专利名称：表达ctb和人胰岛素融合蛋白的重组家蚕杆状病毒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种重组昆虫杆状病毒、通过该重组病毒制备融合蛋白及其在制备抗I型糖尿病口服药物中的应用。
背景技术：
I型糖尿病(胰岛素依赖性糖尿病，IDDM)由胰岛素分泌缺陷产生，它是一种针对胰岛β细胞的自身免疫性疫病。虽然导致IDDM的自身抗原包括胰岛素谷氨酸脱羧酶、胰岛素、热休克蛋白、羧基肽酶H等多种抗原，但是实验中仅给动物口服一种自身抗原-胰岛素，即诱导了免疫耐受，产生了保护作用(Science，1994，2651237)。这是由于口服抗原能诱导调节性T细胞分泌抑制性细胞因子，如TGF-β，对由相互间无关的各种抗原诱导的、但在同一特异器官发生的所有病理免疫反应进行抑制，即抗原驱动旁观者抑制(Antigen-drivenBystander Suppression)。旁观者抑制的诱导是抗原特异性的，而效应是非特异的，这为预防I型糖尿病等自身免疫疾病提供了一条新的途径(ImmunolToday，1998，19173)。同时，研究表明霍乱毒素B亚基(CTB)可作为诱导口服耐受的强大粘膜运载系统，并且CTB偶联抗原可能涉及到与传统大剂量口服自身抗原产生免疫耐受效应明显不同的免疫调节机制，可能涉及到发炎细胞的移动行为的变化(Nat Biotechnol，1998，16，292)，暗示CTB偶联自身抗原不仅使应用口服耐受防治I型糖尿病等自身免疫性疫病更具有实际应用价值，而且还有潜在的治疗前景(Proc Natl Acad Sci USA，1997，944610)。
目前表达融合蛋白主要是通过转基因植物来进行，其缺陷是表达量太低，只占可溶性蛋白含量的0.01-0.4％，产生的耐受效应亦低。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种CTB与人胰岛素重组基因以及含有该重组基因的家蚕杆状病毒表达系统。
本发明的目的之二是提供一种CTB与人胰岛素融合蛋白及其制备方法。
本发明的目的之三是提供一种用重组家蚕杆状病毒感染的蚕幼虫和蛹制备的抗I型糖尿病口服药物及其制备方法。
本发明通过如下技术方案来实现。
家蚕杆状病毒表达系统(Bombyx mori Nuclear polyhedrosis Virus)是真核表达系统，该技术自1983年Smith等首创以来，已有百种外源基因在该系统表达(《昆虫病毒分子生物学》，1998，547)。由于家蚕淋巴血本身的大量蛋白的保护作用和一些未知机理的作用，家蚕表达的蛋白可以生产口服药物。本发明运用分子克隆技术获得CTB与人胰岛素融合基因，采用家蚕杆状病毒表达系统(Bombyxmori Nuclear polyhedrosis Virus)，并在家蚕幼虫和蛹中表达该融合蛋白，经分离纯化，冷冻干燥，制成口服药物。
具体的技术方案是(1)构建重组质粒pBac-INS根据人胰岛素基因序列(Science 1980；20857)设计6条引物，具体序列见表1，其中F1、F2、F3为正向引物，R1、R2、R3反向引物，F1的5’端加有BamHI位点，R1的5’端加有EcoRI位点(黑体表示)。其中B链与A链之间的C肽被6个氨基酸RRGSKR取代，以便可以被蛋白酶酶解(Gene 1981；1663)。通过一次链延伸反应和两次PCR的方法获得目的序列后将其连接在转移载体pBacPAK8上，获得重组质粒pBac-INS。
表1
*SINSEQ ID NO.
