一种重组人胰岛素的制备和纯化方法与流程

[0001]
本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及一种重组人胰岛素的制备和纯化方法。


背景技术：

[0002]
糖尿病是全球范围内威胁人类健康的一大疾病。在中国，随着人民生活方式的改变和老龄化进程的加快，糖尿病的患病率呈快速上升趋势。糖尿病的急慢性并发症，尤其是慢性并发症累计多个器官，致残、致死率高，严重影响患者的身心健康，并给个人、家庭和社会带来沉重的负担。
[0003]
所有i型糖尿病患者都须接受胰岛素治疗，大多数ii型糖尿病患者随着病程进展，最终也须使用胰岛素控制血糖。现有证据表明，糖尿病患者一旦具有开始胰岛素治疗的指征，就应尽早启动胰岛素治疗，这样可以使血糖得到更持续、稳定、良好的控制，在很大程度上减少并发症的发生。
[0004]
人胰岛素是一种由51个氨基酸组成的蛋白质类激素，由胰脏内的胰岛细胞分泌。胰岛素参与人体内的糖代谢，从而控制人体内的血糖平衡。1978年，美国的genetech公司首次利用生物重组的方法在大肠杆菌内表达胰岛素。在“胰岛素原”的酶切复性过程中，胰蛋白酶识别胰岛素b29位的赖氨酸，产生大量的b30位苏氨酸消去的胰岛素副产物(desb30-胰岛素)。由于desb30-胰岛素和胰岛素之间只相差一个苏氨酸，他们之间的分离非常的困难。现有技术中有关于胰岛素的复性方法，例如在中国专利cn1132845c中公开了获得具有正确键合的胱氨酸键的胰岛素前体的改进的方法，即在半胱氨酸或半胱氨酸盐酸盐和离液助剂存在下，获得到30％～50％的正确复性产物。中国专利cn103172727a中公开了一种高效体积排阻色谱复性同时纯化重组人胰岛素原的方法，尝试该方法在boc胰岛素原进行复性中，结果显示回收率低。
[0005]
现有的重组人胰岛素中间体基本都是采用离子交换与反相层析纯化方式。伊莱利利公司(中国专利cn95196266.3)公开了一种采用c4反相高效色谱柱的纯化方式；康久化学生物技术公司(中国专利，cn200480021270.5)公开了一种采用phenomenex luna phenyl-hexyl反相色谱柱的纯化方式；从已有的文献资料可以看到通过反相高效液相色谱的纯化能够得到产品，但是这种纯化方式对于设备的要求较高，需要整套能够耐受高压的色谱系统，而且制备过程中会使用大量的乙腈等有机试剂，成本较高而且不环保；样品在反相制备柱上的吸附较强，导致回收率不高，且容易对反相制备柱造成不可逆的损坏。
[0006]
boc胰岛素的boc基团修饰能够改变胰岛素前体的疏水区域，促进胰岛素前体的正确折叠。在酶解过程中，b29位boc赖氨酸不会被酶解掉，不会产生b30位苏氨酸消去的胰岛素副产物。


技术实现要素：

[0007]
本发明的目的在于提供一种重组人胰岛素的制备和纯化方法。
[0008]
在本发明的第一方面，提供了一种制备人胰岛素产品的方法，所述方法包括步骤：
[0009]
(i)提供一重组人胰岛素原(第一蛋白)溶液；
[0010]
(ii)利用胰蛋白酶和羧肽酶b对所述重组人胰岛素原(第一蛋白)进行酶切，从而获得经酶切的重组人boc-胰岛素(第二蛋白)，其中，所述重组人胰岛素原与胰蛋白酶的质量比为1:3000-8000，较佳地为1:5000-6000，且所述重组人胰岛素原与羧肽酶b的质量比为1:5000-15000，较佳地为1:8000-12000；
[0011]
(iiii)任选地，对所述经酶切的重组人boc-胰岛素(第二蛋白)进行纯化，获得初步纯化的重组人胰岛素(第三蛋白)；
[0012]
(iv)向上一步骤获得的重组人boc-胰岛素(第二蛋白或第三蛋白)中加入盐酸，进行脱保护反应，从而获得脱保护的重组人胰岛素(第四蛋白)，其中，所述盐酸的浓度为2-4m，较佳地为2.5-3.5m，更佳地为2.8-3.2m；并且，所述盐酸与boc-胰岛素溶液的体积比为(5-10)：100，较佳地(6-8)：100；
