ACVR1-Fc融合蛋白及其制法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术和医学领域。具体而言，本发明设及活化蛋白A受体 1-Fc(activinAreceptor,typeI-Fc，ACVRl-Fc)融合蛋白、其制备方法W及其在预防和 /或治疗与ACVR1异常（例如ACVR1突变和/或过度活化）相关的疾病或症状（例如骨化 过度相关的疾病、扩散型内因性脑桥神经胶质瘤、卵巢癌等）中的应用。
【背景技术】
[0002]ACVR1，即骨形态发生蛋白度MP)I型受体的亚型之一Activin受体IA型 (ActRIA)，也被称为Activin受体样激酶 2(Activinreceptor-likekinase2,ALK2)。
[0003] ACVRl属于转化生长因子βOOF-β)超家族受体I型，整个受体蛋白是由胞外段、 穿膜段和胞内段组成。胞内段的C末端是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，起着向下传递信号的作 用。胞内段靠近膜区域是GS区域。胞外段接受外来因子的刺激，将信号传递到胞内。ACVR1 接受信号的方式有2种，一种是直接和骨形态发生蛋白（比如BMP-2或BMP-6)结合，另一 种也是主要的方式是，骨形态发生蛋白（如BMP-4)和TGF0超家族受体II型（ACVR2)结 合，结合了细胞因子的ACVR2再和ACVR1结合，然后把外来信号传递到胞内。
[0004] 进行性骨化性纤维增殖不良症（fibrodysplasiaossificansprogressiva， FOP)，也称进行性骨化性肌炎（myositisossificansprogressiva,MOP)，是一种灾难性、 罕见的先天性致残性疾病，其W自发产生的肌肉炎症或肌肉受损伤诱导的进行性异位成骨 为特征，并导致关节融合和活动障碍W。
[0005] 目前对此病没有确切的有效治疗方法。手术切除异位骨只会招致原位病灶复发或 病情加重。在早期诊断出的情况下，临床上通常用的治疗方法有预防进一步的伤害、调节局 部区域功能、抗炎症等W。有报道，在个别病人身上，用糖皮质激素、非酱体抗炎药NSAID、 二麟酸盐化is地OS地onates)、罗格列酬和放射治疗有一定效果，但效果不明显。
[0006] 过去对F0P的研究进展缓慢，而近几年对其研究进展迅速，在其致病机理上有了 许多新的发现：
[0007] I)部份F0P致病细胞的性质得到鉴定：
[0008] 虽然已知在骨骼肌炎症部位有多种炎症细胞（包括单核细胞、巨隧细胞、肥大细 胞和T/B淋己细胞）侵润，但关键性的致病细胞（即软骨细胞和成骨细胞的来源细胞）种类 不完全清楚。Lounev等W用谱系追踪（lineagetracing)方法在近似F0P表型的转基因 小鼠发现病灶区约40-50%的软骨细胞和成骨细胞带有血管内皮细胞标志物Tie2;Medici 等w进一步证明体外培养的转染了R20細突变体的人厮静脉内皮细胞（HUVEC)可分化为 软骨细胞和成骨细胞，运可W证明血管内皮细胞是F0P致病细胞的一部份，但另外约50% 的致病细胞性质不明。
[0009] IDACVRI基因突变是F0P发生的中屯、环节：
[0010] 在2006年，研究证明骨形态发生蛋白度MP)I型受体的亚型ACVR1的基因突变和 F0P的发生有直接的关联。
[0011] 在中国某个病例组（70多例）显示，高达98. 4%的患者ACVRl基因外显子发生 了杂合型单个碱基突变化17G〉A)，该突变导致ACVR1的第206位精氨酸被组氨酸代替 (R206H)，使ACVR1功能增强。ACVR1的结构属于单次跨膜蛋白（其序列如图1所示），R206H 的突变位于其中的甘氨酸/丝氨酸富含区（GS区，178-207位），此区域氨基酸序列在包括 人类的多种动物间高度保守，提示其功能非常重要。
