同一性的hc-cdr1,hc-cdr2,hc-cdr3，和轻链包含分别与sgsssnignnyvs(seqidno:47),gnnwrps(seqidno:48),etwdsslsagv(seqidno:49)具有至少85％总体序列同一性的lc-cdr1，lc-cdr2，lc-cdr3。
在一些实施方式中，序列同一性程度可以是86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
在本发明的另一方面，提供任选分离的抗体或抗原结合片段，其包含重链和轻链可变区序列，其中：
重链序列与重链序列：seqidno：50或51具有至少85％的序列同一性；和
轻链序列与轻链序列：seqidno：45或46具有至少85％的序列同一性。
在一些实施方式中，序列同一性程度可以是86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
在一些实施方式中，抗体、抗原结合片段或多肽还包含在cdr之间的可变区重链框架序列，按照hcfr1:hc-cdr1:hcfr2:hc-cdr2:hcfr3:hc-cdr3:hcfr4排列。框架序列可以源自人共识框架序列。
在本发明的一个方面，提供分离的轻链可变区多肽，任选地与本文所述的重链可变区多肽组合，所述轻链可变区多肽包含以下cdr：
lc-cdr1:sgsssnignnyvs(seqidno:47)
lc-cdr2:gnnwrps(seqidno:48)
lc-cdr3:etwdsslsagv(seqidno:49)
在一些实施方式中，抗体、抗原结合片段或多肽还包含在cdr之间的可变区轻链框架序列，按照lcfr1:lc-cdr1:lcfr2:lc-cdr2:lcfr3:lc-cdr3:lcfr4排列。框架序列可以源自人共识框架序列。
在一些实施方式中，抗体或抗体结合片段还包含人不变区。例如，选自igg1、igg2、igg3和igg4之一。
在一些实施方式中，抗体或抗体结合片段还包含鼠不变区。例如，选自igg1、igg2a、igg2b和igg3之一。
在本发明的另一方面，提供任选分离的抗体或抗原结合片段，其能结合tim-3且是双特异性抗体或双特异性抗原结合片段。在一些实施方式中，双特异性抗体或双特异性抗原结合片段包含如文本所述能结合tim-3的抗原结合片段或多肽，此外包含能结合另一靶蛋白如非tim-3的靶蛋白的抗原结合域。在一些实施方式中，靶蛋白是细胞表面受体。在一些实施方式中，靶蛋白是免疫细胞如t细胞的细胞表面上表达的细胞表面受体。在一些实施方式中，能结合另一靶蛋白的抗原结合域能够结合t细胞受体(tcr)复合物或其组分。在一些实施方式中，抗原结合域能够结合cd3或cd3多肽。在一些实施方式中，抗原结合域能够结合cds多肽cd3γ,cd3δ,cd3ζ或cd3ε的一个或多个。在一些实施方式中，双特异性抗体是双特异性t细胞衔接器抗体。在一些实施方式中，靶蛋白可以是cd28家族成员。在一些实施方式中，cd28家族成员选自：pd-1,lag3,icos,ctla4,btla或cd28。
在本发明的另一方面，提供组合物，如药物组合物或药物。组合物可以包含本文所述的抗体、抗原结合片段或多肽和至少一种药学上可接受的载体、赋形剂、佐剂或稀释剂。
在本发明的另一方面，提供编码本文所述的抗体、抗原结合片段或多肽的分离的核酸。核酸可以具有seqidno：35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、55、56或57(图4)之一的序列或者具有退化的编码序列作为遗传密码的结果，或者可以具有与其相具有至少为70％同一性的核苷酸序列，任选75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
在本发明的一个方面，提供了包含本文所述的核酸的载体。在本发明的另一方面，提供包含载体的宿主细胞。例如，宿主细胞可以是真核生物的，或哺乳动物的，例如中国仓鼠卵巢(cho)，或人类的；或可以是原核细胞，例如大肠杆菌e.coli。在本发明的一个方面，提供制备本文所述的抗体或抗原结合片段或多肽的方法，所述方法包括在适于表达编码抗体或抗原结合片段或多肽的载体的条件下培养本文所述的宿主细胞，并回收抗体或抗原结合片段或多肽。
在本发明的另一方面，提供抗体、抗原结合片段或多肽用于治疗或医疗方法。在本发明的另一方面，提供本文所述的抗体、抗原结合片段或多肽用于治疗癌症或t细胞功能障碍性疾病。在本发明的另一方面，提供了本文所述的抗体、抗原结合片段或多肽在制备用于治疗癌症或t细胞功能障碍性病症的药物或药物组合物中的用途。
在另一方面，提供体外或体内杀死表达tim-3的细胞的方法，所述方法包括将如本文所述的抗体、抗原结合片段或多肽施用于表达(或过表达)tim-3的细胞。细胞可以是癌细胞，例如白血病或急性骨髓性白血病细胞，白细胞或t细胞。在一些实施方式中，急性骨髓性白血病细胞可以是干细胞；例如，在一些实施方式中，急性骨髓性白血病细胞可以是cd34+。
在本发明的另一方面，提供增强t细胞功能的方法，其包括将本文所述的抗体、抗原结合片段或多肽施用于功能失调的t细胞。该方法可以在体外或体内进行。
在本发明的另一方面，提供治疗癌症或t细胞功能障碍或感染性疾病的方法，所述方法包括向患有癌症或t细胞功能障碍的患者施用本文所述的抗体、抗原结合片段或多肽。
在本发明的另一方面，提供了治疗感染性疾病的方法，所述方法包括向患有感染性疾病的患者施用如本文所述的抗体、抗原结合片段或多肽。
在本发明的另一方面，提供了调节对象免疫应答的方法，所述方法包括向对象施用如本文所述的抗体、抗原结合片段或多肽，以调节对象的免疫应答。
在本发明的另一方面，提供了一种抑制对象中肿瘤细胞生长的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的如本文所述的抗体、抗原结合片段或多肽。
在本发明的另一方面，提供了一种方法，所述方法包括将包含或疑似含有tim-3的样品与本文所述的抗体或抗原结合片段接触，并检测抗体、或抗原结合片段与tim-3的复合物的形成。
在本发明的另一方面，提供了一种诊断对象的疾病或病症的方法，所述方法包括在体外使来自对象的样品与本文所述的抗体或抗原结合片段接触，并检测抗体或抗原结合片段和tim-3的复合物形成。
本发明的一个方面是选择患者以用tim3信号调节剂如抗tim3抗体或抗tim3剂进行治疗的方法，所述方法包括在体外将来自对象的样品与本文所述的抗体或抗原结合片段接触，并检测抗体或抗原结合片段和tim-3的复合物的形成。
在本发明的另一方面，提供了选择或分选对象用于tim-3信号传导调节剂治疗的方法，所述方法包括在体外将来自对象的样品与本发明的抗体或抗原结合片段接触，并检测抗体或抗原结合片段和tim-3的复合物的形成。
在本发明的另一方面，提供了本文所述的抗体或抗原结合片段用于体外检测tim-3的用途。在本发明的另一方面，提供了如本文所述的抗体或抗原结合片段作为体外诊断试剂的用途。
在本发明的另一方面，提供了扩增t细胞群的方法，其中t细胞在体外或离体与本发明的抗体、抗原结合片段或多肽接触。
在本发明的另一方面，提供了治疗患有t细胞功能障碍病症的对象的方法，所述方法包括在本发明抗体、抗原结合片段或多肽存在下培养由对象血液样品获得的t细胞，以扩增t细胞群、收集扩增的t细胞并将扩增的t细胞施用于需要治疗的对象。
在本发明的方法中，可以提供抗体、抗原结合片段或多肽作为本文所述的组合物。
在一些实施方式中，抗体可以是克隆a3、b10、g6、g7、g9、a11或a11_gi之一。
发明详述
抗体
本发明的抗体优选结合于tim-3(抗原)，优选人或恒河猴tim-3，任选地以0.1至2nm的kd结合。
在本发明的任何方面，抗体优选特异性结合tim-3(例如人或恒河猴)。
本发明的抗体可以以分离的形式提供。
本发明的抗体可以显示出以下性质中的至少一种：
a)以1μm或更低，优选≤1μm、≤100nm、≤10nm、≤1nm或≤100pm)的kd结合人tim-3；
b)对表达tim-3的细胞具有细胞毒性(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，adcc)，如表达tim-3的急性骨髓性白血病细胞；
c)增进混合淋巴细胞反应(mlr)测定中的t细胞增殖(例如参见bromelow等人j.immunolmethods，2001.1.1；247(1-2):1-8)；
d)增进mlr测定中的干扰素-γ产生；或
e)增进mlr测定中白介素-2(il-2)分泌。
“抗体”，包括其片段或衍生物，或合成抗体或合成抗体片段。
鉴于单克隆抗体技术相关的目前技术，可以制备出大多数抗原的抗体。抗原结合部分可以是抗体(例如fab片段)或合成抗体片段(例如单链fv片段[scfv])的一部分。针对所选抗原的合适的单克隆抗体可以通过已知技术制备，例如在“单克隆抗体：技术手册(monoclonalantibodies：amanualoftechniques)”，hzola(crc出版社，1988)和“单克隆杂交抗体：技术和应用(monoclonalhybridomaantibodies：techniquesandapplications)”，jgrhurrell(crc出版社，1982)中描述的那些。neuberger等人(1988,8thinternationalbiotechnologysymposium部分2，792-799)讨论了嵌合抗体。
单克隆抗体(mab)可用于本发明的方法，并且是特异性靶向抗原上单个表位的抗体的均质群体。
多克隆抗体可用于本发明的方法。单特异性多克隆抗体是优选的。可以使用本领域熟知的方法制备合适的多克隆抗体。
抗体的抗原结合片段，例如fab和fab2片段也可以与遗传工程改造的抗体和抗体片段一起使用/提供。抗体的可变重(vh)和可变轻(vl)结构域参与抗原识别，这一事实首先通过早期蛋白酶消化实验来识别。通过啮齿动物抗体的“人源化”进一步确认。啮齿动物来源的可变结构域可以融合到人源的恒定结构域，使得所得抗体保留啮齿动物亲本抗体的抗原特异性(morrison等(1984)proc.natl.acad.sci.usa81,6851-6855)。
该抗原特异性由可变结构域赋予并且独立于恒定结构域，这是从涉及抗体片段的细菌表达实验中得知的，所述抗体片段全部含有一个或多个可变结构域。这些分子包括fab样分子(better等人(1988)科学(science)240,1041)、fv分子(skerra等人(1988)科学(science)240,1038)、单链fv(scfv)分子，其中vh和vl配对域通过柔性寡肽连接(bird等人(1988)science242,423；huston等(1988)proc.natl.acad.sci.usa85，5879)和包含分离的v结构域的单结构域抗体(dab)(ward等人(1989)自然(nature)341,544)。参与合成保留其特异性结合位点的抗体片段的技术的一般综述可在winter和milstein(1991)自然(nature)349,293-299中找到。
“scfv分子”是指vh和vl配对结构域共价连接(如通过柔性寡肽)的分子。
fab，fv，scfv和dab抗体片段都可以在大肠杆菌中表达和分泌，从而允许容易地产生大量的所述片段。
全抗体和f(ab')2片段是“二价的”。“二价的”是指所述抗体和f(ab')2片段具有两个抗原结合位点。相比之下，fab、fv、scfv和dab片段是单价的，仅具有一个抗原结合位点。与tim-3结合的合成抗体也可以使用本领域熟知的噬菌体展示技术来制备。
本发明的方面包括双特异性抗体，例如，由两种不同抗体的两个不同片段组成，使得双特异性抗体结合两种类型的抗原。抗原之一是tim-3，双特异性抗体包含与tim-3结合的本文所述的片段。抗体可以含有对第二抗原具有亲和力的不同片段，其可以是任何所需的抗原，例如已经用于癌症免疫治疗以结合细胞毒性细胞的cd3，募集并将其靶向于肿瘤部位。用于制备双特异性抗体的技术是本领域公知的，例如，参见mueller，d等人(2010生物药物(biodrugs)24(2)：89-98)，wozniak-knoppg等，(2010蛋白质工程设计(proteinengdes)23(4)：289-297。baeuerle，pa等人，(2009癌症研究(cancerres)69(12)：4941-4944)。
因此，本发明提供能够与tim-3结合并且是双特异性抗体或双特异性抗原结合片段的抗体或抗原结合片段。在一些实施方式中，可以分离双特异性抗体或双特异性抗原结合片段。
在一些实施方式中，双特异性抗体和双特异性抗原结合片段包含根据本发明的抗原结合片段或多肽。在一些实施方式中，双特异性抗体和双特异性抗原结合片段包含能够结合tim-3的抗原结合结构域，其中能够结合tim-3的抗原结合结构域包含或由本发明的抗原结合片段或多肽构成。
在一些实施方式中，双特异性抗体和双特异性抗原结合片段包含能够结合tim-3的抗原结合结构域和能够结合另一靶蛋白的抗原结合结构域。
能够结合另一个靶蛋白的抗原结合结构域能够结合tim-3以外的另一蛋白质。在一些实施方式中，靶蛋白是细胞表面受体。在一些实施方式中，靶蛋白是在免疫细胞的细胞表面上表达的细胞表面受体。在一些实施方式中，靶蛋白是在t细胞的细胞表面上表达的细胞表面受体。
在一些实施方式中，能够结合另一个靶蛋白的抗原结合结构域可以结合t细胞受体(tcr)复合物或其组分。在一些实施方式中，抗原结合结构域能够结合cd3或cd3多肽。在一些实施方式中，抗原结合结构域可以有能力结合cd3多肽cd3γ，cd3δ，cd3ζ或cd3ε中的一个或多个。在一些实施方式中，双特异性抗体是双特异性t细胞衔接器抗体。
