一种促进单核细胞增生李斯特氏菌生长的方法与流程

本发明涉及微生物检验技术领域，具体涉及一种利用酵母菌促进单核细胞增生李斯特氏菌生长的方法以及包含酵母菌的单核细胞增生李斯特氏菌的生长促进剂。

背景技术：

单核细胞增生李斯特氏菌(listeriamonocytogenes，简称单增李斯特菌)属于革兰氏阳性菌，是一种常见的食源性致病菌，世界贸易组织于20世纪90年代将其列为四大食源性致病菌之一。单增李斯特菌广泛存在于自然界中，人感染后可导致脑膜炎、肠胃炎、败血症、孕妇流产等，新生儿及免疫力低下者更易感染。该菌能耐受冷冻和干燥，在极端环境中亦能存活，对人体健康造成潜在的威胁。

目前检测单增李斯特菌的方法为gb4789.30-2016。根据gb4789.30-2016的要求，样品需经过lb1培养基增菌24±2h后方可进入后期的检测过程。按照目前国标的增菌方法，所需时间较长，影响了单增李斯特菌的检验效率，因此，亟需开发促进单增李斯特菌生长的方法，以期提高检测效率。

技术实现要素：

为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种高效促进单核细胞增生李斯特氏菌生长的方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供酵母菌在促进单核细胞增生李斯特氏菌生长中的应用。

第二方面，本发明提供酵母菌在单核细胞增生李斯特氏菌增菌培养或检测中的应用。

本发明发现，在单核细胞增生李斯特氏菌培养过程中接种酵母菌能够有效促进单核细胞增生李斯特氏菌的生长，缩短单核细胞增生李斯特氏菌增菌所需的时间。

作为优选，所述的酵母菌为酿酒酵母。

本发明发现，酵母菌中的酿酒酵母能够高效促进单核细胞增生李斯特氏菌的生长。

作为优选，所述应用为在单核细胞增生李斯特氏菌培养的初始阶段接种所述酵母菌。更优选为，将单核细胞增生李斯特氏菌与所述酵母菌同时接种。

作为优选，所述酵母菌的接种量为使得酵母菌与单核细胞增生李斯特氏菌的菌体数之比为1000:1～30000:1。更优选为3000:1～30000:1。

第三方面，本发明提供一种单核细胞增生李斯特氏菌的生长促进剂，所述生长促进剂包含酵母菌。

作为优选，所述酵母菌为酿酒酵母。

所述单核细胞增生李斯特氏菌的生长促进剂可为固体或液体。还可包含能够维持酵母菌活力、易于保存的助剂，如甘油等。

第四方面，本发明提供一种促进单核细胞增生李斯特氏菌生长的方法，其为在单核细胞增生李斯特氏菌培养的过程中接种酵母菌。

作为优选，所述酵母菌为酿酒酵母。

作为优选，在单核细胞增生李斯特氏菌培养的初始阶段接种所述酵母菌。更优选为，将单核细胞增生李斯特氏菌与所述酵母菌同时接种。

作为优选，所述酵母菌的接种量为使得酵母菌与单核细胞增生李斯特氏菌的菌体数之比为1000:1～30000:1。酵母菌和单核细胞增生李斯特氏菌以上述比例配合，能够使得酵母菌发挥更优的促进单核细胞增生李斯特氏菌生长的活性。

作为本发明的优选方案，所述酵母菌的接种量为使得酵母菌与单核细胞增生李斯特氏菌的菌体数之比为3000:1～30000:1。

上述接种酵母菌中，可采用接种酵母悬液的方法，作为本发明的一种实施方式，所述酵母混悬液的制备方法如下：将活化好的酵母菌用生理盐水冲下，洗涤菌体后用生理盐水悬浮酵母细胞，制成酵母悬液。

作为优选，所述单核细胞增生李斯特氏菌培养为在35～37℃，非静置培养条件下培养。

进一步优选地，当采用可密封的离心管培养时，所述单核细胞增生李斯特氏菌培养为在37℃、10r/min～60r/min条件下培养。

进一步优选地，当采用可密封的离心管培养时，所述单核细胞增生李斯特氏菌培养的培养基的装液量30％～50％。

本发明的有益效果在于：本发明发现酵母菌能够有效促进单增李斯特菌的生长，可作为单增李斯特菌的生长促进剂，缩短其增菌的培养时间，提高单增李斯特菌的培养和检测的工作效率。以酵母菌作为生长促进剂对于不同单增李斯特菌菌株具有普遍适用性，为实现单增李斯特菌的快速检测奠定了基础。

附图说明

图1为本发明实施例1中酵母菌对于单增李斯特菌生长的促进作用分析结果，其中，单增李斯特菌代表对照组，单增李斯特菌+促进剂代表实验组。

图2为本发明实施例2中溶氧对于酵母菌对单增李斯特菌生长的促进作用的影响的分析结果，其中，单增李斯特菌代表对照组，单增李斯特菌+促进剂代表实验组。

图3为本发明实施例3中转动培养对于酵母菌对单增李斯特菌生长的促进作用的影响的分析结果，其中，单增李斯特菌代表对照组，单增李斯特菌+促进剂代表实验组；柱图上的数字代表单增李斯特氏菌的菌落总数。

图4为本发明实施例4中酵母菌对单增李斯特菌1生长的促进作用的影响的分析结果，其中，单增李斯特菌代表对照组，单增李斯特菌+促进剂代表实验组。

图5为本发明实施例4中酵母菌对单增李斯特菌2生长的促进作用的影响的分析结果，其中，单增李斯特菌代表对照组，单增李斯特菌+促进剂代表实验组。

图6为本发明实施例4中酵母菌对单增李斯特菌3生长的促进作用的影响的分析结果，其中，单增李斯特菌代表对照组，单增李斯特菌+促进剂代表实验组。

图7为本发明实施例4中酵母菌对单增李斯特菌4生长的促进作用的影响的分析结果，其中，单增李斯特菌代表对照组，单增李斯特菌+促进剂代表实验组。

图8为本发明实施例4中酵母菌对单增李斯特菌5生长的促进作用的影响的分析结果，其中，单增李斯特菌代表对照组，单增李斯特菌+促进剂代表实验组。

图9为本发明实施例4中酵母菌对单增李斯特菌6生长的促进作用的影响的分析结果，其中，单增李斯特菌代表对照组，单增李斯特菌+促进剂代表实验组。

图10为本发明实施例5中酵母菌对不同接种量的单增李斯特菌生长的促进作用分析，其中，第一组单增李斯特菌的接种量为4×10¹¹，第二组单增李斯特菌的接种量为4×10¹⁰，第三组单增李斯特菌的接种量为4×10⁹，第四组单增李斯特菌的接种量为4×10⁸；单增李斯特菌代表对照组，单增李斯特菌+酵母菌代表实验组；纵坐标表示的是实验组(单增李斯特氏菌+酵母菌)和对照组(仅接种单增李斯特氏菌)的单增李斯特氏菌菌落总数的比值。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例所用的酵母菌种为酿酒酵母atcc9763。

单增李斯特菌的显色培养基产自法国科玛嘉，培养单增李斯特氏菌的lb1培养基等其它实验所需的培养基均购自于北京陆桥技术股份有限公司。

以下实施例中所用的仪器设备包括：1300系列a2型二级生物安全柜(thermoscientific)，试管旋转混匀器(thermoscientific)，bcd-228f型电冰箱(海尔)，恒温培养箱(松下)，冷冻干燥机(lgj-12d，思科普)。

以下实施例中所用到的菌种复苏、活化、培养和计数方法如下：

1、菌种的复苏与保存

将酵母菌从-80℃冰箱取出，37℃水浴融化后，在酵母培养基(酵母膏3.0g，麦芽浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，葡萄糖10.0g，琼脂20.0g，蒸馏水定容至1.0l)上划线，于37℃培养24小时后，转接至酵母培养基斜面，37℃培养24小时后，将培养好的斜面置于4℃冰箱保存备用。

将单增李斯特菌从-80℃冰箱取出，37℃水浴融化后，在脑心琼脂培养基(心提取物5.0g，脑提取物12.5g，月示胨10.0g，葡萄糖2.0g，nacl5.0g，na2hpo42.5g，琼脂15.0g，蒸馏水定容至1.0l，ph7.4)上划线后37℃培养，24小时后，转接至脑心琼脂培养基斜面，37℃培养24小时后，将培养好的斜面置于4℃冰箱保存备用。

2、菌种的活化：

分别将上述步骤1中制备的4℃冰箱保存的酵母和单增李斯特氏菌在酵母培养基斜面和脑心琼脂培养基斜面上划线，37℃培养24h后，按照合适的菌种密度接种。

3、菌种的培养

将活化好的酵母菌接种至100ml液体酵母培养基中，37℃,120rpm/min，培养24h后，计数，3000rpm/min离心10min，收集菌体。

4、单增李斯特菌的平板计数

将增菌液按照10倍梯度稀释，取合适稀释梯度的样本100μl均匀涂布在李斯特显色培养基平板上。37℃过夜培养后计数。菌落总数在30-300之间的平板为有效计数平板。每个稀释梯度做2个平行，取平均数。

5、酵母菌和单增李斯特氏菌悬液(接种液)的制备：

将斜面上活化好的酿酒酵母atcc9763和单增李斯特氏菌用2ml生理盐水冲下，7500×g离心2min，去上清，菌体再次用2ml生理盐水悬浮，7500×g离心2min，去上清。用生理盐水悬浮细胞，并将细胞悬浮液的麦氏浊度调整至1.0，制备成细菌悬液(酵母菌的菌浓为6×10¹²cfu/ml，单增李斯特氏菌的菌浓为4×10¹³cfu/ml)。

实施例1酵母菌对单增李斯特菌生长的促进作用

本实施例以酿酒酵母atcc9763为例，分析酵母菌对于单增李斯特氏菌的促生长作用，具体方法如下：

分装lb1培养基于50ml灭菌离心管中，每管20ml。为了验证酵母菌对单增李斯特菌生长的促进效果，以10倍梯度稀释单增李斯特菌atcc19115的菌悬液，取10^-4稀释梯度的单增李斯特菌稀释液(单增李斯特氏菌的菌浓为4×10⁹cfu/ml)用于接种，其中，对照组仅接种50μl单增李斯特氏菌的菌悬液稀释液，实验组接种50μl单增李斯特菌菌悬液稀释液的同时接种100μl的酵母菌悬液(酵母菌的菌浓为6×10¹²cfu/ml)。接种后，拧紧离心管盖，将离心管置于试管旋转架上，10r/min,37℃培养6h后对单增李斯特菌进行计数。

结果如图1所示，添加酵母菌后，单增李斯特菌的菌体数量增加了近一倍，酵母菌对单增李斯特菌的生长促进作用非常明显。

实施例2溶氧条件对酵母菌对单增李斯特菌生长促进作用的影响

本实施例分析氧气是否影响酵母菌对单增李斯特菌生长的促进作用，具体方法如下：

在50ml无菌离心管中分装45ml灭菌的lb1培养基备用，对照组仅接种50μl实施例1制备的10^-4稀释梯度的单增李斯特菌atcc19115的菌悬液稀释液(单增李斯特氏菌的菌浓为4×10⁹cfu/ml)，实验组接种50μl的上述单增李斯特菌atcc19115的菌悬液稀释液的同时接种100μl的酵母菌悬液(酵母菌菌浓为6×10¹²cfu/ml)。接种后，拧紧离心管盖，将离心管置于试管旋转架上，10r/min，37℃培养6h后计数。

结果如图2所示，当增加培养基的装液量后，培养体系中的溶氧量明显降低，酵母菌对单增李斯特菌的生长促进作用降低，经计数，单增李斯特菌的菌体数量由实施例1的增加近一倍降低为增加不足10％。上述结果表明，培养基的溶氧量大小影响酵母菌对单增李斯特菌生长的促进作用。

实施例3转动培养提高酵母菌对单增李斯特菌生长的促进作用

本实施例分析转动培养对于酵母菌促进单增李斯特氏菌生长作用的影响，具体方法如下：

在50ml无菌离心管中分装20ml灭菌的lb1培养基备用，对照组仅接种50μl实施例1制备的10^-4稀释梯度的单增李斯特菌atcc19115菌悬液稀释液(单增李斯特氏菌的菌浓为4×10⁹cfu/ml)，实验组接种50μl的上述单增李斯特菌菌悬液稀释液的同时接种100μl的酵母菌悬液(酵母菌菌浓为6×10¹²cfu/ml)。分别在37℃下按照静置培养、10r/min、20r/min、40r/min、60r/min五种培养条件分析不同培养条件下酵母菌对单增李斯特菌生长的促进作用。

结果如图3所示，静置培养时，酵母菌对单增李斯特菌的促进作用受到抑制，10r/min时，酵母菌对单增李斯特菌的生长具有明显的促进作用，再增加转速，不能明显提升酵母菌对单增李斯特菌生长的促进作用。

实施例4酵母菌对多种单增李斯特菌生长的促进作用

为分析酵母菌作为单增李斯特菌生长促进剂的适用范围，本实施例对酵母菌对其它多株单增李斯特菌生长的促进作用进行分析，具体方法如下：

以从食品中分离获得的6株不同的单增李斯特菌作为实验对象，利用实施例1的方法分析酵母菌对这6株单增李斯特菌的生长的促进效果。酵母菌对6株单增李斯特菌(单增李斯特菌1、单增李斯特菌2、单增李斯特菌3、单增李斯特菌4、单增李斯特菌5、单增李斯特菌6)的促生长作用的分析结果分别如图4、图5、图6、图7、图8和图9所示，在适宜的培养条件下，酵母菌对于测试的6株单增李斯特菌的生长均具有较强的促进作用，表明酵母菌对于单增李斯特氏菌生长的促进作用对于不同单增李斯特菌菌株具有普遍适用性。

实施例5不同酵母菌的加入量对单增李斯特菌生长的促进作用

分装lb1培养基于50ml灭菌离心管中，每管20ml。以10倍梯度稀释单增李斯特菌atcc19115菌悬液，分别取10^-2(第一组)，10^-3(第二组)，10^-4(第三组)以及10^-5(第四组)稀释梯度的单增李斯特菌稀释液用于接种(单增李斯特菌稀释液中所含的菌浓分别为4×10¹¹cfu/ml，4×10¹⁰cfu/ml，4×10⁹cfu/ml以及4×10⁸cfu/ml)，其中，对照组仅接种50μl上述单增李斯特氏菌悬液稀释液，实验组接种50μl上述单增李斯特菌悬液稀释液的同时接种100μl的酵母菌悬液(酵母菌的菌浓为6×10¹²cfu/ml)。接种后，拧紧离心管盖，将离心管置于试管旋转架上，10r/min,37℃培养6h后对单增李斯特菌进行计数。

结果如图10所示，酵母菌和单增李斯特氏菌的菌体数的比值影响酵母菌的促生长作用：酵母菌对于单增李斯特氏菌组菌浓为4×10¹¹cfu/ml(酵母菌与单增李斯特氏菌接种的菌体数之比为30:1)和4×10¹⁰cfu/ml(酵母菌与单增李斯特氏菌接种的菌体数之比为300:1)的实验组没有明显的促进作用；而对于单增李斯特氏菌组计数为4×10⁹cfu/ml(酵母菌与单增李斯特氏菌接种的菌体数之比为3000:1)和4×10⁸cfu/ml(酵母菌与单增李斯特氏菌接种的菌体数之比为30000:1)的实验组有明显的促进作用，但是这两个实验组之间的促进水平未见明显差异。

综述所述，本发明发现了酵母菌可以促进单增李斯特氏菌的生长并且这种促进作用对于不同单增李斯特菌菌株具有普遍适用性。酵母菌有效促进了单增李斯特菌的生长速度，有效缩短了前增菌的时间，为实现食源性致病单增李斯特菌的快速检测奠定基础。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。