一种同步检测二十三种呼吸道病原体的试剂盒及其检测方法与流程

本发明涉及呼吸道病原体的检测试剂盒及其检测方法，尤其是涉及一种基于多重荧光pcr毛细电泳的同步检测二十三种呼吸道病原体的试剂盒及其检测方法。

背景技术：

近年来呼吸道感染日趋严重，特别是儿童与青少年感染尤甚。引起呼吸道感染的病原体主要有病毒、细菌、支原体、衣原体等微生物，一种病原体可引起多种临床表现，同一临床表现又可由多种病原体引起。由于这些非典型性致病原引起的临床症状复杂不明显，患者往往被忽视或误诊，临床上也很难针对病原体进行治疗，使某些患者病情加重或造成抗菌药滥用。因此，呼吸道病原体的快速检测，对临床早期诊断有重要意义。

呼吸道病原体检测方法有病原体分离培养，免疫标记检测。培养法存在较多缺点已逐渐淘汰。免疫标记检测对病原体感染后机体产生的抗体进行检测，存在窗口期，并且与培养法比，存在灵敏度低、特异性差的问题。而核酸检测就灵敏、准确的多。针对呼吸道病原体的检测，多数是以rt-pcr方法进行，一次检测的病原体较少。荷兰pathofinder基于多重连接的方法，一次可检测22中呼吸道病原体，但是操作复杂，样品转录后，取转录产物进行pcr扩增，取pcr产物进行下一步杂交反应，取杂交产物进行pcr扩增。期间多次开盖，容易污染，整个扩增检测时间大约是2.5-4小时(http://www.pathofinder.com/technology/twosmartfinder)。宁波海尔施的专利201310033293.9披露的可同时检测22种呼吸道病原体，基于单一荧光标记，扩增片段会较大，扩增区域一旦有碱基缺失，容易错判。

本技术方案基于多重荧光标记技术，将23种病原体分成四组荧光标记，扩增片段小，样本提取后，转录及扩增单管完成，减少了污染几率，扩增时间在一小时以内，结合美国ab公司的一代测序仪如3730xldnaanalyzer，可实现1.5小时内最多检测96个样本。目前，国内未见以多重荧光标记，单管完成逆转录及复合扩增的报道。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度高、检测速度快、单管完成转录扩增，操作简便的基于多重荧光标记技术的同步检测二十三种呼吸道病原体的试剂盒及其检测方法。

本发明的技术方案是这样实现的：

本发明实施例公开了一种同步检测二十三种呼吸道病原体的试剂盒，包括：转录及扩增引物、2.5xreactionmix、depc水、热启动tap酶和逆转录酶，其特征在于，所述转录及扩增引物组包括17种rna病毒、2种dna病毒及4种呼吸道致病菌，基因序列如下表：

进一步地，所述转录及扩增引物分四组并分别有用四种不同的萤光染料进行标记，其中：人呼吸道合胞病毒b型、军团病杆菌、肺炎衣原体、肺炎支原体、甲型流感病毒(infa)及乙型流感病毒(infb)为一组且对应的引物以fam荧光染料进行标记；甲型流感h1n1v病毒、人类副流感病毒2型、人类副流感病毒1型、人类偏肺病毒、人类副流感病毒3型及人副流感病毒4型为一组且对应的引物以hex荧光染料进行标记；博卡病毒、人类腺病毒、人类冠状病毒nl63、人类冠状病毒oc43、人类冠状病毒229e及人类冠状病毒hku1为一组且对应的引物以atto550荧光染料进行标记；肠道病毒/鼻病毒、呼吸道合胞病毒a型、甲型流感h5n1病毒及百日咳杆菌为一组且对应的引物以attorho101荧光染料进行标记。

进一步地，所述每个呼吸道病原体所对应的2条引物中，至少有1条是经过荧光标记的。

进一步地，所述2.5xreactionmix包括125mmtris·cl(ph8.8，25℃)，125mmkcl，50mm(nh4)2so4，12.5mmmgcl2，1.5mmdntps，5mmdtt，5mg/mlbsa，0.8m甜菜碱，1％tween20。

进一步地，所述呼吸道病原体采集自人的呼吸道分泌物，包括鼻咽拭子或痰液。

一种同步检测二十三种呼吸道病原体的检测方法，利用上述中任一项所述的同步检测二十三种呼吸道病原体的试剂盒，包括具体步骤为：

(1)采集样本并提取核酸

采集呼吸道感染者的鼻咽拭子或痰液，对其进行分离培养物，从分离培养物中提取核酸；

(2)按权利要求2或3所述转录及扩增引物分组并分别有用不同的萤光染料进行标记；

(3)以感染者提取的核酸为样本进行逆转录及复合扩增，反应条件：热循环温度50℃，30min；95℃，5min；94℃5s，60℃30s，28个循环；60℃，5min；4℃保持；