在一些实施方式中，双特异性抗体或片段能够引导针对tim-3表达细胞的t细胞活性(例如细胞毒活性)。也就是说，在一些实施方式中，在双特异性抗体或片段的存在下，针对tim-3表达细胞的t细胞活性(例如细胞毒活性)增加(例如，相对于在不存在双特异性抗体或片段时针对tim-3表达细胞的活性)。可以通过本领域技术人员熟知的方法在体外测定针对tim-3表达细胞的t细胞活性，例如如本文所述通过培育t细胞和tim-3表达细胞并检测细胞裂解。
在一些实施方式中，双特异性抗体以两个单链可变片段(scfv)形式的融合蛋白而提供，其包含本发明tim-3结合抗体或抗体片段的vh和vl，抗体或抗体片段的vh和vl能够结合cd3或cd3多肽。
在一些实施方式中，cd3或cd3多肽的抗原结合结构域可以包含如抗cd3抗体克隆okt3(e生物科学“ebioscience”)、克隆cd3-12(abdserotec)、克隆ucht1(南方生物技术southernbiotech)克隆sp7(赛默科技皮尔斯抗体thermoscientificpierceantibodies)、克隆spv-t3b(赛默飞世尔科技thermofisherscientific)、克隆s4.1(7d6)(赛默飞世尔科技thermofisherscientific)、克隆mem-57(abdserotec)、克隆37895(美天旎生物技术miltenyibiotec)、克隆ca-3(艾博抗abcam)、克隆4d10a6(abbiotec)、克隆hit3a(abbiotec)、克隆lt3(源生物科学sourcebioscience)、克隆b-b11(mybiosource.com)、克隆17a2(诺伟司生物制品novusbiologicals)、克隆bc3(生物传奇biolegend)、克隆ham25-1352(mbl国际)、克隆ca-3(bosterbio)、克隆rbt-cd3(生命生物科学lifespanbiosciences)、ham25-1157(默克密理博)、克隆cris-7(半岛实验室国际peninsulalaboratoriesinternational)、克隆5b2、克隆2q1160(圣诞科鲁兹生物技术santacruzbiotechnology)、克隆m01、克隆b1.1(亚诺法公司abnovacorporation)、克隆ep449e(biogenex)、克隆6b8d1g5、克隆6b1c12f3(赛诺生物sinobiological)、克隆cl1297(阿特拉斯抗体atlasantibodies)、克隆cc23(c创新诊断reativediagnostics)、克隆tr66(恩佐生命科学enzolifesciences)、克隆mem-92(西达连cedarlane)、克隆epr4516(奥瑞技术origenetechnologies)、克隆3a12h2(蛋白技术组proteintechgroup)、克隆33-2a3(alpco)、克隆e272(保科医学biocaremedical)、克隆sp162、克隆mrq-39(西格玛奥德里奇sigmaaldrich)或克隆f7.2.38(达科dako)的其他cd3-或cd3多肽-结合片段、轻和重链可变结构域或cdr。
在一些实施方式中，靶蛋白可以是cd28家族成员。在一些实施方式中，靶蛋白可以是cd28家族成员，例如pd-1(cd279)、lag3(cd223)、icos(cd278)、ctla4(cd152)、btla(cd272)或cd28。
在一些具体实施方式中，双特异性抗体或双特异性抗原结合片段包含能够结合cd3或cd3多肽的抗原结合结构域，包含在cdr，轻链和重链可变结构域或本文所述的克隆a11或克隆b10的其它tim-3结合片段的能够结合tim-3的抗原结合结构域。
在一些实施方式中，本发明的双特异性抗体可以表现出以下性质中的至少一种：
a)增进或增强tim-3表达细胞(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，adcc)，例如表达tim-3的急性骨髓性白血病细胞的细胞杀伤(例如t细胞介导的细胞杀伤)；
b)增进或增强表达tim-3的干细胞(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，adcc)，例如表达tim-3的、cd34+急性骨髓性白血病细胞的细胞杀伤(例如t细胞介导的细胞杀伤)。
在一些实施方式中，pd-1的抗原结合结构域可以包含例如抗pd-1抗体克隆j116、克隆mih4(ebioscience)、克隆7a11b1(罗克兰免疫化学公司rocklandimmunochemicalsinc.)、克隆192106(研发系统r&dsystems)、克隆j110、克隆j105(mbl国际mblinternational)、克隆12a7d7、克隆7a11b1(abbiotec)、克隆#9x21(mybiosource.com)、克隆4h4d1(proteintechgroup)、克隆d3w4u、克隆d3o4s(细胞信号转导技术cellsignalingtechnology)、克隆rmp1-30、克隆rmp1-14(默克密理博merckmillipore)、克隆eh12.2h7(biolegend)、克隆10b1227(美国生物unitedstatesbiological)、克隆umab198或克隆umab197(傲锐基因技术origenetechnologies)的其它pd-1结合片段、轻和重链可变结构域或cdr。在一些实施方式中，lag3的抗原结合结构域包含如抗-lag3抗体clone17b4(enzolifesciences),clone333210(r&dsystems)或clone14l676(美国生物unitedstatesbiological)的其它lag3结合片段、轻和重链可变结构域或cdr。在一些实施方式中，icos的抗原结合结构域包含如抗-icos抗体克隆isa-3(ebioscience)、克隆sp98(novusbiologicals)、克隆1g1、克隆3g4(abnovacorporation)、克隆669222(r&dsystems)、克隆tq09(creativediagnostics)或克隆c398.4a(biolegend)的其他icos结合片段、轻和重链可变结构域或cdr。在一些实施方式中，ctla4的抗原结合结构域包含如抗-ctla4抗体克隆2f1、克隆1f4(abnovacorporation)、克隆9h10(emdmillipore)、克隆bnu3(genetex)、克隆1e2、克隆as32(lifespanbiosciences)、克隆a3.4h2.h12(acrisantibodies)、克隆060(sinobiological)、克隆bu5g3(creativediagnostics)、克隆mih8(mblinternational)、克隆a3.6b10.g1或克隆l3d10(biolegend)的其他ctla4结合片段、轻和重链可变结构域或cdr。在一些实施方式中，btla的抗原结合结构域包含如抗-btla抗体克隆1b7、克隆2g8、克隆4c5(abnovacorporation)、克隆4b8(antibodies-online)、克隆mih26(thermoscientificpierceantibodies)、克隆umab61(origenetechnologies)、克隆330104(r&dsystems)、克隆1b4(lifespanbiosciences)、克隆440205、克隆5e7(creativediagnostics)的其他btla结合片段、轻和重链可变结构域或cdr。在一些实施方式中，cd28的抗原结合结构域包含如抗-cd28抗体克隆cd28.6(ebioscience)、克隆cd28.2、克隆jj319(novusbiologicals)、克隆204.12、克隆b-23、克隆10f3(thermoscientificpierceantibodies)、克隆37407(r&dsystems)、克隆204-12(abnovacorporation)、克隆15e8(emdmillipore)、克隆204-12、克隆yth913.12(abdserotec)、克隆b-t3(acrisantibodies)、克隆9h6e2(sinobiological)、克隆c28/77(mybiosource.com)、克隆kolt-2(alpco)、克隆152-2e10(santacruzbiotechnology)或克隆xph-56(creativediagnostics)的其他cd28结合片段、轻和重链可变结构域或cdr。
根据本发明的双特异性抗体或双特异性抗原结合片段的抗原结合结构域可以是能够结合抗原的多肽的任何结构域。在一些实施方式中，抗原结合结构域至少包含三个轻链cdr(即lc-cdr1，lc-cdr2和lc-cdr3)和三个重链cdr(即hc-cdr1，hc-cdr2和hc-cdr3)共同限定抗体或抗原结合片段的抗原结合区。在一些实施方式中，抗原结合结构域可以包含抗体或抗原结合片段的轻链可变结构域和重链可变结构域。在一些实施方式中，抗原结合结构域可以包含抗体或抗原结合片段的轻链多肽和重链多肽。
根据本发明的双特异性抗体和双特异性抗原结合片段可以以任何合适的形式提供，例如kontermannmabs2012,4(2):182-197中所述的那些形式，其全部内容通过引用并入本文。例如，双特异性抗体或双特异性抗原结合片段可以是双特异性抗体缀合物(例如igg2、f(ab’)2或covx-体)、双特异性igg或igg样分子(例如igg、scfv4-ig、igg-scfv、scfv-igg、dvd-ig、igg-svd、svd-igg、二合一igg、mab2或tandemab通用lc)、不对称双特异性igg或igg样分子(例如kihigg、kihigg通用lc、crossmab、kihigg-scfab、mab-fv、电荷对或seed体)、小双特异性抗体分子(例如，双特异抗体(db)、dsdb、dart、scdb、tandabs、串联scfv(tafv)、串联dab/vhh、三重体、三重头、fab-scfv或f(ab’)2-scfv2)、双特异性fc和ch3融合蛋白(例如tafv-fc，di-双抗体、scdb-ch3、scfv-fc-scfv、hcab-vhh、scfv-kih-fc或scfv-kih-ch3)或双特异性融合蛋白(例如scfv2-白蛋白、scdb-白蛋白、tafv-毒素、dnl-fab3、dnl-fab4-igg、dnl-fab4-igg-细胞因子2)。特别参见kontermannmabs2012,4(2):182-19的图2。
技术人员能够设计和制备根据本发明的双特异性抗体和双特异性抗原结合片段。
用于产生双特异性抗体的方法包括抗体或抗体片段的化学交联，例如采用可还原的二硫键或不可还原的硫醚键，例如segal和bast，2001中所述。双特异性抗体的生产(productionofbispecificantibodies).目前的免疫学方案(currentprotocolsinimmunology).14:iv:2.13:2.13.1–2.13.16，其全部内容通过引用并入本文。例如，n-琥珀酰亚胺基-3-(-2-吡啶基二硫代)丙酸酯(spdp)可用于化学交联，如fab片段，通过铰链区sh-基团，以产生二硫键连接的双特异性f(ab)2异二聚体。
用于产生双特异性抗体的其它方法包括融合产生抗体的杂交瘤，例如与聚乙二醇一起制备能够分泌双特异性抗体的四价体瘤细胞，例如d.m.和bast，b.j.2001.双特异性抗体的生产(productionofbispecificantibodies).目前的免疫学方案(currentprotocolsinimmunology).14：iv：2.13：2.13.1-2.13.16。
根据本发明的双特异性抗体和双特异性抗原结合片段也可以通过从例如，编码抗原结合分子多肽的核酸构建体表达重组生产，例如，如抗体工程：方法和方案(antibodyengineering:methodsandprotocols)，第二版(humana出版，2012)，第40章：双特异性抗体的生产：双抗体和串联scfv(hornig和
例如，编码两个抗原结合结构域的轻链和重链可变结构域(即，能够结合tim-3的抗原结合结构域的轻链和重链可变结构域，以及能够结合另一个靶蛋白的抗原结合结构域的轻链和重链可变结构域)，并且包括编码抗原结合结构域之间的合适连接子或二聚化结构域的序列的dna构建体可以通过分子克隆技术制备。此后可以通过在合适的宿主细胞(例如哺乳动物宿主细胞)中表达(例如体外)构建体来产生重组双特异性抗体，然后任选地纯化表达的重组双特异性抗体。
本发明的抗体，抗原片段或多肽也可用于构建嵌合抗原受体(car；也称为人工t细胞受体)，其中通过重组技术将受体工程化以将选定的特异体移植到免疫细胞上，例如，单特异性克隆抗体可以接入到t细胞上，并且修饰的t细胞可用于治疗疾病，例如，癌症。car的一种形式是融合的scfv，包含本发明的抗体、抗原结合片段或多肽其与合适的受体支架的跨膜和内部结构域的融合。产生car的技术描述于pule，m等人(2003细胞疗法“cytotherapy”5(3):211–26)中。
抗体可以通过亲和力成熟的过程产生，其中产生与未修饰的亲本抗体相比抗体对抗原的亲和力有改善的经修饰的抗体。亲和力成熟抗体可以通过本领域已知的方法生产，例如marks等人,rio/technology10:779-783(1992)；barbas等人procnat.acad.sci.usa91:3809-3813(1994)；schier等人.基因“gene”169:147-155(1995)；yelton等人j.immunol.155:1994-2004(1995)；jackson等人.,j.immunol.154(7):3310-159(1995)；和hawkins等人,j.mol.biol.226:889-896(1992)。