(2)构建融合基因CTB-INS设计3条引物，具体序列见表2。引物Pct和P1用来去除CTB基因的终止子并在其3’端加上连接头的序列；引物P2和R1用来去除人胰岛素基因的起始密码子并在其5’端加上连接头的序列(黑体表示)。以pBac-CTB质粒(该质粒已经由中国01144502.5专利申请“霍乱毒素B亚基的制法”公开，并且在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，保藏编号为CGMCC No.0594)为模板、Pctb和P1为引物进行扩增，使CTB基因与人胰岛素基因之间以柔性四肽(GPGP)连接，获得片段CTB-GPGP。以pBac-INS质粒为模板、P2和R1为引物，通过扩增获得INS-GPGP。以CTB-GPGP和INS-GPGP互为引物和模板进行链延伸反应，得到产物记为S1，再以S1为模板、Pctb和R1为引物进行扩增，获得大小约为560bp左右的融合基因CTB-INS。融合基因序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
表2
(3)构建含有融合基因的昆虫杆状病毒转移质粒pBac-CTB-INS将PCR获得的目的片段(CTB-INS)经BamHI和EcoRI双酶切后，连接在同样被BamHI和EcoRI双酶切的转移载体pBacPAK8上，构建含CTB与人胰岛素融合基因的杆状病毒转移质粒pBac-CTB-INS，其构造见图1；(4)含CTB与人胰岛素融合基因的重组家蚕杆状病毒BmBacCTBINS的获得将转移质粒pBac-CTB-INS与家蚕核型多角体病毒DNA进行共转染家蚕(Bombyxmori)细胞BmN，进行10轮空斑和Southern点杂交筛选，筛选出含CTB与人胰岛素融合基因的重组昆虫杆状病毒BmBacCTBINS。该病毒已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，保藏日期为2003年11月7日，保藏编号为CGMCC No.1033；(5)表达CTB与人胰岛素融合蛋白将重组杆状病毒BmBacCTBINS感染BmN家蚕细胞进行病毒扩增，然后将扩增后的重组杆状病毒BmBacCTBINS注射至家蚕幼虫和蛹体内，分别取家蚕幼虫和蛹淋巴血，经5000rpm 5分钟离心后取上清，稀释10倍后加等体积的2×蛋白上样缓冲液，进行12％的SDS-PAGE分析。用考马斯亮蓝R250染色，结果见图2。从SDS-PAGE和Wersten印迹(图3)结果可以看出，CTB与人胰岛素融合基因在家蚕幼虫和蛹中的表达产物为21kD左右，与预测大小一致。对CTB与人胰岛素融合的表达产物进行免疫活性鉴定，结果表明表达产物具有很强的免疫活性，通过CTB标准品可以计算得出在幼虫和蛹体中的表达量分别达到500μg/ml和600μg/ml，大大高于在转基因植物中的表达量，实现了高效表达。
在家蚕幼虫和蛹体表达出来的CTB与人胰岛素融合蛋白，经过过滤、离心、冷冻干燥后，以家蚕幼虫和家蚕蛹为填充料配制成口服药物。
本发明的有益效果是用蚕高效表达CTB与人胰岛素融合蛋白，比直接从原核生物中表达的融合蛋白活性高，比通过转基因植物表达的产率高；家蚕是可以无菌大规模饲养经济昆虫，可以低成本地大规模饲养，而且不会造成公害；蚕体中有多种天然蛋白质保护剂，对表达产物有保护作用，使基因表达产物十分稳定家蚕生产的融合蛋白可以作为口服药物，为患者解除了注射的痛苦和被感染的威胁。
图1是含CTB与人胰岛素融合基因的昆虫杆状病毒转移质粒pBac-CTB-INS(图注说明AcMNPV/AcNPV苜蓿银纹夜蛾多角体病毒多角体启动子5’端/3’端旁侧序列；P苜蓿银纹夜蛾多角体病毒多角体启动子；A(Polyhedin Poly A+signal)多角体蛋白基因聚腺苷酸化信号；M13 oriM13噬菌体复制起始点；Amp氨苄青霉素基因；oripUC复制起始点)图2是家蚕表达产物的SDS-PAGE分析图谱，其中M、标准蛋白分子量标记；1、BmCTBINS感染的家蚕血淋巴；2、野生病毒感染的家蚕血淋巴。
图3是家蚕表达产物的Western分析，其中M、标准蛋白分子量标记；1、BmCTBINS感染的家蚕血淋巴；2、野生病毒感染的家蚕血淋巴。
具体实施例方式
下面通过实施例进一步阐述本发明，但并不限制本发明的保护范围。
