玉米赤霉烯酮水解酶ZH607及其编码基因和应用的制作方法

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及玉米赤霉烯酮水解酶zh607及其编码基因和应用。

背景技术：

玉米赤霉烯酮(zearalenone，zen)，又称f-2毒素，其化学名为6-(10-羟基-6-氧基-十一碳烯基)β-雷锁酸内酯，是镰刀菌产生的次级代谢产物，同时也是世界上污染范围最广的一种镰刀菌毒素。zen分子式为c18h23o，平均分子量为318da，白色晶体，沸点为510.12℃，熔点为217.32℃，对热较稳定，120℃加热4h不被降解。zen不溶于水，可溶于碱性水溶液、乙醚、苯、氯仿等物质，微溶于石油醚。

常见的zen降解方法主要有化学法、物理法和生物法。化学法主要用酸碱处理和氧化剂处理等。物理方法包括吸附剂吸附、加热加压、微波处理等。这些方法主要是通过破坏zen苯环结构、修饰基团或吸附作用吸附毒素，以减少或去除毒素，但这些方法不仅成本高，效率低，还会造成营养物质流失，甚至造成二次污染。生物法主要包括微生物吸附法和微生物降解法。微生物降解是通过微生物代谢所产生的某种一种或多种酶协作酶对毒素进行降解，条件温和，特异性强，不破坏原有营养成分且效率高，是一种环保高效实用性强的处理方法。因此，该方法在动物霉变饲料和饲料原料中的应用具有广阔的发展前景。

目前，有多种酶被报道具有玉米赤霉烯酮水解活性。2017年，来源于cladophialophorabantiana的玉米赤霉烯酮水解酶cbzhd对于zen的活性仅为0.688u/mg。随后，来源于rhinocladiellamackenziei的基因zhd518，所编码的蛋白zhd518对于zen和它的衍生物(α-zearalenol,β-zearalenol,α-zearalanolandβ-zearalanol)均具有水解活性，比活力分别为207.0u/mg,23.0u/mg,64.7u/mg,119.8u/mg和66.5u/mg，水解效果较差。虽然越来越多的酶被发现具有zen水解活性，但水解效果均不理想，活性低已成为限制玉米赤霉烯酮水解酶工业大规模应用的主要原因。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种玉米赤霉烯酮水解酶zh607。

本发明的再一目的在于提供编码上述玉米赤霉烯酮水解酶zh607的基因zh607。

本发明的再一目的在于提供包含上述基因的重组载体。

本发明的再一目的在于提供包含上述基因的重组菌株。

本发明的再一目的在于提供一种制备上述玉米赤霉烯酮水解酶zh607的方法。

本发明的再一目的在于提供上述玉米赤霉烯酮水解酶zh607应用。

本发明提供了一种玉米赤霉烯酮水解酶zh607，其氨基酸序列如下：

seqidno.1：

msttratktvttkdgikwhveqegngpdivlvpdglgecqmfdkpmsiiaasgfrvttfdmpgmsrsrdappetyrdvtghklagyvdtlleelkipiasvwgcssgattvlalcaafpervrnamphelptvnpasvtgmeekdpavisqemaavsrsisggteawdalgpevharlhdnyvrwargypvtippsaptksevlhkrpvdwtvgggtptamffdniviavkeglnigllpgghfpyvshpeafaeyvvetcrkyi

本发明还提供上述玉米赤霉烯酮zh607的编码基因zh607，其核苷酸序列如seqidno.2所示：

atgtccaccaccagagccaccaagactgttaccaccaaggatggaattaagtggcatgttgagcaagaaggaaacggtccagacattgtgttggttccagatggtttgggtgagtgtcaaatgtttgataagcccatgtccattattgcagcctccggttttagagtcactacctttgatatgccaggtatgagtagatccagagatgctcctccagaaacttacagagatgttaccggtcataagctggctggttacgttgacactttgcttgaggaattgaagattccaattgcttctgtttggggttgttcctctggtgctactactgttctggccttgtgtgctgcttttccagaaagagttagaaatgccatgccacacgagttgccaactgttaacccagcttctgttactggtatggaggagaaggaccctgctgttatttctcaagaaatggctgctgtttcaagatcaattagtggtggtactgaagcctgggatgctttaggaccagaagttcatgctagacttcatgataattacgttagatgggctagaggttacccagtgactattccaccatctgccccaaccaagtctgaggttttgcataagagaccagttgattggacagttggtggtggtaccccaactgctatgttttttgataatattgtcatcgctgtcaaggaaggtttgaacattggtttgttgccaggtggtcatttcccatacgtttctcatcctgaagcttttgctgaatacgttgttgagacttgtagaaagtacatttaa