本发明的抗体优选表现出与tim-3的特异性结合。特异性结合靶分子的抗体优选以更高的亲和力和/或具有比其结合于其它靶标的更长的持续时间结合靶标。在一个实施方式中，抗体与无关靶标的结合程度小于例如通过elisa或放射免疫测定(ria)测量的抗体与靶标的结合的约10％。或者，结合特异性可以反映在结合亲和力方面，其中本发明的抗tim-3抗体与tim-3结合的kd比抗体对另一靶分子，如tim-3家族的另一成员的kd大至少0.1个数量级(即0.1×10n，其中n为表示数量级的整数)。这可以任选地为至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5或2.0中的一个。
本发明的抗体优选具有≤1μm，≤100nm，≤10nm，≤1nm或≤100pm之一的解离常数(kd)。抗体对其靶标的结合亲和性通常以其解离常数(kd)来描述。结合亲和力可以通过本领域已知的方法，例如通过表面等离子体共振(spr)或通过用fab版本的抗体和抗原分子进行的放射性标记的抗原结合测定(ria)来测量。
本发明的抗体可以是抑制或降低其结合抗原的生物活性的“拮抗剂”抗体。阻断tim-3有助于通过抑制由tim-3介导的免疫抑制信号通路来恢复t细胞功能。
在一些方面，抗体是克隆a3或a3的变体。a3包含以下cdr序列：
轻链：
lc-cdr1:rasqdigsyla(seqidno:6)
lc-cdr2:aastlqs(seqidno:7)
lc-cdr3:qqsyssppt(seqidno:8)
重链：
hc-cdr1:gytftsyymh(seqidno:24),或
syymh(seqidno:58)
hc-cdr2:iinpsggstsyaqkfqg(seqidno:25)
hc-cdr3:spgvvtalfdy(seqidno:26)
通过卡巴特(kabat)定义测定cdr序列。
在一些方面，抗体是克隆b10或b10的变体。b10包含以下cdr序列：
轻链：
lc-cdr1:rasqsvgsyla(seqidno:9)
lc-cdr2:datnrat(seqidno:10)
lc-cdr3:qhrrt(seqidno:11)
重链：
hc-cdr1:ggsigssdyywg(seqidno:27),或
ssdyywg(seqidno:59)
hc-cdr2:siyysgstyynpslks(seqidno:28)
hc-cdr3:gehrgefdy(seqidno:29)
通过卡巴特(kabat)定义测定cdr序列。
在一些方面，抗体是克隆g6或g6的变体。g6包含以下cdr序列：轻链：
lc-cdr1:rssqsllhsngynyld(seqidno:12)
lc-cdr2:lgsnras(seqidno:13)
lc-cdr3:mqgthwppt(seqidno:14)
重链：
hc-cdr1:ggsisssnwws(seqidno:30),或
ssnwws(seqidno:60)
hc-cdr2:eiyhsgstnynpslks(seqidno:31)
hc-cdr3:vvavagtvdy(seqidno:32)
通过卡巴特(kabat)定义测定cdr序列。
在一些方面，抗体是克隆g7或g7的变体。g7包含以下cdr序列：
轻链：
lc-cdr1:rasqsvsssyla(seqidno:15)
lc-cdr2:gassrat(seqidno:16)
lc-cdr3:qqygsspit(seqidno:17)
重链：
hc-cdr1:gytftsyymh(seqidno:24),或
syymh(seqidno:58)
hc-cdr2:iinpsggstsyaqkfqg(seqidno:25)
hc-cdr3:dqyssgwyyygmdv(seqidno:33)
通过卡巴特(kabat)定义测定cdr序列。
在一些方面，抗体是克隆g9或g9的变体。g9包含以下cdr序列：轻链：
lc-cdr1:rasqsvsssyla(seqidno:15)
lc-cdr2:gassrat(seqidno:16)
lc-cdr3:qqygsspit(seqidno:17)
重链：
hc-cdr1:gytftsyymh(seqidno:24),或
syymh(seqidno:58)
hc-cdr2:iinpsggstsyaqkfqg(seqidno:25)
hc-cdr3:dlysygfyyygmdv(seqidno:34)
通过卡巴特(kabat)定义测定cdr序列。
在一些方面，抗体是克隆a11或克隆a11_gi，或a11或a11_gi的变体。a11和a11_gi各个包含以下cdr序列：
轻链：
lc-cdr1:sgsssnignnyvs(seqidno:47)
lc-cdr2:gnnwrps(seqidno:48)
lc-cdr3:etwdsslsagv(seqidno:49)
重链：
hc-cdr1:ggsfsgyyws(seqidno:52),或
gyyws(seqidno:61)
hc-cdr2:einhsgstnynpslks(seqidno:53)
hc-cdr3:gyvagfdy(seqidno:54)
通过卡巴特(kabat)定义测定cdr序列。
本发明的抗体可以分别包含a3、b10、g6、g7、g9、a11、a11_gi之一或seqidno：6、7、8、24或58、25、26或9、10、11、27或59、28、29或12、13、14、30或60、31、32或15、16、17、24或58、25、33或15、16、17、24或58、25、34,或47、48、49、52或61、53、54之一的cdr。在本发明的抗体中，六个cdr序列中的一个或两个或三个或四个可以变化。变体可以在六个cdr序列的一个或两个中具有一个或两个氨基酸替换。
抗tim-3克隆的vh和vl链的氨基酸序列示于图1和图2。编码核苷酸序列示于图4。
轻链和重链cdr也可以特别用于与许多不同框架区结合使用。因此，具有lc-cdr1-3或hc-cdr1-3的轻链和/或重链可以具有替代的框架区。合适的框架区域在本领域中是众所周知的，例如在m.lefranc和g.le:franc(2001)“免疫球蛋白丛书theimmunoglobulinfactsbook”，学术出版社(academicpress)中被描述，其通过引用并入本文。
在本说明书中，抗体可以具有vh和/或vl链，其包含与seqidno1,2,3,4,5,19,20,21,22,23,45,46,50,51的vh和/或vl氨基酸序列或图1和2所示的氨基酸序列之一具有高百分比序列同一性的氨基酸序列。
例如，本发明的抗体包括结合tim-3并具有vh或vl链的抗体，vh或vl链包含与图1和图2所述的氨基酸序列之一或seqidno：1、2、3、4、5、19、20、21、22、23、45、46、50、51之一的vh或vl链氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的氨基酸序列。
本发明的抗体可以被可检测地标记或至少能够检测。例如，抗体可以用放射性原子或有色分子或荧光分子或可以以任何其它方式容易被检测的分子进行标记。合适的可检测分子包括荧光蛋白，荧光素酶，酶底物和放射性标记。结合部分可以用可检测标记直接标记，或者可以间接标记。例如，结合部分可以是未标记的抗体，其可以被自身标记的另一抗体检测。或者，第二抗体可能与其结合生物素，并且将标记的链霉亲和素与生物素的结合用于间接标记第一抗体。
检测方法
本文所述的抗体或抗原结合片段可用于涉及抗体或抗原结合片段与tim-3结合的方法。这样的方法可能涉及检测抗体或抗原结合片段与tim-3的结合复合物。因此，在一个实施方式中，提供了一种方法，所述方法包括将含有或怀疑含有tim-3的样品与本文所述的抗体或抗原结合片段接触并检测抗体或抗原结合片段和tim-3的复合物的形成。
合适的方法模式在本领域中是众所周知的，包括免疫测定，例如夹心测定法，elisa。该方法可以包括将抗体或抗原结合片段或tim-3或两者用可检测标记，例如，荧光，发光或放射标签进行标记。
这种方法可以提供需要tim-3检测和或定量的疾病或病症的诊断方法的基础。这样的方法可以在体外在患者样品上进行，或者在处理患者样品之后进行。一旦收集样品，就不需要患者存在用于进行体外诊断的方法，因此该方法可以是不实施在人体或动物体上的方法。
这样的方法可以涉及确定患者样品中存在的tim-3的量。该方法还可以包括将确定的量与标准或参考值进行比较，作为达到诊断的过程的一部分。其他诊断测试可以与本文所述的相结合，以增强诊断或预后的准确性，或对通过使用本文所述的测试获得的结果进行确认。
存在于患者样品中的tim-3的水平可以指示患者可能对抗tim-3抗体的治疗作出反应。样品中存在高水平的tim-3可用于选择患者用抗tim-3抗体治疗。因此，本发明的抗体可用于选择患者进行抗tim-3治疗。
在tim-3样品中的检测可以用于诊断患者的t细胞功能障碍或癌性病症，诊断患癌性病症的倾向或提供癌性病症的预后(预测)。诊断或预后可能涉及可能是良性或恶性的现有(先前诊断的)癌性病症，其可能涉及疑似癌性病症，或可能涉及患者(可能以前未被诊断的)癌性病症的筛查。
在一个实施方式中，可以检测cd8+t细胞上tim-3表达的水平，以便指示t细胞耗竭的程度和疾病状态的严重程度。在一些情况下，t细胞或肿瘤细胞上的tim-3表达水平可用于选择患者用tim3信号传导调节剂如抗tim3抗体或抗tim3试剂进行治疗。
样品可以从任何组织或体液中取出。样品可以包括或可以来源于：一定量的血液、来自个体血液的一定量的血清，其可能包含除去纤维蛋白凝块和血细胞后获得的血液的流体部分、组织样本或活检、或从所述个体分离的细胞。
根据本发明的方法优选在体外进行。术语“体外”旨在包括培养物中的细胞的实验，而术语“体内”旨在包括用完整的多细胞生物体的实验。
治疗应用
根据本发明的抗体、抗原结合片段和多肽以及包含此类试剂的组合物可用于医学治疗方法中。可以向患有需要治疗的疾病或病症的对象提供治疗。疾病或病症可以是t细胞功能障碍性疾病，包括与癌症相关的t细胞功能障碍性疾病、癌症或感染性疾病之一。
t细胞功能障碍性疾病可以是这样的疾病或病症，正常t细胞功能受损，导致对象对致病性抗原的免疫应答下调，例如，由外源性试剂如微生物、细菌和病毒的感染产生，或在某些疾病状态例如某些形式的癌症(例如以肿瘤相关抗原的形式)由宿主产生。
t细胞功能障碍可能包括t细胞耗竭或t细胞无反应性。t细胞耗竭包括cd8+t细胞对抗原刺激反应不能增殖或发挥t细胞效应子功能如细胞毒性和细胞因子(例如ifnγ)分泌的状态。耗尽的t细胞的特征还可能是持续上调tim-3，其中阻断tim-3：半乳凝素9相互作用可逆转t细胞衰竭并恢复抗原特异性t细胞应答。
t细胞功能障碍性疾病可能表现为感染，或无法对感染产生有效的免疫应答。感染可能是慢性的、持续的、潜伏的或缓慢的，可能是细菌、病毒、真菌或寄生虫感染的结果。因此，可以向患有细菌、病毒或真菌感染的患者提供治疗。细菌感染的实例包括感染幽门螺杆菌(helicobacterpylori)。病毒感染的例子包括感染艾滋病毒，乙型肝炎或丙型肝炎。
t细胞功能障碍性疾病可能与癌症相关，如肿瘤免疫逃逸。许多人类肿瘤表达能被t细胞识别并能诱导免疫应答的肿瘤相关抗原。然而，免疫逃避是常见的，并且被认为是由许多可溶性因子(包括半乳凝素9)介导的。因此，阻断tim-3和半乳凝素9的相互作用可以抑制对肿瘤细胞的这种负免疫调节信号并增强肿瘤特异性cd8+t细胞免疫。
也可以在没有t细胞功能障碍如t细胞耗竭迹象的情况下治疗癌症。本发明的抗体可能对表达tim-3的细胞具有细胞毒性，例如t细胞，例如耗尽的t细胞或癌细胞如急性骨髓性白血病细胞。因此，本文所述的抗体、抗原结合片段或多肽可用于涉及抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)或补体依赖性细胞毒性(cdc)的方法，或以招募免疫效应子功能以杀死靶细胞的任何方法，例如car细胞或靶向cd3的双特异性抗体。
本发明的抗体、抗原结合片段或多肽的使用允许或也可以允许对象抑制tim-3信号传导，并在有限的损伤，逃避或诱导肿瘤免疫逃逸的情况下发挥有效的免疫应答。在这种治疗中，抗体、抗原结合片段或多肽可以提供涉及预防肿瘤免疫逃逸发展的癌症治疗。
该治疗可以旨在预防t细胞功能障碍性疾病，例如，预防感染或癌症的发展或进展。因此，抗体、抗原结合片段和多肽可以用于配制药物组合物或药物，并且对象可以针对疾病状态的发展进行预防性治疗。这可能发生在疾病状态的症状发生之前，和/或可能被给予被认为具有更大的感染或癌症发展风险的对象。
治疗可以包括用疫苗共同治疗，例如，t细胞疫苗，可以涉及同时、单独或连续的治疗，或者在单一组合物中联合施用疫苗和抗体、抗原结合片段或多肽。在本文中，可以提供抗体、抗原结合片段或多肽作为疫苗的佐剂。耗竭t细胞的增殖潜力有限，这被认为是t细胞免疫治疗失败的主要原因，而能够阻断或逆转t细胞衰竭的药物的组合是提高t细胞免疫治疗功效的潜在策略(barber等人,自然nature,439卷,9期,682-687页,2006年2月)。
抗体、抗原结合片段或多肽的施用优选为以“治疗有效量”，这足以显示对个体的益处。给药的实际量、给药的速率和时间过程将取决于所治疗疾病的性质和严重程度。治疗的处方，例如关于剂量等的决定在全科医生和其他医生的责任范围内，并且通常考虑待治疗的病症、个体患者的状况、递送位置、给药方法以及从业者已知的其他因素。上述技术和方案的实例可以在remington的药物科学“pharmaceuticalsciences”,第20版,2000出版.lippincott，williams&wilkins。
制备药学上有用的组合物和药物