〔实施例1〕CTB与人胰岛素融合基因的构建首先，根据已发表的人胰岛素基因序列设计6条引物(Science 1980；20857)，其中B链与A链之间的C肽被6个氨基酸的“mini-C”肽(RRGSKR)取代(Gene 1981；1663)其中F1、F2、F3为正向引物，R1、R2、R3反向引物(表1)，F1的5’端加有BamHI位点，R1的5’端加有EcoRI位点(黑体表示)。
通过一次链延伸反应和两次PCR的方法获得人胰岛素(1)链延伸反应体系含有引物F3和R3，5单位的Taq酶和其他常规PCR试剂(上海生工公司)；反应条件为94℃变性10分钟，55℃退火5分钟后让F3和R3互为引物和模板在72℃延伸5分钟，得到产物记为SegI；(2)第一次PCR以SegI为模板，F2和R2为引物，反应条件为94℃预变性5分钟，扩增时94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，反应30个循环，最后72℃保温5分钟，此时产物记为SegII，并用DNA清洁试剂盒(杭州维特洁生物技术公司)纯化该产物；(3)第2次PCR以纯化的SegII为模板，F1和R1为引物，反应条件为94℃预变性5分钟，扩增时94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，反应30个循环，最后72℃保温10分钟，最后得到PCR产物记为SegIII。再次纯化该目的片段后，用BamHI和EcoRI双酶切低熔点琼脂糖凝胶回收基因片段，与同样经BamHI和EcoRI双酶切的pBacPAK8载体片段连接，经过酶切和PCR鉴定获得重组质粒pBac-INS，通过测序证明人胰岛素基因的核苷酸序列完全正确。
为构建融合基因，再设计3条引物Pctb、P1和P2，使CTB基因与人胰岛素基因之间以柔性四肽(GPGP)连接。以pBac-CTB质粒为模板，Pctb和P1为引物，反应条件为94℃预变性5分钟，扩增时94℃1分钟，59℃1分钟，72℃1分钟，反应30个循环，最后72℃保温10分钟，获得片段记为CTB-GPGP；同样以pBac-INS质粒为模板，P2和R1为引物，反应条件为94℃预变性5分钟，扩增时94℃1分钟，57℃1分钟，72℃1分钟，反应30个循环，最后72℃保温10分钟，获得片段记为GPGP-INS。最后以片段CTB-GPGP和GPGP-INS构建融合基因，首先进行链延伸反应反应体系中纯化过的CTB-GPGP和GPGP-INS互为引物和模板，反应条件为94℃变性10分钟，59℃退火5分钟，72℃延伸5分钟，得到产物记为S1。再以S1为模板，Pctb和R1为引物，扩增时反应条件为94℃预变性5分钟，扩增时94℃1分钟，59℃1分钟，72℃1分钟，反应30个循环，最后72℃保温10分钟，获得大小约为560bp左右的目的融合基因CTB-INS。
〔实施例2〕CTB与人胰岛素融合基因的昆虫杆状病毒转移质粒的构建将上述目的融合基因进行BamHI和EcoRI双酶切后连在同样被BamHI和EcoRI酶切的pBacPAK8(CLONTECH公司)上，构建含CTB与人胰岛素基因的杆状病毒转移质粒pBac-CTB-INS，经酶切分析和PCR鉴定基因正确插入后，经过自动序列测定表明构建的融合基因序列完全正确，融合基因序列及其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
〔实施例3〕CTB与人胰岛素融合基因的重组杆状病毒的获得取5ul含CTB与人胰岛素融合基因的昆虫杆状病毒转移质粒pBac-CTB-INS和6ul野生家蚕核型多角体病毒DNA进行共转染。取6ul Lipofectin(GIBCOBRL公司)加入100ul无血清的TC-100培养基混均。将事先培养在35mm Dish中的BmN细胞用无血清的TC-100(GIBCOBRL公司)培养基洗涤两次，并逐滴加入转移质粒和Lipofectin混合物，27℃培养4-5天，收取上清进行第一轮空斑筛选。取5ul上清感染35mm Dish中的BmN细胞，1小时后弃去上清加入等量混合的TC-100培养基和低熔点琼脂糖。4-5天后挑取空斑，感染Bm N细胞3-4天，保存上清，细胞用NaOH裂解用于Southern杂交，取阳性克隆的上清进行第10轮空斑筛选。取阳性克隆的上清感染Bm N细胞扩增。即可得到大量的含CTB与人胰岛素融合基因的重组杆状病毒，该病毒已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，地址在北京中关村，保藏日期为2003年11月7日，保藏编号为CGMCC No.1033。