[0013]
(v)任选地，对所述的脱保护的重组人胰岛素(第四蛋白)进行纯化，从而制备获得所述人胰岛素产品。
[0014]
在另一优选例中，所述的人胰岛素产品中包含的人胰岛素纯度高于99.5％。
[0015]
在另一优选例中，所述的人胰岛素产品中包含的人胰岛素具有天然胰岛素活性。
[0016]
在另一优选例中，重组人boc-胰岛素是在b29(胰岛素b链29位)为保护赖氨酸的胰岛素。
[0017]
在另一优选例中，所述的保护赖氨酸为带有保护基团的赖氨酸。
[0018]
在另一优选例中，所述的保护赖氨酸为nε-(叔丁氧碳基)-赖氨酸。
[0019]
在另一优选例中，重组人boc-胰岛素为融合蛋白。
[0020]
在另一优选例中，在步骤(ii)中，在胰蛋白酶和羧肽酶b酶切时，所述重组人胰岛素原的b链30位氨基酸不会被水解。
[0021]
在另一优选例中，在步骤(i)中，利用重组人boc-胰岛素生产菌株进行发酵，并分离获得重组人boc-胰岛素蛋白。
[0022]
在另一优选例中，在步骤(i)中，分离获得的重组人boc-胰岛素蛋白为包涵体。
[0023]
在另一优选例中，在步骤(i)中，还包括对所述包涵体进行变性和复性，从而获得蛋白折叠正确的重组人boc胰岛素的步骤。
[0024]
在本发明的第二方面，提供了一种对重组人boc-胰岛素进行酶切的方法，所述方法包括步骤：
[0025]
(i)提供重组人胰岛素原溶液；和
[0026]
(ii)向所述的重组人胰岛素原溶液中加入胰蛋白酶和羧肽酶b，进行酶切反应，从而获得重组人boc-胰岛素溶液；
[0027]
其中，所述重组人胰岛素原与胰蛋白酶的质量比为1:3000-8000，较佳地为1:5000-6000，且所述重组人胰岛素原与羧肽酶b的质量比为1:5000-15000，较佳地为1:8000-12000。
[0028]
在另一优选例中，所述的胰蛋白酶为重组的人胰蛋白酶。
[0029]
在另一优选例中，所述的羧肽酶b为重组的人羧肽酶b。
[0030]
在另一优选例中，所述的重组人胰岛素原包含胰岛素a链、b链和c链。
[0031]
在另一优选例中，所述的重组人胰岛素原的b链29位为保护赖氨酸。
[0032]
在另一优选例中，所述的重组人胰岛素原经生产菌株发酵获得。
[0033]
在另一优选例中，所述的生产菌株发酵获得的人胰岛素原为包涵体形式，对其进行变性和复性后获得蛋白折叠正确的重组人胰岛素原。
[0034]
在另一优选例中，在步骤(ii)中，所述酶切的温度为15-25℃，较佳地为18-22℃。
[0035]
在另一优选例中，在步骤(ii)中，所述酶切的时间为10-25h，较佳地为14-20h。
[0036]
在另一优选例中，在步骤(ii)中，所述的重组人胰岛素原溶液的ph为8.0-9.2。
[0037]
在本发明的第三方面，提供了一种对boc-胰岛素进行脱保护的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
[0038]
(a)提供boc-胰岛素溶液；和
[0039]
(b)向所述的boc-胰岛素溶液中加入盐酸，进行脱保护反应，从而获得脱保护的boc-胰岛素溶液；
[0040]
其中，所述盐酸的浓度为2-4m，较佳地为2.5-3.5m，更佳地为2.8-3.2m；
[0041]
并且，所述盐酸与boc-胰岛素溶液的体积比为(5-10)：100，较佳地(6-8)：100。
[0042]
在另一优选例中，所述的boc-胰岛素溶液的浓度为1-20mg/ml，较佳地为2-12mg/ml。
[0043]
在另一优选例中，在步骤(b)中，所述脱保护反应的温度为36-38℃。
[0044]
在另一优选例中，在步骤(b)中，所述脱保护反应的时间为2-6h，较佳地为4-5h。
[0045]
在另一优选例中，在步骤(b)中，边搅拌边加入所述的盐酸。
[0046]
在另一优选例中，在步骤(b)中，所述脱保护反应在搅拌的条件下进行。
[0047]