本发明的抗体、抗原结合片段和多肽可以配制成用于临床应用的药物组合物，并且可以包含药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或佐剂。
根据本发明，还提供了用于制备药学上有用的组合物的方法，这种制备方法可以包括选自以下的一个或多个步骤：分离本文所述的抗体、抗原结合片段或多肽；和/或将本文所述的分离的抗体、抗原结合片段或多肽与药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂或稀释剂混合。
例如，本发明的另一方面涉及配制或生产用于治疗t细胞功能障碍性疾病的药物或药物组合物的方法，所述方法包括通过将本文所述的抗体、抗原结合片段或多肽与药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂或稀释剂混合来配制药物组合物或药物。
感染
感染可以是任何感染或感染性疾病，例如细菌、病毒、真菌或寄生虫感染。在一些实施方式中，治疗慢性/持续性感染，例如，与t细胞功能障碍或t细胞衰竭相关这种感染是特别需要的。
已经确定，t细胞耗尽是许多慢性感染(包括病毒、细菌和寄生虫)以及癌症中出现的t细胞功能障碍的状态(wherry自然免疫学“natureimmunology”12卷，6期，492-499页，2011年6月)。
已经报道tim-3表达在患有慢性感染的患者中起重要的致病作用(例如，由golden-masonl等人,jvirol.2009；83(18):9122–9130报道)。
可以治疗的细菌感染的实例包括芽孢杆菌属(bacillusspp.)、百日咳博德特氏菌(bordetellapertussis)、梭菌属(clostridiumspp.)、棒状杆菌属(corynebacteriumspp.)、霍乱弧菌(vibriochloerae)、葡萄球菌属(staphylococcusspp.)链球菌属(streptococcusspp.)、埃希氏杆菌属(escherichia)、克雷伯菌(klebsiella)、变形杆菌(proteus)、耶尔森氏菌(yersinia)、欧式杆菌(erwina)、沙门氏菌(salmonella)、李斯特氏菌(listeriasp)、幽门螺杆菌(helicobacterpylori)、分枝杆菌(例如结核分枝杆菌mycobacteriumtuberculosis)和铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)。例如，细菌感染可能是败血症或结核病。
yao等(树突状细胞上pd-1阻碍了细菌感染的先天免疫“pd-1ondendriticcellsimpedesinnateimmunityagainstbacterialinfection”)，血液blood113(23):5811-58182009年6月4日)建立了pd-1在单核细胞增生李斯特单核菌(listeriamonocytogenes)感染的先天免疫反应中对dc功能的负调控。brahmamdam等人(延迟施用抗pd-1抗体逆转免疫功能障碍并改善败血症期间的存活率“delayedadministrationofanti-pd-1antibodyreversesimmunedysfunctionandimprovessurvivalduringsepsis”.白细胞生物学杂志(journalofleukocytebiology)88卷，2期233-240，2010年8月)报道了抗pd-1抗体施用于败血症24h后阻止了败血症引起的淋巴细胞和dc的消耗、增加了bcl-xl、阻断凋亡并改善生存。已报道tim3：半乳凝素-9相互作用介导t细胞衰竭并介导结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis)感染的先天和适应性免疫反应(jayaraman等，免疫学杂志“thejournalofimmunology”2012,188,70.6)。
可以治疗的病毒感染的实例包括流感病毒、麻疹病毒、乙型肝炎病毒(hbv)、丙型肝炎病毒(hcv)、人类免疫缺陷病毒(hiv)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lcmv)、单纯疱疹病毒和人乳头状瘤病毒。
慢性病毒感染，如由hcv、hbv和hiv引起的病毒感染通常涉及逃避免疫清除的机制。已经鉴定出pd-1和tim-3的表达与丙型肝炎病毒(hcv)的有缺陷的t细胞应答相关(mcmahan等人，临床调查杂志thejournalofclinicalinvestigation，第120卷，第12期，4546-4557页，2010年12月)。在hcv中，mcmahan等人(同上)发现，hcv特异性ctl上的tim-3和pd-1双重表达水平早于病毒持久性的发展，提供了预后信息。barber等人(自然“nature”439卷，9期，682-687页，2006年1月)报道，pd-1在慢性病毒感染期间被上调。在感染lcmv的小鼠中，他们报道，阻断pd-1/pd-l1抑制途径对cd8t细胞具有有益作用，恢复其进行增殖的能力、分泌细胞因子、杀死感染的细胞并降低病毒载量。pd-1也在hiv感染中上调(said等人，自然医学“naturemedicine”16卷，4期p452-460页2010年4月)。pd-1和pd-l1之间的阻断相互作用有助于慢性病毒感染动物模型中的病毒清除并改善t细胞功能(said等，同上)。
可以治疗的真菌感染的实例包括链格孢属(alternariasp)、曲霉属(aspergillussp)、假丝酵母属(candidasp)和组织胞浆菌属(histoplasmasp)感染。真菌感染可能是真菌败血症或组织胞浆菌病。
chang等人(阻断负共刺激分子pd-1和ctla-4改善了原发性和继发性真菌性败血症的存活“blockadeofthenegativeco-stimulatorymoleculespd-1andctla-4improvessurvivalinprimaryandsecondaryfungalsepsis”，危重病医学criticalcare2013,17：r85)报道抗pd1抗体对改善原发性和继发性真菌性败血症是高度有效的。lázár-molnár等人(pd-1/pd-l共刺激途径严重影响对病原真菌夹馍组织胞浆菌pnas宿主抑制“thepd-1/pd-lcostimulatorypathwaycriticallyaffectshostresistancetothepathogenicfungushistoplasmacapsulatumpnas”第105卷，第7期，第2658-2663页，2008年2月19日)报道，抗pd-1抗体显著增加感染荚膜组织胞浆菌(histoplasmacapsulatum)的小鼠的存活率。因此，t细胞衰竭在介导真菌感染中的重要性已经确立。可以治疗的寄生虫感染的实例包括疟原虫种类的感染(例如恶性疟原虫(plasmodiumfalciparum)，约里疟原虫(plasmodiumyoeli)，卵形疟原虫(plasmodiumovale)，间日疟原虫(plasmodiumvivax)或夏氏疟原虫(plasmodiumchabaudichabaudi))。寄生虫感染可能是一种疾病，如疟疾、利什曼病和弓形虫病。
人类恶性疟原虫(plasmodiumfalciparum)的感染已经显示导致t细胞耗尽小鼠和pd-1的更高表达(butler等人，自然免疫学natureimmunology13卷，12期，186-195页2012年2月)。使用抗pd-l1和抗lag-3单克隆抗体在体内阻断pd-l1和lag-3有助于cd4+t细胞功能的恢复，滤泡辅助t细胞、生发中心b细胞和浆细胞数量的扩增，增强保护性抗体，并在小鼠中快速清除在血液阶段的疟疾。还显示阻断慢性感染的发展(butler等人，同上)。
癌症
癌症可以是任何不想要的细胞增殖(或任何通过不想要的细胞增殖表现的疾病)、赘生物或肿瘤，或不想要的细胞增殖、赘生物或肿瘤增加的风险或倾向。癌症可能是良性或恶性的，可能是原发性或继发性的(转移性)。赘生物或肿瘤可以是细胞的任何异常生长或增殖，并且可以位于任何组织中。组织实例包括肾上腺、肾上腺髓质、肛门、阑尾、膀胱、血液、骨骼、骨髓、脑、乳腺、盲肠、中枢神经系统(包括或不包括脑)小脑、子宫颈、结肠、十二指肠、子宫内膜、上皮细胞(例如肾上皮细胞)、胆囊、食道、胶质细胞、心脏、回肠、空肠、肾、泪腺、喉、肝、肺、淋巴、淋巴结、淋巴母细胞、上颌、纵隔、肠系膜、子宫肌层、鼻咽、网膜(omentume)、口腔、卵巢、胰腺、腮腺、周围神经系统、腹膜、胸膜、前列腺、唾液腺、乙状结肠、皮肤、小肠、软组织、脾脏、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、舌头、扁桃体、气管、子宫、外阴、白细胞。
要治疗的肿瘤可能是神经系统或非神经系统肿瘤。神经系统肿瘤可能起源于中枢或外周神经系统，例如神经胶质瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、神经纤维瘤、室管膜瘤、神经鞘瘤、神经纤维肉瘤、星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤。非神经系统癌症/肿瘤可能起源于任何其他非神经组织，例子包括黑素瘤、间皮瘤、淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、非霍奇金淋巴瘤(nhl)、霍奇金淋巴瘤、慢性骨髓性白血病(cml)、急性骨髓性白血病(aml)、骨髓增生异常综合征(mds)、皮肤t细胞淋巴瘤(ctcl)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、肝癌、表皮样癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、胰腺癌、胸腺癌、nsclc、血液癌和肉瘤。
过继性t细胞转移治疗
过继性t细胞转移治疗通常是指从对象中除去白细胞的过程，通常是通过抽取血液样品从其分离白细胞，体外或离体扩增并返回到相同的对象或不同的对象。治疗通常旨在增加对象中t细胞群所需活性形式的量/浓度。这种治疗对于经历t细胞衰竭的对象可能是有益的。
能够阻断t细胞耗尽或逆转机制的抗体提供增强t细胞活性和促进t细胞扩增的方法。
因此，在本发明的另一方面，提供一种用于扩增t细胞群的方法，其中t细胞在体外或离体与本发明的抗体、抗原结合片段或多肽接触。
方法可以任选地包括以下步骤中的一个或多个：从对象取血样；从血液样品中分离t细胞；在体外或离体细胞培养物中培养t细胞(其中它们可以与抗体、抗原结合片段或多肽接触)，收集扩增的t细胞群；将t细胞与佐剂、稀释剂或载体混合；将扩增的t细胞施用于对象。
因此，在本发明的一些方面，提供了患有t细胞功能障碍病症的对象的治疗方法，所述方法包括从需要治疗的对象获得血液样品，在本发明的抗体、抗原结合片段或多肽的存在下培养从血液样品获得的t细胞以扩增t细胞群、收集扩增的t细胞，并将经扩增的t细胞施用于需要治疗的对象。
t细胞可以从需要治疗的对象获得，并且可以被分离和/或纯化。它们可能是cd4+和/或cd8+t细胞群体。t细胞可以代表经历t细胞耗尽的群体，并且可以任选地具有上调表达的tim-3。
在培养期间，t细胞可以在适合于允许将t细胞扩增到所需数目细胞的条件下和一段时间内与抗体、抗原结合片段或多肽接触。在合适的时间段之后，可以收获t细胞，任选地进行浓缩，并且可以与合适的载体、佐剂或稀释剂混合并返回到对象的身体。对象可经历一轮或多轮此类治疗。
t细胞扩增的方法是本领域公知的，例如在kalamasz等人，jimmunother2004年9-10月；27(5)：405-18；montes等人，clinexpimmunol2005年11月；142(2)：292-302；
同时或序贯施用
组合物可以单独或与其它治疗组合施用，或者同时或序贯地，取决于待治疗的病症。
在本说明书中，本发明的抗体，抗原结合片段或多肽和抗感染剂或化学治疗剂(治疗剂)可以同时或序贯施用。
在一些实施方式中，用本发明的抗体，抗原结合片段或多肽进行治疗可伴随化学疗法。
同时给药是指将抗体、抗原结合片段或多肽和治疗剂一起施用，例如作为含有两种试剂(组合制剂)的药物组合物，或者彼此紧密衔接，任选地经由相同的施用途径，例如，到同一动脉，静脉或其他血管。
序贯给药是指通过分开施用其它药剂，在给定的时间间隔之后施用抗体，抗原结合片段或多肽或治疗剂之一。不要求两个试剂通过相同的途径施用，尽管在一些实施方式中是这种情况。时间间隔可以是任何时间间隔。
抗感染剂
在治疗感染时，本发明的抗体、抗原结合片段或多肽可与抗感染剂组合施用，如上所述。抗感染剂可以是对引起感染的微生物或病毒具有作用的已知药剂。
合适的抗感染剂包括抗生素(例如青霉素、头孢菌素、利福霉素、闰年霉素、喹诺酮类、磺胺类、大环内酯类、林可酰胺类、四环素、环状脂肽、甘氨酰环素、恶唑烷酮和闰年霉素)，抗病毒剂(如逆转录酶抑制剂，整合酶抑制剂，转录因子抑制剂，反义和sirna剂和蛋白酶抑制剂)，抗真菌剂(例如多烯，亚氨基二唑，三唑，噻唑，烯丙胺和棘白菌素)和抗寄生虫剂(如抗线虫剂，抗绦虫剂，抗吸虫剂，抗阿米巴剂和抗原虫剂)。
化疗
化疗是指用药物或电离辐射治疗癌症(例如使用x射线或γ射线的放射治疗)。在优选的实施方式中，化疗是指用药物治疗。药物可以是化学实体，例如小分子药物、抗生素、dna嵌入剂、蛋白质抑制剂(例如激酶抑制剂)或生物制剂，例如抗体、抗体片段、核酸或肽适体、核酸(例如dna，rna)、肽、多肽或蛋白质。药物可以配制成药物组合物或药物。制剂可以包含一种或多种药物(例如一种或多种活性剂)以及一种或多种药学上可接受的稀释剂，赋形剂或载体。
治疗可能涉及多种药物的给药。药物可以单独施用或与其他治疗组合施用，或者同时或序贯地，取决于待治疗的病症。例如，化疗可以是涉及施用两种药物的联合治疗，其中一种或多种可以用于治疗癌症。
