一种重组促胰岛素分泌素融合蛋白、制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种重组融合蛋白的制备工艺，尤其设及一种重组促膜岛素分泌素融 合蛋白、制备方法及其应用，该重组促膜岛素分泌素融合蛋白为促膜岛素分泌素与人血清 白蛋白的融合蛋白，该重组促膜岛素分泌素融合蛋白作为糖尿病和肥胖症的长效药物。
【背景技术】
[000引促膜岛素分泌素（英文名称为Exendin-4)是从南美大毒姗Gila monsterGlelodermasuspectum) 口腔分泌物中分离出的一种含有39个氨基酸的多肤 巧ng，J.等，J.Biol.Chem.，265 :20259-62,1990 出ng，J.等，J.Biol.Chem.，267 :7402-05, 1992)。其氨基酸序列与类膜高血糖素（glucagon-likepeptide，GLP-l)有53%的同源性 (Coke等，J.Biol.Chem.，268 :19650-55,1993)。Chen和Drucker克隆了该基因，并得出它 是不同于膜高血糖素基因（GLP-1是由膜高血糖素原加工而成）的另外一个基因的表达产 物（J.Biol.Chem.，272 :4108-15,1997)。
[0003]GLP作为膜高血糖素基因的产物，表达于膜岛α细胞和肠道粘膜L细胞。翻译 产物膜高血糖素原通过翻译后蛋白加工形成多个活性肤，Ν端为膜高血糖素，从C端分切 成61口-1和61口-2，二者与膜高血糖素序列50%同源值^1。1?5'0.1，01油6163，1998,47: 159)。GLΡ-1含有30个氨基酸，葡萄糖和脂肪可刺激其释放。GLP-1具有促膜岛素分泌作 用，刺激膜腺β细胞分泌膜岛素。GLP-1抑制膜腺α细胞分泌膜高血糖素。GLP-1还可W 抑制胃排空（Wettergren等，Dig.Dis.Sci.，1993, 38 (4) :655-73)，抑制膜高血糖素分泌 (Creutzfel化等，Di油etesCare，1996，19(6) :58〇-6)，GLP-l有食欲控制作用（Turton等， 化化re, 1996, 379 (6560) :69-72)，还有报道GLP-1可恢复老年大鼠膜岛细胞对葡萄糖的敏 感性，使其葡萄糖的耐受性恢复到年轻大鼠的水平巧gan等，Di油etologia，1997,40(增刊 1) :A130)。
[0004]GLP-1的半衰期仅数分钟，可被二肤基肤酶IV(dipeptidylpeptidaseIV， DPP-IV)快速降解，去除Ν端二肤，从而失去促膜岛素分泌的活性，DPP-IV分布广泛，在调控 GLP-1 活性中发挥重要作用化ieffer等，Endocrinology, 1995,136 :3585)。GLP-1 的体内 生物作用时间短是其特征之一，运妨碍它开发为治疗药物。
[0005]Exendin-4的簇基端（即C端）含有GLP-1所没有的9个氨基酸，不容易被肤链 内切酶降解；与化P-1的氨基端（即N端）序列化is-Ala-Glu)不同，Exendin-4的N端 倒数第2个氨基酸是甘氨酸化is-Gly-Glu)，不被二肤基肤酶IV分解，对DPP-IV的清除有 抵抗作用，故血浆半衰期更长，具有良好的临床应用前景，是一种更有效而作用时间更长的 GLP-1受体激动剂。
[0006] 药理学研究证实了Exendin-4和GLP-1之间的相似与不同。据报道Exendin-4作 用于分泌膜岛素的β-TCl细胞上的GLP-1受体，豚鼠膜腺分散的腺泡细胞和胃壁细胞。还 报道所述肤刺激促生长素抑制素的释放和抑制立体胃中的胃泌素释放（Goke等，J.Biol. Qiem.，1993, 268 :19650-55 ;Sche卵等，化1·.J.Pharmacol.，1994,69 :183-91;Eissele等， LifeSci.，1994, 55 :629-34)。报道发现Exendin-3和Exendin-4刺激膜腺腺泡细胞产生cAMP和释放淀粉酶（Ma化otra，R.等，RegulatoiT化ptides，41 :149-56，1992;Raufman等， J.Biol.Qiem. 267 :21432-37,1992;Sing等，Regul.化pt. 53 :47-59,1994)。Exendin-4 的 作用时间较GLP-1明显延长。例如在一个实验中，据报道Exendin-4降低糖尿病小鼠葡 萄糖的作用持续数小时，而且根据计量最长长达24小时巧ng.J.，Di油etes，1996,45 (增 刊2) :152A)。根据Exendin-3和Exendin-4的促膜岛素活性，提出将其用于治疗糖尿病W 及防止高血糖巧ng，美国专利号5, 424, 286)，该专利公开了Exendin-4与GLP-1促膜岛素 分泌的对比实验，与GLP-1相比，产生促膜岛素分泌作用所需的Exendin-4浓度更低，而且 Exendin-4在人体内的半衰期更长。大量动物模型实验显示，Exendin-4表现出了与GLP-1 类似的抗糖尿病药的作用。
[0007]Exendin-4作为GLP-1类似物，能够模拟人体内天然的胃肠激素促进膜岛素分泌 及调控血糖等，在多种动物模型中表现出了与GLP-1类似的抗糖尿病药的作用。其作用主 要包括：（1)显著增加葡萄糖依赖性促膜岛素分泌，Exendin-4在血糖水平正常或低血糖时 并不刺激膜岛素的分泌，仅在血糖水平较高时刺激膜岛素分泌；（2)抑制2型糖尿病患者膜 高血糖素的分泌，在高血糖时降低血清中膜高血糖素浓度，但不减弱正常膜高血糖素对低 血糖的反应；（3)刺激膜岛β细胞增生或胚胎膜岛素分泌细胞分化成熟，抑制膜岛β细胞 调亡从而增加膜岛β细胞的数量；（4)抑制餐后胃肠动力及分泌功能，延迟胃排空从而有 利于餐后血糖的控制；（5)降低食欲，减少食物的摄入。与同类药物相比，它除了疗效确切、 副作用更低外，还有目前市场上其它糖尿病治疗药物所不具备的两大优势：不产生低血糖 和有减肥效果。