在另一优选例中，所述的脱保护方法还包括步骤：
[0048]
(c)向步骤(b)获得的脱保护的boc-胰岛素溶液中加入氨水，从而终止脱保护反应。
[0049]
在另一优选例中，在步骤(c)中，加入氨水从而调节ph至2.0-2.6。
[0050]
在另一优选例中，所述氨水的浓度为2-8m，较佳地为4-6m。
[0051]
在另一优选例中，所述的boc-胰岛素是在b29(胰岛素b链29位)为保护赖氨酸的胰岛素。
[0052]
在另一优选例中，所述的boc-胰岛素是nε-(叔丁氧碳基)-赖氨酸胰岛素。
[0053]
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
[0054]
图1显示了包涵体的sds-page电泳图。
[0055]
图2显示了复性后胰岛素融合蛋白的高效液相检测。
[0056]
图3显示了融合蛋白酶切液的高效液相检测。
[0057]
图4显示了离子层析洗脱收集boc-胰岛素的hplc检测图谱。
[0058]
图5显示了脱保护后重组人胰岛素的hplc检测图谱。
[0059]
图6显示了高压层析收集重组人胰岛素的hplc检测图谱。
具体实施方式
[0060]
本发明人经过广泛而深入地研究，优化了人胰岛素制备过程中的胰蛋白酶和羧肽酶b酶切条件和盐酸脱保护条件，提供了一种新的制备人胰岛素产品的方法。本发明的方法不需要大量无机盐进行溶液沉淀澄清，不需使用大量的有机试剂，生产工艺简单，环境污染小，生产成本低，适宜推广。
[0061]
术语
[0062]
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。
[0063]
术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。
[0064]
胰岛素的合成
[0065]
胰岛素是一种已知氨基酸序列和结构特征的明确定义的肽，是一种具有两条氨基酸链的共51个氨基酸残基的蛋白。该激素含有a链(21个氨基酸)和b链(30个氨基酸)两种独立的肽链，两条氨基酸链上共有6个半胱氨酸残基，每条链上各有两个半胱氨酸残基通过二硫键相互连接。从统计学角度来看，一个人胰岛素分子内形成的二硫键有15种可能性。但这15种可能性中只有一种存在于具有生物活性的人胰岛素中，其二硫键如下:1)a6-a11；2)a7-b7；3)a20-b19。胰岛素原是胰岛素的生物前体，它是由c肽将a链和b链连接起来形成的单一链肽。胰岛素的两条肽链通过二硫键相结合(图1)。
[0066]
胰岛素是由胰岛细胞受内源性物质如葡萄糖的刺激而分泌的一种蛋白质激素。胰岛细胞首先分泌的是由84个氨基酸组成的长链多肽-胰岛素原。胰岛素原经专一性蛋白酶-胰岛素原转化酶pc1和pc2以及羧肽酶e(cpe)的作用，将胰岛素原中间部分(c链)切下，而胰岛素原的羧基部分(a链)和氨基部分(b链)通过二硫键结合在一起形成胰岛素。成熟的胰岛素储存在胰岛细胞内的分泌囊泡中，与锌离子配位形成六聚体。在外界的刺激下，胰岛素随分泌囊泡释放至血液内并发挥其生理作用。具有1型糖尿病的病人由于自身的胰岛细胞产生胰岛素的能力遭到破坏导致其自身血糖调节能力的丧失。
[0067]
目前，有两种路线用于生产各类商业重组人胰岛素—“连锁组合”路线和“胰岛素原”路线。在“连锁组合”路线中，组成胰岛素的两条肽链—a链和b链分别通过生物重组分别进行合成，然后再将a链和b链混合产生二硫键生成具有生物活性的人胰岛素。然而通过直接混合两条肽链来产生具有生物活性的人胰岛素的效率相对比较低，最终的产率只有7％左右。这种方法现在逐渐被第二种路线
-“
胰岛素原”路线所取代。对于“胰岛素原”路线，由胰岛素b链，c链和a链组成的胰岛素原首先在大肠杆菌或者酵母内表达，纯化后在体外进行复性。复性后的胰岛素原再用胰蛋白酶和羧肽酶b进行水解消化获得具有天然活性的人胰岛素。在“胰岛素原”路线中，胰蛋白酶特异性的识别蛋白质中的赖氨酸和精氨酸并裂解在赖氨酸和精氨酸c端的肽键。因为构象的原因，在胰岛素原b22位的精氨酸不被胰蛋白酶水解。但是，胰蛋白酶识别并水解在胰岛素的b29位的赖氨酸，从而不可避免的产生b30位苏氨酸消去的胰岛素副产物(desb30-胰岛素)。为了减少desb30-胰岛素的产生，胰蛋白酶的用量和反