化疗可以通过一种或多种给药途径施用，例如，肠胃外、静脉内注射、口服、皮下、皮内或肿瘤内。
化疗可以根据治疗方案进行。治疗方案可以是可由医生或医师制作的化疗预定时间表、计划、方案或安排，并且可以调整以适合需要治疗的患者。
治疗方案可以指明一种或多种：给予患者的化学疗法的类型、每种药物或辐射的剂量、施用的时间间隔、每次治疗的时长、任何治疗间歇的数量和性质等(如果有的话)。对于联合治疗，可以提供单一治疗方案，其指示每种药物如何施用。
化疗药物和生物制剂可以选自：
·烷化剂如顺铂、卡铂、氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺；
·嘌呤或嘧啶抗代谢物如硫唑嘌呤或巯嘌呤；
·生物碱和萜类化合物，如长春花生物碱(如长春新碱、长春花碱、长春瑞滨、长春地辛)、鬼臼毒素、依托泊苷、替尼泊苷、紫杉烷如紫杉醇(taxoltm)、多西紫杉醇；
·拓扑异构酶抑制剂，如i型拓扑异构酶抑制剂喜树碱伊立替康和托泊替康、或ii型拓扑异构酶抑制剂安吖啶、依托泊苷、磷酸依托泊甙、替尼泊苷；
·抗肿瘤抗生素(例如蒽环类抗生素)如更生霉素、多柔比星(adriamycintm)表柔比星、博来霉素、雷帕霉素；
·基于抗体的药物，如抗pd-1抗体、抗pd-l1、抗ctla-4、抗-lag-3、抗4-1bb、抗gitr、抗cd27、抗blta、抗-ox40、抗-vegf、抗tnfα、抗il-2、抗gpiib/iiia、抗cd-52、抗cd20、抗rsv、抗her2/neu(erbb2)、抗tnf受体、抗egfr抗体，单克隆抗体或抗体片段，实例包括：西妥昔单抗、帕尼单抗、英夫利昔单抗、巴利昔单抗、贝伐单抗
·egfr抑制剂，如厄洛替尼，西妥昔单抗和吉非替尼；
·抗血管生成剂如贝伐珠单抗
·抗癌疫苗，如sipuleucel-t
在一个实施方式中，化学治疗剂是抗pd-1或抗pd-l1、抗ctla-4、抗lag-3、抗4-1bb、抗gitr、抗cd27、抗blta、抗ox40、抗vegf、抗tnf-α、抗il-2、抗gpiib/iiia、抗cd52、抗cd20、抗rsv、抗her2/neu(erb2)、抗tnf受体、抗egfr抗体。在一些实施方式中，化学治疗剂是免疫检查点抑制剂或共刺激分子。
其他化学治疗药物可以选自：13-顺-视黄酸、2-氯脱氧腺苷、5-氮杂胞苷5-氟尿嘧啶、6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、白蛋白结合型紫杉醇(abraxane)、
给药路线
根据本发明方面的抗体、抗原结合片段、多肽和其它治疗剂、药物和药物组合物可以配制用于通过多种途径施用，包括但不限于胃肠外、静脉内、动脉内、肌肉内、皮下、皮内、肿瘤内和口服。抗体、抗原结合片段、多肽和其它治疗剂可以配制成流体或固体形式。可以将流体制剂配制成通过注射给人或动物体的选定区域来施用。
剂量方式
可以提供多个剂量的抗体、抗原结合片段或多肽。剂量中的一种或多种或每种可伴随着同时或序贯施用另一种治疗剂。
多个剂量可以预定的时间间隔分开，其可以选择为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、或31天，或1、2、3、4、5或6个月。例如，可以每7、14、21或28天(加或减3、2或1天)给予剂量一次。
试剂盒
在本发明的一些方面，提供部件试剂盒。在一些实施方式中，试剂盒可以具有至少一个具有预定量抗体、抗原结合片段或多肽的容器。试剂盒可以以药物或药物组合物的形式提供抗体、抗原结合片段或多肽，并且可以与用于给予患者的说明一起提供以治疗特定疾病或病症。抗体、抗原结合片段或多肽可以配制成适于注射或输注到肿瘤或血液中。
在一些实施方式中，试剂盒还可以包含至少一个具有预定量的另一种治疗剂(例如抗感染剂或化疗剂)的容器。在这样的实施方式中，试剂盒还可以包含第二药物或药物组合物，使得两种药物或药物组合物可以同时或分开施用，使得它们为特定疾病或病症提供组合治疗。治疗剂也可以配制成适于注射或输注到肿瘤或血液中。
对象
待治疗的对象可以是任何动物或人。对象优选哺乳动物，更优选人。对象可以是非人哺乳动物，但更优选是人类。对象可能是男性或女性。对象可能是患者。对象可能被诊断患有需要治疗的疾病或病症，或被怀疑患有这种疾病或病症。
蛋白质表达
适用于在细胞中生产根据本发明多肽的分子生物学技术是本领域公知的，例如sambrook等人，分子克隆：实验手册(molecularcloning：alaboratorymanual)，纽约：冷泉港出版社，1989
多肽可以从核苷酸序列表达。核苷酸序列可以包含在存在于细胞中的载体中，或可以整合入细胞的基因组中。
本文使用的“载体”是用作将外源遗传物质转移入细胞的载体的寡核苷酸分子(dna或rna)。载体可以是用于在细胞中表达遗传物质的表达载体。这样的载体可以包括可操作地连接到编码待表达的基因序列的核苷酸序列的启动子序列。载体还可以包括终止密码子和表达增强子。本领域已知的任何合适的载体、启动子、增强子和终止密码子可用于从本发明的载体表达多肽。合适的载体包括质粒、二元载体、病毒载体和人造染色体(例如酵母人工染色体)。
在本说明书中，术语“可操作地连接”可以包括这样的情况：所选择的核苷酸序列和调节核苷酸序列(例如启动子和/或增强子)以这样的方式共价连接以使得核苷酸序列的表达受到调控序列的影响或控制(从而形成表达盒)。因此，如果调控序列能够影响核苷酸序列的转录，则调控序列可操作地连接到所选择的核苷酸序列。在合适的情况下，所得到的转录物然后可以翻译成所需的蛋白质或多肽。
适于多肽表达的任何细胞可用于制备本发明的肽。细胞可能是原核生物或真核生物。合适的原核细胞包括大肠杆菌。真核细胞的实例包括酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。在某些情况下，细胞不是原核细胞，因为一些原核细胞不允许与真核生物进行相同的翻译后修饰。此外，非常高的表达水平在真核生物中是可能的和使用适当的标签蛋白质可以更容易从真核生物纯化。还可以使用特异性质粒，其增强蛋白质分泌到培养基中。
产生所需多肽的方法可以涉及修饰以表达多肽的细胞的培养或发酵。培养或发酵可以在生物反应器中进行，所述生物反应器具有适当的营养物质、空气/氧气和/或生长因子供应。可以通过从细胞中分配培养基/发酵肉汤、提取蛋白质组分和分离各个蛋白质以分离分泌的多肽来收集分泌的蛋白质。培养、发酵和分离技术是本领域技术人员所熟知的。
生物反应器包括其中可以培养细胞的一个或多个容器。生物反应器中的培养可以连续发生，反应物连续流入反应器中，且培养的细胞连续流出反应器。或者，培养可以分批进行。生物反应器监测和控制环境条件，例如ph、氧气、进入和离开的流速以及容器内的搅动，以便为被培养的细胞提供最佳条件。
在培养表达目的多肽的细胞后，优选分离该多肽。可以使用从本领域已知的从细胞培养物分离多肽/蛋白质的任何合适的方法。为了从培养物中分离所需的多肽/蛋白质，有必要首先将培养的细胞从含有所需多肽/蛋白质的培养基中分离出来。如果所需多肽/蛋白是从细胞分泌的，则可以通过离心从含有分泌的多肽/蛋白质的培养基中分离细胞。如果所需多肽/蛋白质在细胞内收集，则有必要在离心之前破坏细胞，例如使用超声处理、快速冻融或渗透裂解。离心将产生含有培养细胞或培养细胞的细胞碎片的沉淀物，以及含有培养基和所需多肽/蛋白质的上清液。
然后可能需要从可能含有其它蛋白质和非蛋白质组分的上清液或培养基中分离所需多肽/蛋白质。从上清液或培养基中分离多肽/蛋白质组分的常见方法是通过沉淀。不同溶解度的多肽/蛋白质在不同浓度的沉淀剂如硫酸铵下沉淀。例如，在低浓度的沉淀剂中，提取水溶性蛋白质。因此，通过添加增加浓度的沉淀剂，可以区分不同溶解度的蛋白质。随后可以使用透析从分离的蛋白质中除去硫酸铵。
用于区分不同多肽/蛋白质的其它方法是本领域已知的，例如离子交换层析和尺寸色谱法。这些可以用作替代沉淀，或者可以在沉淀后进行。
一旦已经从培养物中分离出所需多肽/蛋白质，则可能需要浓缩蛋白质。用于浓缩所需蛋白质的许多方法是本领域已知的，例如超滤或冻干。
序列识别
用于确定氨基酸或核苷酸序列同一性百分比的比对可以以本领域技术人员已知的各种方式实现，例如使用诸如clustalw1.82.t-咖啡或序列比对(megalign)(dnastar)软件的公开可用的计算机软件。当使用这样的软件时，优选使用默认参数，例如对于间隙罚分和延伸罚分。clustalw1.82的默认参数是：蛋白质间隙开放罚分＝10.0，蛋白质间隙延伸罚分＝0.2，蛋白质基质＝gonnet，蛋白质/dna端隙(endgap)＝-1，蛋白质/dna缝距(gapdist)＝4。
本发明包括所描述的方面和优选特征的组合，除了这种组合是明显不允许的或明确避免的。
本文使用的部分标题仅用于组织目的，不应被解释为限制所描述的主题。
现在将参考附图通过示例的方式来说明本发明的方面和实施例。其他方面和实施例对于本领域技术人员将是显而易见的。本文中提及的所有文件均通过引用并入本文。
在整个说明书中，包括所附权利要求书，除非上下文另有要求，否则词语“包括”和诸如“包括”和“包含”之类的变体将被理解为意指包含规定的整数、或步骤、或整数或步骤组，但不排除任何其他整数或步骤或整数或步骤组。
必须指出的是，如在说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。在本文中范围可以表示为“约”一个特定值，和/或“约”另一特定值。当表示这样的范围时，另一个实施例包括从一个特定值和/或到另一特定值。类似地，当值被表示为近似值时，通过使用先行词“约”，可以理解特定值形成另一个实施例。
附图说明
现在将参考附图来讨论说明本发明的原理的实施方式和实验，其中：
图1.抗tim-3抗体克隆a3，b10，g6，g7，g9，a11和a11_gi(人igg4)的轻链可变结构域序列。cdr用下划线标记并单独显示。
图2.抗tim-3抗体克隆a3，b10，g6，g7，g9，a11和a11_gi(人igg4)的重链可变结构域序列。cdr用下划线标记并单独显示。
图3.显示抗tim-3抗体克隆a3，b10，g6，g7，g9，a11和a11_gi的轻链和重链cdr序列的表。
图4.抗tim-3抗体克隆a3，b10，g6，g7，g9，a11和a11_gi的重链和轻链可变结构域序列的核苷酸和编码的氨基酸序列。
图5.通过elisa测定，显示克隆a3，b10，g6，g7和g9与人和鼠tim-3的结合的图。
图6.显示通过克隆a3，b10，g6，g7和g9在molt3细胞表面阻断人tim-3：人半乳凝素9相互作用的图。
图7.显示克隆a3，b10，g6，g7和g9对人tim-3的亲和力表。
图8.显示克隆a3，b10，g6，g7和g9对急性骨髓性白血病细胞oci-aml3(m4)和thp-1(m5)的细胞毒性作用图。
图9.显示克隆a11与人和鼠tim-3的结合图。
图10.显示通过elisa测定的在molt3细胞表面通过克隆a11阻断人tim-3：人半乳凝素9相互作用图。
图11.显示克隆a11对人tim-3的亲和力表。
图12.显示克隆a11对急性骨髓性白血病细胞oci-aml3(m4)和thp-1(m5)的细胞毒性作用图。
图13.显示抗tim-3、cd3双特异性抗体对急性骨髓性白血病(aml)细胞和pbmc的共培养物的影响图。
图14.显示抗tim-3、cd3双特异性抗体对纯化的t细胞和急性骨髓性白血病(aml)细胞的影响图。
图15.显示抗tim-3克隆a11-抗cd3双特异性抗体和抗tim-3克隆b10-抗cd3双特异性抗体对纯化的t细胞和急性骨髓性白血病(aml)细胞的影响图。将aml细胞与纯化的t细胞以1:1的比例混合，并以不同的浓度加入抗体。孵育24小时后，测定裂解。
图16.显示抗tim-3克隆a11-抗cd3双特异性抗体对aml活组织检查(即aml干细胞)中cd34+细胞的cd34特异性细胞杀伤作用的图。选择后，将cd34+细胞(样品>99％cd34+纯度)与纯化的t细胞以1:1的比例混合，并以不同的浓度加入抗体。孵育24小时后，测定裂解。
图17.串联单链双特异性抗体形式的示意图。
实施例
抗人tim-3抗体的分离
在三轮生物淘选过程中通过体外选择从人抗体噬菌体展示文库中分离抗tim-3抗体。
基本上，将链霉亲和素磁珠用生物素化的人tim-3包被，并用于使用磁选分选出抗tim-3特异性噬菌体。在选择过程中添加了去除潜在的抗生物素抗体的一些步骤。
在hb2151细胞小规模诱导后，通过elisa筛选fab抗体。简言之，用连接到人fc的人tim-3包被elisa平板，并用酪蛋白溶液封闭。在pbstween-20中经过大量洗涤之后，将来自诱导平板的含fab上清液在pbs中7％牛奶存在下转移到elisa板中。在室温下在搅拌和大量洗涤90分钟后，加入与hrp偶联的山羊抗人fab抗体。1小时后，洗涤板，加入tmb底物。用1mhcl终止反应，并在450nm处测量光密度，670nm作为参考。选择吸光度>0.1的抗体作为阳性。通过dna指纹图谱进行第一次克隆筛选；然后通过测序证实克隆性。
与人tim-3结包含及与小鼠tim-3交叉反应
通过如上所述的elisa使用与人fc偶联的人或小鼠tim-3作为抗原来评估与人或小鼠tim-3的结合。还使用人fc作为阴性对照抗原来评估与人fc的非特异性结合(图5和9)。
体外阻断tim-3/半乳凝素-9相互作用
偶联到藻红蛋白的人tim-3在室温下用facs缓冲液中各种浓度的抗体预温育30分钟。然后将这样的预混物加入到先前接种在96孔板中的表达半乳凝素-9的molt3细胞上，并在抗cd16/cd32抗体存在下在fix/perm缓冲液中固定/透化。在预混物存在下于4℃温育30分钟后，在perm/wash缓冲液中洗涤3次，将细胞重悬于pbs中，并通过流式细胞仪进行分析(图6和10)。