本发明还提供了玉米赤霉烯酮水解酶zh607基因的重组表达载体，优选为重组质粒ppicz(α)a-zh607。

本发明还提供了玉米赤霉烯酮水解酶zh607基因的重组菌株，优选为毕赤酵母。

根据本发明具体实施方式的制备玉米赤霉烯酮水解酶zh607的方法包括以下步骤：

(1)用包含玉米赤霉烯酮水解酶zh607基因的重组表达载体转化宿主细胞，得到重组菌株；

(2)培养重组菌株，诱导表达玉米赤霉烯酮水解酶zh607。

本发明还提供上述玉米赤霉烯酮水解酶zh607的应用，包括在生物质能源、食品工业和饲料工业等方面的应用。

本发明的有益效果：

本发明合成了一种新的玉米赤霉烯酮水解酶zh607，并构建了能够高效表达此酶的重组毕赤酵母菌株。

本发明提供了一种玉米赤霉烯酮水解酶zh607，利用毕赤酵母高效表达了上述玉米赤霉烯酮水解酶，其理论分子量为28.7kda，经hplc分析可有效降解赤霉烯酮。

附图说明

图1显示赤霉烯酮水解酶的sds-page分析结果；

图2显示赤霉烯酮水解酶降解玉米赤霉烯酮底物的hplc分析结果，其中，(1)为加入活性酶液的样品hplc图；(2)为加入ddh2o的对照品hplc图；(3)为标准的hplc图；

图3显示赤霉烯酮水解酶zh607的酶学性质，其中，(a)显示zh607的最适ph，(b)显示zh607的最适温度；(c)显示zh607的ph稳定性；(d)显示zh607的温度稳定性。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：载体ppicz(α)a；

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自takara公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)；

3、毕赤酵母培养基ypd(yeastextract1％，trytone2％，glucose2％，ph自然)；bmgy(yeastextract1％,trytone2％，ynb10％,生物素0.1％，ph自然)；bmmy(yeastextract1％,trytone2％,甲醇0.5％,ynb10％,生物素0.1％，ph自然)。

实施例1重组赤霉烯酮水解酶zh607表达载体及表达菌株的构建

经密码子优化后，得到赤霉烯酮水解酶zh607的编码基因zh607，并进行合成，重组在ppicz(α)a载体ecorⅰ和notⅰ位点之间。通过质粒提取试剂盒(tiangen)得到重组质粒ppicz(α)a-zh607。

将重组质粒ppicz(α)a-zh607转化毕赤酵母感受态x33，获得重组菌株x33/ppicz(α)a-zh607。

将重组质粒ppicz(α)a-zh607转化毕赤酵母感受态x33进行诱导表达。分别挑取48个阳性转化子接种至3mlbmgy液体培养基中，30℃、200rpm培养48h；将此培养液4500rpm离心5min，弃上清，用1.5mlbmmy液体培养基重悬，30℃、200rpm诱导48h，筛选得到酶活最高的转化子。

将筛选得到的菌株接种至40mlbmgy液体培养基中，30℃、200rpm培养48h；将此培养液4500rpm离心5min，弃上清，用15mlbmmy液体培养基重悬，30℃、200rpm诱导48h.将菌液12000rpm离心5min，上清作为粗酶液进行酶活测定，如图1所示，为赤霉烯酮水解酶的sds-page分析结果。sds-page分析显示玉米赤霉烯酮水解酶zh607迁移条带在25kda-35kda之间，与zh607的理论相对分子质量28.7kda相符。