〔实施例4〕CTB与人胰岛素融合基因在家蚕幼虫和蛹中的表达取扩增的含CTB与人胰岛素融合基因的重组杆状病毒注射到五龄家蚕(Bombyx mori)幼虫和蛹中，每头注射2ul左右(滴度为1×107/ml)，分别取24、48、72、96、120和144小时表达的家蚕淋巴和蛹血，5000rpm 5min离心后取上清，用PBS pH7.4稀释10倍后，加入等体积的2×蛋白质上样缓冲液(100MmTris.HCl，4％SDS，0.1％溴酚蓝，10％甘油)，取20ul进行SDS-PAGE分析。结果表明，CTB与人胰岛素融合蛋白在家蚕和蛹中获得高效表达，经Western杂交表明表达产物分子量为21kD。
〔实施例5〕蚕表达的CTB与人胰岛素融合蛋白的免疫活性测定将家蚕幼虫和蛹体含有表达的CTB与人胰岛素融合蛋白的血淋巴，高速冷冻离心，取上清。稀释1000倍后包被酶标板，同时以CTB为标准品，按照常规的ELISA步骤操作，其中兔抗CT一抗(购自SIGMA公司)稀释5000倍，山羊抗兔二抗(购自华美生物工程公司)稀释1000倍，用OPD(购自上海化学试剂公司)显色，于492nm处测定OD值，结果表明幼虫和蛹体表达的目的蛋白有很强的免疫活性，表达量分别达到500μg/ml和600μg/ml。
〔实施例6〕在家蚕幼虫和蛹中的表达的CTB与人胰岛素融合蛋白口服药物的制备用重组病毒BmBacCTBINS穿刺接种五龄家蚕幼虫和蛹体(申请人自行饲养)，收集表达第5天的蚕淋巴血和蛹体，12000rmp高速离心，取上清用于活性测定。上清经过过滤(100KD超滤)，12000rmp高速离心，再经35000rmp离心后取上清冷冻干燥后，以家蚕蛹为填充料配制成口服药物。
〔实施例7〕家蚕幼虫蚕蛹表达的CTB与人胰岛素融合蛋白进行动物试验将4周龄雌NOD小鼠随机分成4组，前两组每组5只，做病理学分析，后两组每组10只，做糖尿病监测。从第5周开始口服给药，剂量为100μg/鼠，每周给药2次。做病理分析的，连续喂5周，糖尿病监测的连续喂25周。前后两组中均有一组为阴性对照，口服给正常蚕血淋巴。病理学分析第10周处死小鼠，取其尾静脉血作抗体滴度测定，测定口服后小鼠产生的胰岛素抗体水平；并取小鼠胰岛作组织切片，观察胰岛炎发生情况，并作相应评分。糖尿病检测从第10周起，检测NOD小鼠尿液的尿糖情况，阳性者继续测血糖，如果连续两周血糖含量大于或等于16.7mmol/L，则判定为该小鼠患糖尿病。分别对两组中小鼠患病率进行比较统计分析。小鼠胰岛作组织切片结果表明给药组胰岛炎显著低于对照NOD小鼠；25周后阴性90％对照NOD小鼠已患糖尿病，而给药组则只有20％NOD小鼠已患糖尿病。
序列表<110>浙江大学<120>表达CTB和人胰岛素融合蛋白的重组家蚕杆状病毒及其在制备抗I型糖尿病口服药物中的应用<160>11<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>558<212>DNA<213>Artificial<400>1atgattaaat taaaatttgg tgtttttttt acagttttac tatcttcagc atatgcacat 60ggaacacctc aaaatattac tgatttgtgt gcagaatacc acaacacaca aatacatacg120ctaaatgata agatattttc gtatacagaa tctctagctg gaaaaagaga gatggctatt180attactttta agaatggtgc aacttttcaa gtagaagtac caggtagtca acatatagat240tcacaaaaaa aagcgattga aaggatgaag gataccctga ggattgcata tcttactgaa300gctaaagtcg aaaagttatg tgtatggaat aataaaacgc ctcatgcgat tgccgcaatt360agtatggcaa atggccccgg cccctttgtg aaccaacacc tgtgcggctc acacctggtg420gaagctctct acctagtgtg cggggaacga ggcttcttct acacacccaa gacccgccgg480ggctccaagc gtggcattgt ggaacaatgc tgtaccagca tctgctccct ctaccagctg540gagaactact gcaactaa 558