使用藻红蛋白染色的细胞比例测定抗体阻断tim-3/半乳凝素-9相互作用的能力：
分离的抗tim-3抗体的亲和力
通过表面等离子体共振测量人tim-3抗体的亲和力。
简单地说，与人fc结合的人tim-3被固定在与普罗特(proteon)xpr36生物分析仪(伯乐biorad)兼容的传感器芯片上。然后将抗体作为流动物施加到芯片上。记录每个候选fab的结合/解离速率和计算的亲和力(kd)(图7和11)。
体外功能活性：抗体依赖性细胞毒性(adcc)
根据法国-美国-英国分类系统，急性骨髓性白血病(aml)根据疾病起源的细胞类型及其成熟程度，分为8种不同的亚型m0至m7型。除m3细胞外，所有aml细胞株均表达tim-3。
在aml细胞系上测试抗tim-3抗体杀死tim-3表达的aml细胞的能力。基本上，在rpmi，10％fbs和10μg/ml抗体存在下，将aml细胞与nk细胞(1:1比例)共培养。在37℃下4小时后，收集细胞，并在流式细胞术测定中使用钙黄绿素am染色测量细胞死亡/存活比(图8和12)。
然后使用表达为igg1的a11构建能够一侧接合t细胞(cd3的特异性)、另一侧靶向tim-3的双特异性抗体。双特异性抗体包含两个单链可变片段(scfv)作为融合蛋白。scfv中的一个包含克隆a11的vh和vl序列(即seqidno：45和50)，另一个scfv包含抗cd3抗体克隆的vh和vl序列。
串联单链双特异性抗体的形式如图17所示。
按照类似的方案，在aml细胞和pbmc(pbmc/aml比例20:1)的共培养物上以10μg/ml测试双特异性抗体(图13)。
然后按照同样的方案，在纯化的t细胞和aml干细胞(1:1比例)的测定中测试抗tim-3克隆a11-抗cd3双特异性抗体(图14)。
工程化
克隆a11被进一步工程化；其序列被恢复成类似种系的框架，产生克隆a11_gl(仅在轻链可变结构域中修饰)。
通过双特异性抗tim-3、抗cd3抗体特异性杀伤来自患者急性骨髓性白血病细胞
测试抗tim-3克隆a11，以及抗cd3(抗tim-3克隆a11-抗cd3双特异性抗体)的串联单链双特异性形式，以评估其杀死从aml患者活检获得的急性骨髓性白血病(aml)细胞的能力。
简言之，将纯化的t细胞与获自3线化疗难治性患者的aml细胞以1：1的比例混合。以各种浓度加入双特异性抗体，将混合物孵育24小时。孵育后，检测aml细胞裂解。
结果如图15所示。证明抗tim-3克隆a11-抗cd3双特异性抗体在体外有效从化疗难治性患者中杀死aml细胞。
还构建并测试了串联单链fv形式的抗tim-3克隆b10-抗cd3双特异性抗体，并在高浓度时显示杀死(图15)。
然后在aml干细胞，即表达高水平cd34的aml活组织检查细胞内测试克隆a11-抗cd3双特异性抗体。选择后，将cd34+细胞(样品>99％cd34+纯度)与纯化的t细胞以1:1的比例混合，并以不同的浓度加入抗体。孵育24小时后，测定裂解。
结果如图16所示。抗tim-3克隆a11-抗cd3双特异性抗体显示了离体杀死aml干细胞的能力。
序列表
<110>新加坡科技研究局
<120>抗tim-3抗体
<130>ric/fp7158009
<150>gb1419092.0
<151>2014-10-27
<150>gb1419089.6
<151>2014-10-27
<160>61
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>107
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>1
aspileglnmetthrglnserproserphemetseralaservalgly
151015
aspargvalthrilethrcysargalaserglnaspileglysertyr
202530
leualatrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuile
354045
tyralaalaserthrleuglnserglyvalproserargphesergly
505560
serglyserglythraspphethrleuthrileasnserleuglnpro
65707580
gluaspphealathrtyrtyrcysglnglnsertyrserserpropro
859095
thrpheglyproglythrthrleugluilelys
100105
<210>2
<211>103
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>2
gluilevalleuthrglnserproalathrleuserpheserprogly
151015
gluargalathrleusercysargalaserglnservalglysertyr
202530
leualatrptyrglnglnargproglyglnalaproargproleuile
354045
tyraspalathrasnargalathrglyileprothrargphesergly
505560
serglyserglythraspphethrleuthrileserserleuglupro
65707580
gluaspphealathrtyrtyrcysglnhisargargthrpheglyarg
859095
glythrlysleugluilelys
100
<210>3
<211>112
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>3
aspvalvalmetthrglnserproleuserleuprovalthrprogly
151015
gluproalaserilesercysargserserglnserleuleuhisser
202530
asnglytyrasntyrleuasptrptyrleuglnlysproglyglnser
354045
proglnleuleuiletyrleuglyserasnargalaserglyvalpro
505560
aspargpheserglyserglyserglythraspphethrleulysile
65707580
serargvalglualagluaspvalglyvaltyrtyrcysmetglngly
859095
thrhistrpproprothrpheglyglnglythrlysvalgluleulys
100105110
<210>4
<211>108
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>4
gluthrthrleuthrglnserproglythrleuserleuserprogly
151015
gluargalathrleusercysargalaserglnservalserserser
202530
tyrleualatrptyrglnglnthrproglyglnalaproargleuleu
354045
iletyrglyalaserserargalathrglyileproaspargpheser
505560
glyserglyserglythraspphethrleuthrileserargleuglu
65707580
progluaspphealavaltyrtyrcysglnglntyrglyserserpro
859095
ilethrpheglyglnglythrargleugluilelys
100105
<210>5
<211>108
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>5
gluthrthrleuthrglnserproglythrleuserleuserprogly
151015
gluargalathrleusercysargalaserglnservalserserser
202530
tyrleualatrptyrglnglnlysileglyglnalaproargleuleu
354045
iletyrglyalaserserargalathrglyileproaspargpheser
505560
glyserglyserglythraspphethrleuthrileserargleuglu
65707580
progluaspphealavaltyrtyrcysglnglntyrglyserserpro
859095
ilethrpheglyglnglythrargleugluilelys
100105
<210>6
<211>11
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>6
argalaserglnaspileglysertyrleuala
1510
<210>7
<211>7
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>7
alaalaserthrleuglnser
15
<210>8
<211>9
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>8
glnglnsertyrserserproprothr
15
<210>9
<211>11
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>9
argalaserglnservalglysertyrleuala
1510
<210>10
<211>7
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>10
aspalathrasnargalathr
15
<210>11
<211>5
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>11
glnhisargargthr
15
<210>12
<211>16
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>12
argserserglnserleuleuhisserasnglytyrasntyrleuasp
151015
<210>13
<211>7
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>13
leuglyserasnargalaser
15
<210>14
<211>9
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>14
metglnglythrhistrpproprothr
15
<210>15
<211>12
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>15
argalaserglnservalsersersertyrleuala
1510
<210>16
<211>7
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>16
glyalaserserargalathr
15
<210>17
<211>9
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>17
glnglntyrglyserserproilethr
15
<210>18
<400>18
000
<210>19
<211>120
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>19
glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyala
151015
servallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrsertyr
202530
tyrmethistrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmet
354045
glyileileasnproserglyglyserthrsertyralaglnlysphe
505560
glnglyargvalthrmetthrargaspthrserthrserthrvaltyr
65707580
metgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys
859095
alaargserproglyvalvalthralaleupheasptyrtrpglygln
100105110
glythrleuvalthrvalserser
115120
<210>20
<211>119
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>20
glnvalglnleuglngluserglyproglyleuvallysalaserglu
151015
thrleuserleuthrcysthrvalserglyglyserileglyserser
202530
asptyrtyrtrpglytrpileargglnproproglylysglyleuglu
354045
trpileglyseriletyrtyrserglyserthrtyrtyrasnproser
505560
leulysserargvalthrmetservalaspthrproasnasnglnphe
65707580