[0008] 与现有的降糖药相比，促膜岛素分泌素最大的优势在于其独特的作用机制，它可 W在高血糖时刺激膜岛素的分泌，而低血糖时不刺激膜岛素的分泌，运样就有效防止了低 血糖的发生，大大提高了用药的安全性，减少了膜岛素的用量，有效改善了患者的生活质量 及用药危险性。
[0009] 多肤类药物由于受体内蛋白酶降解和肾脏快速清除作用，体内半衰期较短，用药 周期短。虽然Exendin-4相比于GLP-1在体内具有更长的半衰期，但临床上仍需要每天注 射两针，给病患带来极大的不便和痛苦。因此，开发长效的Exendin-4制剂，就具有十分重 要的意义。
[0010] 白蛋白（又称清蛋白，a化umin，A化）系由肝实质细胞合成，在血浆中的半衰期约 为15-19天，是血浆中含量最多的蛋白质，占血浆总蛋白的40%-60%。它的主要作用是扩 充血容量和维持血浆的渗透压。人血清白蛋白（简称HSA)是一种含有585个氨基酸的单 链无糖基化的蛋白质，分子量化为66000~69000道尔顿，等电点pI4. 7~4. 9。HSA本身 就是许多内源因子和外源药物的载体，药物和血清白蛋白结合后，可W减少其生物利用度 同时增加在体内的半衰期（Lucas等JAmChemSoc，2004,126 (43) :14258-14266.)。大多 数治疗用的蛋白和多肤半衰期一般较短，而HSA有将近长达19天（PetesTP.AllAbout A化umin.SanDiego:AcademicPress，1996.)的血清半衰期，并且HSA的基因在毕赤酵母 中可W高效分泌表达（ChuangVT等，PharmRes，2002，19(5) :569-577),上清液杂质含量 较少，纯化方便，因此将蛋白质药物基因与HSA基因融合，在毕赤酵母或酿酒酵母中表达， 获得HSA的融合蛋白，延长蛋白质药物的半衰期。
[0011] 美国马里兰州人类基因组科学化G巧公司已经进行一系列与HSA融合延长蛋白质 药物半衰期的研究，其蛋白质药物HSA/IFN-a融合蛋白（A化uferon-a)研究结果表明， Albuferon- α平均半衰期148小时，比PEG化干扰素化gasys平均半衰期80小时巧0-140 小时）和PEGIntron平均半衰期40小时（22-60小时）更长。它有很好的抗病毒活性，安全 性和耐受性。病人用药后产生对HSA抗体为1.7%，但未用药者存在HSA抗体达3. 4%，并 且在抗体产生副反应，抗病毒反应和药代动力学之间没有明显的相关性（Osborn B L等，J Pharmacol Exp Ther?2002?303 (2) :540-548 ；Human Genome Sciences民eports Positive Results of Phase 1/2 Clinical Trial of Albuferon in Chronic Hepatitis C. HGSI Press，2004，Nov. 2 ;Human Genome Sciences民eports Positive Results of Phase 2 Clinical Trial of Albuferon in Treatment Naive Patients with Chronic Hepatitis C. HGSI Press，2005, Apr. 14)0
[0012] 天然肠激酶（英文名称为Enterokinase)由一条结构亚基（重链）和一条催化弧 基（轻链）构成，肠激酶在体内激活膜蛋白酶原转化为膜蛋白酶。由于肠激酶的轻链结构 在人、牛和猪中保守，其识别序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys在脊椎动物中也有很强的保守性， 且几乎所有被定序的膜蛋白酶原都具有4个天冬酷胺相连的特征，此序列在其他的天然 蛋白质上又非常罕见，而肠激酶的活性中屯、有一个特殊的阳离子位点，使得有强大负电的 Asp-sp-Asp-Asp-Lys可W与此阳离子位点结合。因此，牛肠激酶的底物酶切位点序列具有 高度的特异性。运种特点使得天然肠激酶成为基因工程融合蛋白表达后修饰过程中一个极 其有用的工具而被广泛应用。
[0013]
【发明内容】
[0014] 鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供一种重组促膜岛素分泌素融合蛋白，在 该融合蛋白中，两个促膜岛素分泌素巧xendin-4)分别位于人血清白蛋白化SA)的两端， 便于各自发挥对受体的结合作用；同时，在促膜岛素分泌素巧xendin-4)与人血清白蛋白 化SA)之间引入连接肤，增加促膜岛素分泌素的空间绕性，既避免了空间位阻效应，又有效 防止了免疫原性的产生。同时，通过将Exendin-4多肤与HSA形成融合蛋白来延长其体内 半衰期，从而大大减少每个治疗周期的药物注射次数。
[0015] 本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
[0016] 一种重组促膜岛素分泌素融合蛋白，其多肤区包括促膜岛素分泌素和人血清白蛋 白，所述促膜岛素分泌素W单体或者多个单体的形式通过连接肤与人血清白蛋白串联在一 起，所述促膜岛素分泌素序列的氨基端和/或簇基端通过连接肤与人