[0012]ACVR1的蛋白质分子模拟结果显示w:acVR1活性增强的基因突变巧206H)位于胞 内段靠近膜区域是GS区域。该第206位的精氨酸（时所形成的小侧链与主链α螺旋紧贴， 对全分子的结构稳定有重要作用，在F0P患者该精氨酸被换成组氨酸（Η)，则组氨酸与主链 α螺旋远离，导致ACVR1分子不稳定，相关的表现是患者淋己细胞受体下游的Ρ38ΜΑΡΚ信号 通路活性增强W度MP-Smad信号通路活性并不增强），W及体外培养的牙髓细胞BMP-Smad 和BMP-MAPK信号通路活性都增强W。运些研究结果提示患者R206H突变导致了ACVRl活 性组成型增强（constitutivelyactive)。
[0013] III)FOP动物模型的建立：
[0014] 贴近病人实际情况的ACVR1基因杂合型突变或敲入（knock-in)动物模型难W建 立，但已经建立的Ξ种动物模型也可借鉴用于研究。历史上已经建立了几种近似F0P表型 的模式动物，运些模式动物种类有：
[001引 （A)因为早先已经认识到ALK2的Q207D突变可致ALK2活性变为组成型活化，所W化kuda等m用含Q207D的ALK2突变体做转基因动物，结果胚胎于孕中期胎死宫内，运个 失败的结果提示要建立全身R20細突变的小鼠模型有失败的可能性，所W化等?在此基 础上改用带化e酶的腺病毒（Ad.化e)对已经装配有条件性表达ALK2Q207D的小鼠肌肉注 射，导致ALK2Q207D在小鼠骨骼肌表达并诱发肌炎（腺病毒会诱发肌炎），获得了F0P患者 的部份表型（即肌肉中发生骨化，关节活动受限）；
[0016] 度)Glaser等W用混合了BMP4或BMP2的基底膜蛋白基质胶（Matrigel)植入小 鼠腹部肌肉中，植入部位产生了与F0P患者相似的异位骨化；
[0017] (C)Kan等M3发现神经元特异性締醇化酶（NS巧启动子-BMP4转基因小鼠会在神 经-肌肉接头处过度表达BMP4,导致骨骼肌炎症和异位骨化（当然还伴有脑组织异常）W。
[0018] 虽然运些模型动物不能准确反映F0P患者的体内异常，但仍然可W用于F0P的治 疗研究，特别是上述（A)种模型动物，其病因和致病方式与人类F0P已经很相似，ACVR1或 ACVR2的配体对疾病的发生和发展起了触发作用。
[0019] 本领域中虽然对F0P的机理和治疗方法有一定的研究，但仍然缺乏有效的治疗药 物和方法，因此仍存在开发出相关药物和方法的迫切需求。
[0020] 除了ACVR1基因突变导致F0P外，ACVR1基因突变还和高级别胶质瘤（简称HGG， 也称为小儿脑瘤）有关联。在2014年，包括美国和欧洲在内的的4个研究小组几乎同时发 现，在被诊断为扩散型内因性脑桥神经胶质瘤（简称DIPG，高级别胶质瘤的一种亚型）的患 者中，20-30%的患者发生了ACVR1基因突变，而且运些突变会反复的出现E12 。对DIPG患 者ACVR1基因突变的分析显示，它们和F0P患者ACVR1基因的突变非常类似，也导致ACVR1 蛋白的BMP/TGF0信号通道的持续激活。有15-20%的儿童脑瘤和脊髓肿瘤属于高级别胶 质瘤，目前有效的治疗手段有手术治疗，放疗和化疗，但长期存活率仍低于20 %。
[002。 此外，研究还显示正常ACVR1基因及蛋白与肿瘤有关。有报道称Μ"，卵巢癌病人 血液中含有高于正常人含量的应急诱导憐蛋白l(STIPl)。研究人员发现，STIPl由卵巢癌 细胞表达分泌，通过自分泌或旁分泌方式，和卵巢癌细胞表面的ACVR1蛋白结合，激活SMD 信号通道，促进卵巢癌细胞的生长。
[002引综上，WACVR1蛋白为祀点，不仅可W探索治疗罕见的可怕疾病（如FOP和DIPG)， 还能研究和发现治疗频发率较高的肿瘤（如卵巢癌）。本领域需要开发出相关的药物和方 法W预防和/或治疗与ACVR1异常（例如ACVR1突变和/或过度活化）相关的各种疾病和 /或症状。
【发明内容】