serleulysleuserservalthralaalaaspthralavaltyrtyr
859095
cysalaargglygluhisargglyglupheasptyrtrpglyglngly
100105110
thrleuvalthrvalserser
115
<210>21
<211>119
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>21
glnvalglnleuglngluserglyproglyleuvallysprosergly
151015
thrleuserleuthrcysalavalserglyglyserileserserser
202530
asntrptrpsertrpvalargglnproproglylysglyleuglutrp
354045
ileglygluiletyrhisserglyserthrasntyrasnproserleu
505560
lysserargvalthrileservalasplysserlysasnglnpheser
65707580
leulysleuserservalthralaalaaspthralavaltyrtyrcys
859095
alaargvalvalalavalalaglythrvalasptyrtrpglyglngly
100105110
thrleuvalthrvalserser
115
<210>22
<211>123
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>22
gluvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyala
151015
servallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrsertyr
202530
tyrmethistrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmet
354045
glyileileasnproserglyglyserthrsertyralaglnlysphe
505560
glnglyargvalthrmetthrargaspthrserthrserthrvaltyr
65707580
metgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys
859095
alaargaspglntyrserserglytrptyrtyrtyrglymetaspval
100105110
trpglyglnglythrthrvalthrvalserser
115120
<210>23
<211>123
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>23
glnvalglnleuglnglnserglyalagluvallyslysproglyala
151015
servallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrsertyr
202530
tyrmethistrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmet
354045
glyileileasnproserglyglyserthrsertyralaglnlysphe
505560
glnglyargvalthrmetthrargaspthrserthrserthrvaltyr
65707580
metgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys
859095
alaargaspleutyrsertyrglyphetyrtyrtyrglymetaspval
100105110
trpglyglnglythrthrvalthrvalserser
115120
<210>24
<211>10
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>24
glytyrthrphethrsertyrtyrmethis
1510
<210>25
<211>17
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>25
ileileasnproserglyglyserthrsertyralaglnlysphegln
151015
gly
<210>26
<211>11
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>26
serproglyvalvalthralaleupheasptyr
1510
<210>27
<211>12
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>27
glyglyserileglyserserasptyrtyrtrpgly
1510
<210>28
<211>16
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>28
seriletyrtyrserglyserthrtyrtyrasnproserleulysser
151015
<210>29
<211>9
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>29
glygluhisargglyglupheasptyr
15
<210>30
<211>11
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>30
glyglyserileserserserasntrptrpser
1510
<210>31
<211>16
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>31
gluiletyrhisserglyserthrasntyrasnproserleulysser
151015
<210>32
<211>10
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>32
valvalalavalalaglythrvalasptyr
1510
<210>33
<211>14
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>33
aspglntyrserserglytrptyrtyrtyrglymetaspval
1510
<210>34
<211>14
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>34
aspleutyrsertyrglyphetyrtyrtyrglymetaspval
1510
<210>35
<211>321
<212>dna
<213>智人(homosapiens)
<400>35
gacatccagatgacccagtctccctccttcatgtctgcatctgtaggagacagagtcacc60
atcacttgccgggccagtcaggacattggcagttatttagcctggtatcagcaaaaacca120
gggaaagcccctaaactcctgatctatgctgcatccactttgcaaagtggggtcccatca180
aggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcaacagtctgcaacct240
gaagattttgcaacttactactgtcaacagagttacagttcccctccgactttcggccct300
gggaccacattggagatcaaa321
<210>36
<211>309
<212>dna
<213>智人(homosapiens)
<400>36
gaaattgtgctgactcagtctccagccaccctgtctttttctccgggtgaaagagccacc60
ctctcctgcagggccagtcagagtgttggcagctacttagcctggtaccagcagagacct120
ggccaggctcccaggcccctcatctatgatgcaaccaacagggccactggcatcccaacc180
aggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctagagcct240
gaagattttgcaacttattactgtcaacaccgaaggacttttggccgggggaccaagttg300
gagatcaaa309
<210>37
<211>336
<212>dna
<213>智人(homosapiens)
<400>37
gatgttgtgatgactcagtctccactctccctgcccgtcacccctggagagccggcctcc60
atctcctgcaggtctagtcagagcctcctacatagtaatggatacaactatttggattgg120
tacctgcagaagccagggcagtctccacagctcctgatctatttgggttctaatcgggcc180
tccggggtccctgacaggttcagtggcagtggatcaggcacagattttacactgaaaatc240
agcagggtggaggctgaggatgttggggtttattactgcatgcaaggtacacactggcct300
ccgacgttcggccaagggaccaaggtggaactcaaa336
<210>38
<211>324
<212>dna
<213>智人(homosapiens)
<400>38
gaaacgacactcacgcagtctccaggcaccctgtctttgtctccaggggaaagagccacc60
ctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagcagctacttagcctggtaccagcagaca120
cctggccaggctcccaggctcctcatctatggtgcatccagcagggccactggcatccca180
gacaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagactggag240
cctgaagattttgcagtgtattactgtcagcagtatggtagctcacccatcaccttcggc300
caagggacacgactggagattaaa324
<210>39
<211>324
<212>dna
<213>智人(homosapiens)
<400>39
gaaacgacactcacgcagtctccaggcaccctgtctttgtctccaggggaaagagccacc60
ctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagcagctacttagcctggtaccagcaaaaa120
attggccaggctcccaggctcctcatctatggtgcatccagcagggccactggcatccca180
gacaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagactggag240
cctgaagattttgcagtgtattactgtcagcagtatggtagctcaccaatcaccttcggc300
caagggacacgactggagattaaa324
<210>40
<211>360
<212>dna
<213>智人(homosapiens)
<400>40
caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtt60
tcctgcaaggcatctggatacaccttcaccagctactatatgcactgggtgcgacaggcc120
cctggacaagggcttgagtggatgggaataatcaaccctagtggtggtagcacaagctac180
gcacagaagttccagggcagagtcaccatgaccagggacacgtccacgagcacagtctac240
atggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgagaagccct300
ggggtggtgactgccctctttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcaagc360
<210>41
<211>357
<212>dna
<213>智人(homosapiens)
<400>41
caggtgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaaggcttcggagaccctgtccctc60
acctgcactgtctctggtggctccatcggcagtagtgattactactggggctggatccgc120
cagcccccagggaagggactggagtggattgggagtatctattatagtgggagcacctac180
tacaacccctccctcaagagtcgagtcaccatgtcagtagacacgcccaacaatcagttc240