<211>185<212>PRT<213>Artificial<400>2Met Ile Lys Leu Lys Phe Gly Val Phe Phe Thr Val Leu Leu Ser Ser1 5 10 15Ala Tyr Ala His Gly Thr Pro Gln Asn Ile Thr Asp Leu Cys Ala Glu20 25 30Tyr His Asn Thr Gln Ile His Thr Leu Asn Asp Lys Ile Phe Ser Tyr35 40 45Thr Glu Ser Leu Ala Gly Lys Arg Glu Met Ala Ile Ile Thr Phe Lys50 55 60Asn Gly Ala Thr Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp65 70 75 80Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Ala85 90 95Tyr Leu Thr Glu Ala Lys Val Glu Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys100 105 110Thr Pro His Ala Ile Ala Ala Ile Ser Met Ala Ash Gly Pro Gly Pro115 120 125Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr130 135 140Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg145 150 155 160Gly Ser Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser165 170 175Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn180 185<210>3<211>40
<212>DNA<213>Artificial<400>3ggggatccat gtttgtgaac caacacctgt gcggctcaca40<210>4<211>45<212>DNA<213>Artificial<400>4cctgtgcggc tcacacctgg tggaagctct ctacctagtg tgcgg 45<210>5<211>50<212>DNA<213>Artificial<400>5ctacctagtg tgcggggaac gaggcttctt ctacacaccc aagacccgcc 50<210>6<211>39<212>DNA<213>Artificial<400>6gggaattctt agttgcagta gttctccagc tggtagagg 39<210>7<211>50<212>DNA<213>Artificial<400>7
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权利要求
1.一种融合基因，其特征在于由人胰岛素基因和CTB基因重组而成，具有SEQ ID NO.1所示的碱基序列。
2.一种重组家蚕杆状病毒，其特征在于包含有SEQ ID NO.1所示碱基序列的融合基因，保藏编号为CGMCC No.1033。