[0023] 本发明正是提供了一种具有生物活性的融合蛋白ACVRl-Fc及其制备方法，W及 该融合蛋白在预防和/或治疗与ACVR1异常（例如ACVR1突变和/或过度活化）相关的疾 病或症状（例如F0P、DIPG、卵巢癌等）中的应用。
[0024] 在本发明的第一方面中，提供了一种融合蛋白，其特征在于，它包括W下元件：
[00巧](a)ACVR1元件，其具有ACVR1或其活性片段的氨基酸序列；
[0026] (b)Fc元件，其包含人IgGFc片段；
[0027] (C)任选的，信号肤元件；W及
[0028] (d)任选的，位于W上元件之间的连接肤序列。
[0029] 在一些实施方式中，所述的融合蛋白由元件（a)、化）和（C)构成。
[0030] 在一些实施方式中，所述ACVR1元件具有BMP-2结合活性。
[0031] 在一些实施方式中，所述ACVR1元件具有ACVR1的胞外区序列。
[0032] 在一些实施方式中，所述ACVR1元件选自：①具有SEQIDN0:4的序列；②与SEQ IDN0:4所示序列有一个或多个氨基酸缺失、替代或插入且具有与SEQIDN0:4所示的序 列相同生物活性的序列；③与SEQIDN0:4所示的序列有90%W上同源性且具有与SEQID N0:4所示的序列相同生物活性的序列。
[0033] 在一些实施方式中，所述Fc元件包含人IgG丫 1、IgG丫 2、IgG丫 3或IgG丫 4的Fc 片段。所述化元件包含较链区、C肥和C册区。
[0034] 在一些实施方式中，所述Fc元件选自：①具有SEQIDNO:6的序列；②与SEQID N0:6所示序列有一个或多个氨基酸缺失、替代或插入且具有与SEQIDN0:6所示的序列相 同生物活性的序列；③与SEQIDN0:6所示的序列有90%W上同源性且具有与SEQIDN0:6 所示的序列相同生物活性的序列。
[0035] 在一些实施方式中，所述信号肤元件选自：CD33蛋白信号肤（优选具有SEQID N0:2所示序列）、其它任何表明抗原蛋白信号肤，抗体蛋白信号肤或其它任何分泌蛋白分 子信号肤。
[0036] 在一些实施方式中，所述连接肤序列的长度通常为1~50个氨基酸，例如5~50、 5~40、10~40个氨基酸。
[0037] 在一些实施方式中，所述融合蛋白中元件从5'至3'端的排列顺序选自下组，其中 (d)、（dl)和（d2)代表相同或不同的连接肤序列：
[003引（a)-化）；化)-(a) ; (C) - (a)-化）；（C)-化)-(a) ; (a) - (d)-化）；化)-(d) - (a);
[003引（c) - (d) - (a) - (b) ; (c) - (a) - (d) - (b) ; (c) - (d) - (b) - (a) ; (c) - (b) - (d) - (a);
[0040] (c) - (dl) - (a)-他）-(b) ; (c) - (dl) - (b)-他）-(a)。
[0041] 在一些实施方式中，所述融合蛋白具有选自下组的一种或多种功能：结合天然 ACVR1结合的细胞因子、结合细胞因子与ACVR2的复合物、抑制Smad-1/5/8蛋白的憐酸化、 抑制p38MP激酶的憐酸化及其活化、抑制成骨分化、抑制软骨分化、降低细胞间质的巧离 子浓度。
[0042] 在本发明的一些实施方式中，所述融合蛋白中的元件独立地选自下组：
[004引所述的ACVR1元件具有沈QIDNO:4所示的序列；
[0044] 所述的Fc元件具有SEQIDNO:6所示的序列；
[0045] 所述的信号肤具有SEQIDNO:2所示的序列。
[0046] 在另一优选例中，所述的DNA分子具有SEQIDNO: 1中所示的核巧酸序列
[0047] 在本发明的一些实施方式中，所述的融合蛋白选自：
[0048] ①具有SEQIDNO:8的序列；
[0049] ②与SEQIDNO:8所示序列有一个或多个氨基酸缺失、替代或插入且具有与SEQ IDN0:8所示的序列相同生物活性的序列；
[0050] ③与