tccctgaagctgagctctgtgaccgctgcggacacggccgtgtattactgtgcgagagga300
gaacatagaggggaatttgactactggggccagggcaccctggtcaccgtctcaagc357
<210>42
<211>357
<212>dna
<213>智人(homosapiens)
<400>42
caggtgcagctgcaggagtccggcccaggactggtgaagccttcggggaccctgtccctc60
acctgcgctgtctctggtggctccattagcagtagtaactggtggagttgggtccgccag120
cccccagggaaggggctggagtggattggggaaatctatcatagtgggagcaccaactac180
aacccgtccctcaagagtcgagtcaccatatcagtagacaagtccaagaaccagttctcc240
ctgaagctgagctctgtgaccgccgcggacacggccgtgtattactgtgcgagagtagta300
gcagtggctggtacggttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcaagc357
<210>43
<211>369
<212>dna
<213>智人(homosapiens)
<400>43
gaggtccagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtt60
tcctgcaaggcatctggatacaccttcaccagctactatatgcactgggtgcgacaggcc120
cctggacaagggcttgagtggatgggaataatcaaccctagtggtggtagcacaagctac180
gcacagaagttccagggcagagtcaccatgaccagggacacgtccacgagcacagtctac240
atggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgagagatcag300
tatagcagtggctggtactactacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcacc360
gtctcaagc369
<210>44
<211>369
<212>dna
<213>智人(homosapiens)
<400>44
caggtacagctgcagcagtcaggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtt60
tcctgcaaggcatctggatacaccttcaccagctactatatgcactgggtgcgacaggcc120
cctggacaagggcttgagtggatgggaataatcaaccctagtggtggtagcacaagctac180
gcacagaagttccagggcagagtcaccatgaccagggacacgtccacgagcacagtctac240
atggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgagagattta300
tacagctatggtttttactactacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcacc360
gtctcaagc369
<210>45
<211>110
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>45
glnservalvalthrglnproproservalseralaalaproglygln
151015
lysvalthrilesercysserglyserserserasnileglyasnasn
202530
tyrvalsertrptyrglnglnleuproglythralaprolysleuleu
354045
iletyrglyasnasntrpargproserglyileproaspargpheser
505560
glyserlysserglythrseralathrleualaileserglyleugln
65707580
thrglyaspglualaasptyrtyrcysgluthrtrpaspserserleu
859095
seralaglyvalpheglyglyglythrlysleuthrvalleu
100105110
<210>46
<211>110
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列：抗tim-3抗体a11_gi轻链可变区序列
<400>46
glnservalleuthrglnproproservalseralaalaproglygln
151015
lysvalthrilesercysserglyserserserasnileglyasnasn
202530
tyrvalsertrptyrglnglnleuproglythralaprolysleuleu
354045
iletyrglyasnasntrpargproserglyileproaspargpheser
505560
glyserlysserglythrseralathrleuglyilethrglyleugln
65707580
thrglyaspglualaasptyrtyrcysgluthrtrpaspserserleu
859095
seralaglyvalpheglyglyglythrlysleuthrvalleu
100105110
<210>47
<211>13
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>47
serglyserserserasnileglyasnasntyrvalser
1510
<210>48
<211>7
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>48
glyasnasntrpargproser
15
<210>49
<211>11
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>49
gluthrtrpaspserserleuseralaglyval
1510
<210>50
<211>116
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>50
glnvalglnleuglnglntrpglyalaglyleuleulysproserglu
151015
thrleuserleuthrcysalavaltyrglyglyserpheserglytyr
202530
tyrtrpsertrpileargglnproproglylysglyleuglutrpile
354045
glygluileasnhisserglyserthrasntyrasnproserleulys
505560
serargvalthrileservalaspthrserlysasnglnpheserleu
65707580
lysleuserservalthralaalaaspthralavaltyrtyrcysala
859095
argglytyrvalalaglypheasptyrtrpglyglnglythrleuval
100105110
thrvalserser
115
<210>51
<211>116
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列：抗tim-3抗体克隆a11_gi重链可变区序列
<400>51
glnvalglnleuglnglntrpglyalaglyleuleulysproserglu
151015
thrleuserleuthrcysalavaltyrglyglyserpheserglytyr
202530
tyrtrpsertrpileargglnproproglylysglyleuglutrpile
354045
glygluileasnhisserglyserthrasntyrasnproserleulys
505560
serargvalthrileservalaspthrserlysasnglnpheserleu
65707580
lysleuserservalthralaalaaspthralavaltyrtyrcysala
859095
argglytyrvalalaglypheasptyrtrpglyglnglythrleuval
100105110
thrvalserser
115
<210>52
<211>10
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>52
glyglyserpheserglytyrtyrtrpser
1510
<210>53
<211>16
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>53
gluileasnhisserglyserthrasntyrasnproserleulysser
151015
<210>54
<211>8
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>54
glytyrvalalaglypheasptyr
15
<210>55
<211>330
<212>dna
<213>智人(homosapiens)
<400>55
cagtctgtcgtgacgcagccgccctcagtgtctgcggccccaggacagaaagtcaccatc60
tcctgctctggaagcagctccaacattgggaataattatgtatcctggtaccagcagctc120
ccaggaacagcccccaaactcctcatttatggcaataattggcgaccctcagggattcct180
gaccgcttctctggctccaagtctggcacctcagccaccctggccatcagcggacttcag240
actggggacgaggccgattattactgcgaaacatgggatagcagcctgagtgctggggta300
ttcggcggagggaccaagctgaccgtccta330
<210>56
<211>330
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列：抗tim-3抗体克隆a11_gi重链可变区序列的核苷酸序列
<400>56
cagtctgtgttgacgcagccgccctcagtgtctgcggccccaggacagaaagtcaccatc60
tcctgctctggaagcagctccaacattgggaataattatgtatcctggtaccagcagctc120
ccaggaacagcccccaaactcctcatttatggcaataattggcgaccctcagggattcct180
gaccgcttctctggctccaagtctggcacctcagccaccctgggcatcaccggacttcag240
actggggacgaggccgattattactgcgaaacatgggatagcagcctgagtgctggggta300
ttcggcggagggaccaagctgaccgtccta330
<210>57
<211>348
<212>dna
<213>智人(homosapiens)
<400>57
caggtgcagctacagcagtggggcgcaggactgttgaagccttcggagaccctgtccctc60
acctgcgctgtctatggtgggtccttcagtggttactactggagctggatccgccagccc120
ccagggaaggggctggagtggattggggaaatcaatcatagtggaagcaccaactacaac180
ccgtccctcaagagtcgagtcaccatatcagtagacacgtccaagaaccagttctccttg240
aaactgagctctgtgaccgccgcggacacggctgtgtattactgtgcgagaggctacgtg300
gctggctttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcaagc348
<210>58
<211>5
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>58
sertyrtyrmethis
15
<210>59
<211>7
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>59
serserasptyrtyrtrpgly
15
<210>60
<211>6
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>60
serserasntrptrpser
15
<210>61
<211>5
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>61
glytyrtyrtrpser
15
- 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞！