一种调控sgRNA转录的启动子、表达载体，及其基因组编辑系统和应用的制作方法

本发明涉及生物技术和基因工程领域。具体而言，本发明涉及具有调控sgrna编码dna转录的启动子功能的dna片段、及含有该dna片段的sgrna表达载体，其组成的基于crispr/cas9的基因组编辑系统及其应用。
背景技术：
：crispr（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats）是在进化进程中形成的一种获得性自我免疫防御系统，由高度保守的重复序列和完全不同的间隔序列交替排列组成，广泛存在于细菌和古细菌中，主要依赖本身基因组整合的外来片段对抗该外源dna的再次入侵。2013年张峰等首次将crispr/cas9技术应用于哺乳动物细胞的基因编辑（lecongetal.multiplexgenomeengineeringusingcrispr/cassyetems.science,2013,339(6121):819–823），自此crispr/cas9开始被作为一种基因编辑技术而被广泛使用，该技术与前期基因编辑所用的核酸内切酶，如锌指核酸酶和类转录激活因子效应物核酸酶等相比具有技术操作简单、特异性强等特点。crispr系统只需要核酸酶cas9蛋白、成熟的crrna(crisprassociaterna)、tracrrna(trans-activatingcrrna)及rnaseiii4种组分，即可对具有特异序列的外源dna进行识别以及剪切。jinek等将crrna和tracrrna连接成一条单链引导rna（single-guiderna，sgrna），在sgrna的引导下可高效介导cas9蛋白对靶标序列进行定点切割（jinekm,etal.aprogrammabledual-rna-guideddnaendonucleaseinadaptivebacterialimmunity[j].science,2012,337(6096)：816-821）。当构建的外源crispr/cas9系统被导入受体细胞后，由sgrna识别靶标位点，cas9负责对dna双链进行切割，dna损伤会触发细胞自身的dna修复机制，同源修复（homology-directedrepair，hdr）以外源供体dna（donordna）为模板，修复后会导致目标基因的失活或外源片段的插入，而非同源末端连接（non-homologousendjoining，nhej），无需修复模板，在双链断裂（double-strandebreak，dsb）位置随机插入或删除部分碱基对，导致目标基因移码突变或关键区域被破坏。目前crispr/cas9系统已广泛用于人体细胞、鼠类、斑马鱼、植物、细菌、真菌等生物中的靶向基因的编辑。crispr/cas9系统的两个必备元件为cas9蛋白和sgrna，其中sgrna的转录水平对cas9的定位与切割效率都有决定作用，如何提高sgrna的转录水平是丝状真菌crispr技术开发应用的关键。例如在曲霉中的crispr-cas9系统已经被成功运用，但需要采用“hammerhead”的技术来启动sgrna的正确转录，而“hammerhead”技术构建成本高，技术难度大。由于rna聚合酶iii型启动子调控sgrna编码dna转录具有操作简单，转录丰度高等优势。因此，该启动子的挖掘和鉴定是实现丝状真菌crispr/cas9系统高效编辑基因组的关键因素。有功能活性的rna需要特殊的真核iii型启动子来启动其转录，而可以用来启动sgrna的编码dna转录的这类启动子非常缺乏。而中国专利201611083079.4针对此截取黑曲霉2个u6编码区附近501bp的序列作为u6启动子，以期用于黑曲霉来源的sgrna启动子用来正确指导sgrna在体内的合成，但实际效果却有待验证。而曲霉尤其是黑曲霉，被广泛的应用在蛋白、化学品的工业化生产过程中，在其快速生长期时，可以分泌大量有机酸，使得发酵培养基的ph低于2，这种发酵特性，可以大大降低发酵过程中染菌的风险，还可以省去生产有机酸过程中所使用的大量碳酸盐，对环境友好（中国专利文献cn09797111a）。在实际中有必要进一步提高曲霉尤其是黑曲霉的产酸性能，尤其是用于苹果酸的生产。基于上述，仍然非常需要研发更高效率的全新rna聚合酶iii型启动子，将进一步促进crispr/cas9系统在丝状真菌基因组编辑中应用，比如有效提高黑曲霉的产酸（如苹果酸）的能力。