[0068]
应时间必需严格的控制。尽管如此，还是会产生一定量的desb30-胰岛素。因为
desb30-胰岛素和胰岛素之间只相差一个苏氨酸，他们之间的分离非常的困难。工业上普遍使用大型高效液相色谱分离的方法分离胰岛素，但是用这种方法分离胰岛素和desb30-胰岛素会产生大量的工业废物，导致现有重组人胰岛素的生产成本较高。
[0069]
boc胰岛素
[0070]
本发明涉及的重组人胰岛素为boc胰岛素，boc胰岛素的boc基团修饰能够改变胰岛素前体的疏水区域，促进胰岛素前体的正确折叠。在酶解过程中，b29位boc赖氨酸不会被酶解掉，因此不会产生b30位苏氨酸消去的胰岛素副产物，并且酶切时间易于控制；传统工艺依次加入胰蛋白酶与羧肽酶b，本工艺则可以同时加入此两种酶，减少了操作步骤与酶切时间。
[0071]
boc胰岛素纯化工艺优势在于：
[0072]
一、重组人boc胰岛素改变了胰岛素的疏水性，使其易于与其它蛋白质分离，只需一步就可以达到传统方法三到四步的效果。
[0073]
二、传统胰岛粗纯化所使用离子交换层析跟反相层析，上样过程杂质跟胰岛素一起被填料吸附，载量较低。本发明中所用方法上样过程杂质流穿，只有boc胰岛素吸附，载量很大，可达30-50mg/ml。
[0074]
三、boc胰岛素脱保护工艺步骤简单，只需使用hcl调节溶液的ph即可，相较于其它脱保护方式，操作方便，污染少。
[0075]
本发明的主要优点包括：
[0076]
(1)不需要对发酵液上清中过量的无机盐采用稀释、超滤换液等方法去除，该方法中的层析柱分离重组胰岛素前体或类似物前体，一步收率85％以上，纯度90％以上的前体，收率比常规方法高3倍，重组胰岛素产量约800-900mg。并能除去绝大部分色素，由原来的多步工艺直接一步分离纯化，降低了工艺时间和设备投资成本；
[0077]
(2)由于b29位boc赖氨酸的保护，酶切时不会把b30位切掉，不产生des(b30)的副产物，操作简便、易行。
[0078]
(3)酶切时，不需要通过严格控制酶的比例及酶切时间来防止b30位切掉，并且可同时加入两种酶，操作简便、易行。
[0079]
(4)粗纯化与疏水交换层析相比，不需使用大量的硫酸铵做流动相；不使用大量的有机试剂，对环境污染小，成本更低；
[0080]
(5)boc胰岛素脱保护工艺步骤简单，只需使用hcl调节溶液的ph即可，相较于其它脱保护方式，操作方便，污染少。
[0081]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0082]
实施例1重组人胰岛素表达菌株的构建
[0083]
构建重组人胰岛素表达载体，构建方法参照本领域的现有技术，具体地可以参照专利申请号201910210102.9中实施例的记载。将构建的重组人胰岛素表达载体转化大肠杆菌菌株，筛选获得表达重组人胰岛素的重组大肠杆菌菌株。
[0084]
实施例2重组人胰岛素的表达
[0085]
将实施例1获得的重组大肠杆菌，按5％的接种量(体积比)接入大肠杆菌种子液
(公司培育)，37℃，ph7.0，分批补料至ph上升至7.04，然后开始进行碳氮源分开补料，根据恒ph法进行碳源流加。补料11h-发酵结束，碳氮源质量比1:1.0。补料后通过补料及自动流加7.5m氨水，使ph控制在7.0-7.2。培养至4-6小时左右，开始添加2.5g/l l-阿拉伯糖进行诱导，诱导持续14h，至发酵结束。
[0086]
实施例3重组人胰岛素包涵体的制备
[0087]
将实施例2所得发酵液离心后，将湿菌体按1：1体积与破菌缓冲液混合，悬浮3h，悬浮液使用高压均质机破菌三次，破菌后离心收集包涵体，对其进行两次清洗，缓冲液成分为：0.5％t-80，1mm edta-2na，100mm nacl，ph7.5。经清洗后称重包涵体的得率为41-43g/l。