(4)采用毛细管电泳仪对扩增引物进行基因测序，将毛细管电泳仪的软件获得的图谱与标准图谱对比，判断呼吸道病原体的种类，获得检测结果。

本发明提供的一种同步检测二十三种呼吸道病原体的试剂盒及其检测方法，具有以下有益效果：

本技术方案基于多重荧光标记技术，将23种病原体分成四组荧光标记，扩增片段小，样本提取后，转录及扩增单管完成，减少了污染几率，扩增时间在一小时以内，结合美国ab公司的一代测序仪如3730xldnaanalyzer，可实现1.5小时内最多检测96个样本，其特异性强、灵敏度高、检测速度快、单管完成转录扩增，操作简便。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为同步检测二十三种呼吸道病原体的试剂盒中病原体中四种荧光标记排布图。

图2为实施例一中结果不稀释及稀释10倍的所有二十三种致病菌的扩增结果图，均有扩增峰。

图3为实施例一中结果稀释100的混合菌的扩增结果图，检测有丢失，一个检测峰对应一种病原体，里面有对应病原体，就会有扩增峰。

图4为实施例一中的人类冠状病毒oc43感染的扩增结果图。

图5为实施例一中的甲型流感病毒感染的扩增结果图。

图6为实施例一中的人类副流感病毒1型(hpiv1)的扩增结果图。

具体实施方式

通过下面给出的本发明的具体实施例可以进一步了解本发明，但它们不是对本发明的限定。对于本领域的技术人员根据上述发明内容所作的一些非本质的改进与调整，也视为落在本发明的保护范围内。

本发明基于多重荧光标记，单管完成逆转录及复合扩增，产物基于美国ab公司一代基因测序仪，如310geneticanalyzer、3100-avantgeneticanalyzer、3130geneticanalyzer、3130xlgeneticanalyzer、3500geneticanalyzer、3500xlgeneticanalyzer、3730dnaanalyzer和3730xldnaanalyzer等。

检测的病原体包括17种rna病毒，2种dna病毒及4种细菌。rna病毒包括：人呼吸道合胞病毒(a型/b型)，流感病毒(甲型流感病毒，h1n1v，h5n1，乙型流感病毒)，副流感病毒(1型，2型，3型及4型)，人类冠状病毒(nl63，oc43，229e及hku1)，人类偏肺病毒，肠道病毒及鼻病毒；dna病毒是博卡病毒和腺病毒；4种细菌包括肺炎支原体，肺炎衣原体，军团病杆菌及百日咳杆菌。参考序列及病原体类型具体见下表1：

表1检测的23种病原体及病原体参考序列

经过数据库分析，选取特异性区域设计引物。除肠道病毒与鼻病毒基因同源性高，用同一对引物检测，其他21种病毒都设计了特异性引物扩增。引物设计时tm值在60℃左右。避开突变点，扩增区域避开插入缺失区域，扩增片段在60-120bp之间。最后，根据扩增产物大小，23种病原体分四种荧光标记：人呼吸道合胞病毒b型，军团病杆菌，肺炎衣原体，肺炎支原体，甲型流感病毒(infa)及乙型流感病毒(infb)以fam荧光标记；甲型流感h1n1v病毒，人类副流感病毒2型，人类副流感病毒1型，人类偏肺病毒，人类副流感病毒3型及人副流感病毒4型以hex荧光标记；博卡病毒，人类腺病毒，人类冠状病毒nl63，人类冠状病毒oc43，人类冠状病毒229e及人类冠状病毒hku1以atto550标记，肠道病毒/鼻病毒，呼吸道合胞病毒a型，甲型流感h5n1病毒及百日咳杆菌以attorho101标记。排布图如图例1。经多次实验测试，最终引物序列及浓度(引物配置成5x混合物)，对于rna病毒，非标记引物也是逆转录引物，加量比标记引物要多。引物序列，标记、加量及扩增产物长度见下表2。