3.权利要求2所述的重组家蚕杆状病毒的制备方法，包括如下步骤(1)构建重组质粒pBac-INS(a)以F3和R3互为引物和模板，延伸得到产物SegI(b)以SegI为模板，F2和R2为引物，扩增得到产物SegII(c)以纯化的SegII为模板，F1和R1为引物，扩增得到PCR产物SegIII，再次纯化该目的片段后，用BamHI和EcoRI双酶切低熔点琼脂糖凝胶回收基因片段，与同样经BamHI和EcoRI双酶切的pBacPAK8载体片段连接，获得重组质粒pBac-INS；(2)构建融合基因CTB-INS(a)以pBac-CTB质粒为模板、Pctb和P1为引物进行扩增，获得片段CTB-GPGP(b)以pBac-INS质粒为模板、P2和R1为引物，通过扩增获得片段INS-GPGP(c)以CTB-GPGP和INS-GPGP互为引物和模板进行链延伸反应，得到产物S1，再以S1为模板、Pctb和R1为引物进行扩增，获得融合基因CTB-INS；(3)将上述融合基因进行BamHI和EcoRI双酶切后连在同样被BamHI和EcoRI酶切的pBacPAK8上，构建含CTB与人胰岛素基因的杆状病毒转移质粒pBac-CTB-INS；(4)取含CTB与人胰岛素融合基因的昆虫杆状病毒转移质粒pBac-CTB-INS和野生家蚕核型多角体病毒DNA进行共转染获得含CTB与人胰岛素融合基因的重组家蚕杆状病毒BmBacCTBINS；其中，引物F1序列为<SEQ ID NO.3>5’-GGGGATCCATGTTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACA-3’引物F2序列为<SEQ ID NO.4>5’-CCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTCTCTACCTAGTGTGCGG-3’引物F3序列为<SEQ ID NO.5>5’-CTACCTAGTGTGCGGGGAACGAGGCTTCTTCTACACACCCAAGACCCGCC-3’引物R1序列为<SEQ ID NO.6>5’-GGGAATTCTTAGTTGCAGTAGTTCTCCAGCTGGTAGAGG-3’引物R2序列为<SEQ ID NO.7>5’-TCCAGCTGGTAGAGGGAGCAGATGCTGGTACAGCATTGTTCCACAATGCC-3’引物R3序列为<SEQ ID NO.8>5’-TTGTTCCACAATGCCACGCTTGGAGCCCCGGCGGGTCTTGGGTGTGTAGA-3’引物Pctb序列为<SEQ ID NO.9>5’-CGGGATCCATGATTAAATTAAAATTTGG-3’引物P1序列为<SEQ ID NO.10>5’-GGGGCCGGGGCCATTTGCCATACTAATTG-3’引物P2序列为<SEQ ID NO.11>5’-GGCCCCGGCCCCTTTGTGAACCAACACCT-3’。
4.一种融合蛋白，其特征在于由人胰岛素和CTB重组而成，具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
5.权利要求4所述的融合蛋白的制备方法，包括如下步骤(1)构建重组质粒pBac-INS；(2)构建融合基因CTB-INS；(3)构建含有融合基因的昆虫杆状病毒转移质粒pBac-CTB-INS；(4)获得含CTB与人胰岛素融合基因的重组家蚕杆状病毒BmBacCTBINS；(5)表达CTB与人胰岛素融合蛋白将重组杆状病毒BmBacCTBINS感染BmN家蚕细胞进行病毒扩增，然后将扩增后的重组杆状病毒BmBacCTBINS注射至家蚕幼虫和蛹体内，表达出融合蛋白。
6.一种治疗I型糖尿病的药物，其特征在于包括如权利要求4所述的融合蛋白和家蚕填充剂。
7.权利要求6所述的治疗I型糖尿病药物的制备方法，其特征在于将表达CTB与人胰岛素融合蛋白的家蚕幼虫和蛹经过滤、离心和冷冻干燥后制成。
全文摘要
本发明属于生物技术制药工程中的基因工程生产多肽类药物技术领域。通过家蚕杆状病毒表达系统(Bombyx mori Nuclear polyhedrosis Virus)重组带有CTB与人胰岛素融合基因，获得重组病毒，将该重组病毒接种家蚕幼虫、蛹进行表达，经冷冻干燥，制成口服药物，经动物试验，对小鼠具有明显的降血糖和抑制糖尿病的作用，成为一种制备抗I型糖尿病的口服药物的新型方法。与现有技术相比，原料易得，生产成本低，治疗效果良好，具有十分重大的市场开发应用前景。
文档编号A61P3/10GK1629288SQ20031012113
公开日2005年6月22日 申请日期2003年12月15日 优先权日2003年12月15日
发明者金勇丰, 张耀洲, 龚朝晖 申请人:浙江大学