[0088]
sds-page电泳结果如图1所示，结果显示，融合蛋白表达出来，经菌体破碎、清洗、离心后获得重组人胰岛素包涵体。
[0089]
实施例4重组人胰岛素包涵体的变复性及酶切
[0090]
向实施例3所得包涵体中加入7.5-9.0mol/l脲溶解包涵体，室温搅拌溶解，bradford法测定蛋白浓度，控制包涵体溶解液的总蛋白浓度10-20mg/ml，naoh调节ph 11.4
±
0.1，每20mg/ml蛋白浓度，相对应加入4-8mmβ-巯基乙醇(每1g总蛋白加入0.2-0.4mmolβ-巯基乙醇)搅拌混匀。包涵体溶解液滴加至含有0.2-1mmol/l l-胱氨酸,0.3-0.5mmol/l edta-2na，5-10mmol/l甘氨酸的复性缓冲液，将包涵体溶解液稀释5-10倍复性，维持融合蛋白复性液ph值9.0-12，控制温度4-8℃，复性10-20h。
[0091]
c4反相色谱分析复性液，融合蛋白的检测图谱见图2，融合蛋白正确折叠复性率达65％-90％。
[0092]
取重组人胰岛素融合蛋白复性液，控制温度为20℃，调节蛋白溶液ph值为8.0-9.5，按1:6000-1:10000加入重组胰蛋白酶，1:5000-1:15000加入重组羧肽酶b，酶切14-20h，最终获得boc-胰岛素。融合蛋白酶切液的液相检测侧图谱见图3，酶切率高于65％。
[0093]
实施例5 boc胰岛素的初步纯化
[0094]
通过孔径300-750kd超滤膜，对酶切液中的不溶混合物进行分离，截留体积浓缩至50-100倍，以等体积纯化水洗涤截留样品2-3次。根据蛋白质等电点差异，采用离子交换技术对实施例4获得的boc-胰岛素进行初步纯化，以去除大部分杂质，洗脱收集后boc-胰岛素的液相检测图见图4。实验结果为：阴离子交换层析上样前样品中boc-胰岛素纯度约为50％，经阴离子纯化后获得boc-胰岛素纯度达88％以上，且层析洗脱收集boc-胰岛素收率达85％以上。
[0095]
实施例6 boc胰岛素的脱保护
[0096]
用于脱保护样品为实施例5离子交换层析收集的boc-胰岛素样品。
[0097]
离子层析洗脱获取boc-胰岛素，纯水稀释蛋白样品至终体积2.5倍体积以上，控制boc-胰岛素浓度2-12mg/ml，样品加热升温至37℃左右，搅拌加入样品体积8％的3mol/l hcl，控制反应温度在37℃，搅拌4-5h后，加入5mol/l氨水调节ph至2.0-2.6，终止脱保护反应。脱保护后样品的液相检测见图5。脱保护收率达84％以上。
[0098]
实施例7重组胰岛素的聚合物反相层析
[0099]
根据物质的疏水性差异，采用聚合物反相层析柱技术对重组人胰岛素进行纯化，以除去一部分杂质。实施例6确定后参数获得的重组人胰岛素溶液，经过滤澄清后，依次加
入醋酸和乙腈，使ph为2.5-4.5，乙腈比例约为10％。以含有50mmol/l硫酸铵的0.1％三氟乙酸水溶液作为流动相a；以50％乙腈作为流动相b。重组人胰岛素蛋白溶液与填料结合，控制胰岛素上样载量≤10mg/ml，梯度洗脱，收集重组人胰岛素样品。实验结果为，经聚合物反相层析收集后的胰岛素纯度≥93％，收率大于80％。
[0100]
实施例8重组胰岛素的高压纯化
[0101]
根据物质的疏水性差异，采用反相层析柱技术对重组人胰岛素进行精细纯化。实施例7获得的重组人胰岛素溶液，以纯水稀释4倍以上，与c8反相填料结合。以含有乙酸铵，ph4.5-4.6水溶液作为流动相a；乙腈作为流动相b，提高乙腈浓度梯度洗脱，收集胰岛素洗脱峰，hplc检测高压纯化收集胰岛素图谱见图6。
[0102]
实验结果为：经c8反相层析收集胰岛素样品纯度≥99.3％，收率高于90％。
[0103]
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。