实施例2重组玉米赤霉烯酮水解酶的活性分析

诱导表达后对玉米赤霉烯酮水解酶zh607粗酶液进行降解活性的测定。

酶活的测定方法(zen由dmso溶)：

37℃反应0.5h，加入800μldmso终止反应。

终止反应后通过hplc检测对照组及实验组zen剩余峰面积。

酶活力单位(u)：在37℃，反应0.5h条件下，在1h内能转化1μgzen的酶量。

酶活计算(每毫升酶液所含酶活力单位)：反应体系中zen初始含量*(对照组峰面积-实验组峰面积)/对照组峰面积*2*稀释倍数*10。

玉米赤霉烯酮水解酶zh607活性检测结果如图2所示，相较于对照组，实验组的zen的峰值(28.2)明显降低，且在约23min位置有产物峰生成，表明玉米赤霉烯酮水解酶zh607对zen有明显的降解效果。

实施例3重组玉米赤霉烯酮水解酶的基本特性

诱导表达后对zh607粗酶液进行纯化并测定基本性质。

在ph5-11，37℃的条件下测定zh607的最适ph，反应时间为30min，使用的缓冲液为：130mm的na2hpo4-柠檬酸缓冲液(ph5.0-7.0)、130mm的tris-hcl(ph8.0)和130mm的甘氨酸-naoh(ph9.0-11.0)。为测定zh607的ph稳定性，将纯化后的酶液在37℃条件下，5.5-8.0的ph范围内孵育1h,在标准条件下(ph8.0，37℃，反应30min)测定其剩余活性。反应测定具体方法如实施例2所示。

如图3中a、c所示，玉米赤霉烯酮水解酶zh607的最适ph为8.0，为中碱性酶。在ph6,7,8，37℃的条件下孵育1h，剩余活性在36％以上，其中ph7.0条件下剩余活性最高，剩余酶活约60％。在ph5.5的条件下孵育1h后，仅剩于初始活性的6％。

在25℃-55℃的温度范围，ph8.0的条件下反应30min测定温度对纯化zh607活性的影响。为测定zh607的温度稳定性，将纯化后的酶液在ph8.0，30、35和40℃的温度的条件下分别孵育10，30，60min,在标准条件下(ph8.0，37℃，反应30min)测定其剩余活性。

如图3中b、d所示，玉米赤霉烯酮水解酶zh607的最适温度为35℃，纯化后的酶液在ph8.0，30、35和40℃的温度的条件下孵育10min后，剩余活性为初始活性的50％以上。在30℃处理60min仍剩余70％的活性。

序列表

<110>中国农业科学院饲料研究所

<120>玉米赤霉烯酮水解酶zh607及其编码基因和应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>265

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

metserthrthrargalathrlysthrvalthrthrlysaspglyile

151015

lystrphisvalgluglngluglyasnglyproaspilevalleuval

202530

proaspglyleuglyglucysglnmetpheasplysprometserile

354045

ilealaalaserglypheargvalthrthrpheaspmetproglymet

505560

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65707580

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859095

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100105110

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115120125

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145150155160

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valasptrpthrvalglyglyglythrprothralametphepheasp

210215220

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245250255

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260265

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

atgtccaccaccagagccaccaagactgttaccaccaaggatggaattaagtggcatgtt60

gagcaagaaggaaacggtccagacattgtgttggttccagatggtttgggtgagtgtcaa120

atgtttgataagcccatgtccattattgcagcctccggttttagagtcactacctttgat180

atgccaggtatgagtagatccagagatgctcctccagaaacttacagagatgttaccggt240

cataagctggctggttacgttgacactttgcttgaggaattgaagattccaattgcttct300

gtttggggttgttcctctggtgctactactgttctggccttgtgtgctgcttttccagaa360

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agtggtggtactgaagcctgggatgctttaggaccagaagttcatgctagacttcatgat540

aattacgttagatgggctagaggttacccagtgactattccaccatctgccccaaccaag600

tctgaggttttgcataagagaccagttgattggacagttggtggtggtaccccaactgct660

atgttttttgataatattgtcatcgctgtcaaggaaggtttgaacattggtttgttgcca720

ggtggtcatttcccatacgtttctcatcctgaagcttttgctgaatacgttgttgagact780

tgtagaaagtacatttaa798