表2病原体检测引物、标记及扩增产物长度

将反应mix组分按125mmtricine-koh(ph8.8，25℃)，100mmkcl，40mm(nh4)2so4，6mmmgcl2，1.2mmdntps，2.5mmdtt，2.5mg/mlbsa，1m甜菜碱，1％tween20配置成2.5x反应mix(reactionmix)。热启动酶为primestarhsdnapolymerase(r010a/b)逆转录酶mmlvreversetranscriptase(639523)购自大连宝生物。25微升体系反应，反应体系按以下加量进行：

pcr反应按热循环温度“50℃，20min；95℃，5min；94℃5s，60℃30s，28个循环；60℃，5min；4℃保持”进行。取1微升pcr产物，加到有10微升hidi甲酰胺(美国ab公司)及0.5微升liz120(美国abi，货号4324287)的混合物的96孔pcr板中，经pcr仪95℃3min加热变性后，放入4度冰箱冷却，放入美国abi一代测序仪上机检测，进样电压3kv，进样时间10s，电泳电压为15kv，电泳时间为800s。检测结果用genemapper(美国abi)软件分析，样本提取后，扩增检测时间在1.5小时以内。

实施例一，同步检测二十三种呼吸道病原体的试剂盒及其检测方法。

1、引物组组配：

按下表序列及浓度组配5x引物混合物，引物由上海生工合成，经hplc纯化，ce质检，纯度在95％以上：

2、2.5xreactionmix组配：

2.5x反应mix(reactionmix)包含：125mmtricine-koh(ph8.8，25℃)，100mmkcl，40mm(nh4)2so4，6mmmgcl2，1.2mmdntps，2.5mmdtt，2.5mg/mlbsa，1m甜菜碱，1％tween20。

3、样本来源及提取：

23种呼吸道病原菌，经培养法鉴定后，取各种菌液500cfu，样本由某省疾控中心惠赠，灭活后混合成检测样本，对混好的样本分别稀释10倍，100倍，经qiaampminelutevirusspinkit(货号57704，qiagen)提取，按说明书操作，最后以50微升bufferave洗脱，获得三种浓度混合菌液的提取dna。

4、pcr体系配置及pcr扩增：

热启动酶为primestarhsdnapolymerase(r010a/b)逆转录酶mmlvreversetranscriptase(639523)购自大连宝生物。反应体系按以下加量进行：

pcr反应按热循环温度“50℃，20min；95℃，5min；94℃5s，60℃30s，28个循环；60℃，5min；4℃保持”进行。

5、pcr产物的检测：

由去离子甲酰胺与分子量内标(美国abiliz-120)组成上样混合物[(0.5μl分子量内标+10μl去离子甲酰胺)×(样品数)]，将9μl上样混合物与1μl扩增产物混合，简短离心将液体收集到离心管管子底部，样品95℃变性3分钟，然后置于冰上冷却3分钟，使dna完全变性，将样品放入基因分析仪的样品托盘中，用abi3130xl遗传分析仪进行电泳和检测。

6、分型分析：

用片段分析软件genemapper分析遗传分析仪检测收集的数据，结果不稀释及稀释10倍的结果所有23种致病菌，均有扩增峰，全部检出，见附图2和附图3，稀释100的混合菌的检测有丢失，一个检测峰对应一种病原体，里面有对应病原体，就会有扩增峰。

实施例二，同步检测二十三种呼吸道病原体的试剂盒及其检测方法。

1、样本提取的三种样本类型,分别为1、鼻咽拭子，2、咽拭子，3、鼻咽洗液，经qiaampminelutevirusspinkit(货号57704，qiagen)提取，按说明书操作，最后以50微升bufferave洗脱。

2、按实施例一配置好的引物组和reactionmix，以实施例一的加样及扩增程序进行pcr反应。

3、电泳检测，由去离子甲酰胺与分子量内标(美国abiliz-120)组成上样混合物[(0.5μl分子量内标+10μl去离子甲酰胺)×(样品数)]。将9μl上样混合物与1μl扩增产物混合，简短离心将液体收集到离心管管子底部。样品95℃变性3分钟，然后置于冰上冷却3分钟，使dna完全变性，将样品放入基因分析仪的样品托盘中，用abi3130xl遗传分析仪进行电泳和检测。

4、分型分析用片段分析软件genemapper分析遗传分析仪检测收集的数据，检测结果见附图4-6。根据检测结果1号样为人类冠状病毒oc43感染，2号样为甲型流感病毒感染，3号为人类副流感病毒1型(hpiv1)感染。检测结果与后续的培养法检测一致。

本发明提供了一种同步检测二十三种呼吸道病原体的试剂盒及其检测方法，具操作简便，灵敏度高的特点。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>深圳市百迈生命科学有限公司

东莞市迈道生物科技有限公司

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