技术实现要素：本发明提供了具有调控sgrna编码dna转录的启动子功能的dna片段、及含有该dna片段的sgrna表达载体，其组成的基于crispr/cas9的基因组编辑系统及其应用。经验证，本发明编辑系统能够显著提高黑曲霉基因组的编辑效率，进而获得遗传性状稳定的基因编辑突变株，显著提高菌株有机酸产量。为达此目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明人经过广泛而深入的研究，在黑曲霉中发现rna聚合酶iii型启动子(命名为anp)，在后续研究发现该启动子具有转录sgrna的功能，因而本发明提供一种具有调控sgrna编码dna转录的启动子功能的dna片段，其特征在于，含有如seqidno.1所示序列。该dna片段可以作为普通启动子使用，但尤其可用于调控sgrna编码dna转录的表达载体，以进一步促进crispr/cas9系统在丝状真菌基因组编辑中应用。进一步地，所述的启动子功能的dna片段还包括对seqidno.1所示的核苷酸序列进行一个或多个，优选为1至10个中的任何个数的核苷酸取代、缺失或添加所获得的，具有与seqidno.1所示的核苷酸序列相同的具有sgrna编码dna的启动子功能的核苷酸序列或其互补序列或者所述的启动子功能的dna片段还包括核苷酸序列与seqidno.1所示序列的同源性≥95%(较佳地≥98%)的具有作为sgrna编码dna的启动子功能的多核苷酸，或5’端截短或添加1-50个(较佳地1-30，更佳地1-10个)的具有作为sgrna编码dna的启动子功能的核苷酸。第二方面，本发明还提供一种调控sgrna编码dna转录的表达载体，其包括上述的启动子功能的dna片段。进一步地，其包括上述的启动子功能的dna片段调控的sgrna编码dna转录的表达框。在一个实施方式中，采用融合pcr的方法将序列anp启动子、靶标位点（protospacer）及sgrna骨架连接在一起，采用基因重叠延伸（soe）方法构建sgrna表达框。在一优选方式中，所述sgrna编码dna转录的表达框包括对基因pyrg，moc，和laea的靶标位点中的任意一种或至少两种的组合。在另一优选例中，所述对基因pyrg，moc，和laea的靶向位点的sgrna编码dna转录的表达框的序列分别如seqidno.2（anp-pyrg-sgrna的核苷酸序列）所示、seqidno.3(anp-moc-sgrna的核苷酸序列)所示和seqidno.4(anp-laea-sgrna的核苷酸序列)所示。本发明中，更具体地，所述的基因pyrg为乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶基因（aspni_1103580），所述的基因moc为苹果酸-α酮戊二酸转运蛋白编码基因（aspni_1113466），所述的基因laea为甲基转移酶编码基因（aspni_170198）。第三方面，本发明还提供上述的具有启动子功能的dna片段，或者上述的调控sgrna编码dna转录的表达载体在crispr/cas系统中的应用，更优选在crispr/cas9系统中的应用。更进一步地，本发明提供一种真核基因组编辑系统，其特征在于，所述系统包括cas9蛋白的表达载体和上述的调控sgrna编码dna转录的表达载体，优选地，还包括同源供体dna序列。在一个实施方式中，所述的蛋白的表达载体包括cas9蛋白的表达框，其包括ptef1启动子、pgpda启动子或pgal启动子中的一种启动子，以及启动子调控的cas9的编码序列和ttrpc终止子。其中，更优选的是采用ptef1启动子。在一个优选实施方式中，所述同源供体dna序列选自针对黑曲霉基因pyrg，moc，和laea设计的同源供体dna序列中的任一种，或两种的组合，或三种的组合。更具体的实施方式中，所述的ptef1启动子为黑曲霉翻译延伸因子tef1的启动子，如seqidno.5所示的核苷酸序列；所述的pgpda启动子为黑曲霉磷酸甘油醛脱氢酶gpda的启动子，如seqidno.6所示的核苷酸序列；所述的pgal启动子为黑曲霉糖苷水解酶gala的启动子，如seqidno.7所示的核苷酸序列。在一优选实施方式中，所述的cas9蛋白的编码序列，还包含纯化标签和核定位蛋白编码序列，具体如seqidno.8所示的核苷酸序列。其中，所述的cas9蛋白的氨基酸残基序列（包含纯化标签短肽和核定位多肽）如seqidno.9所示。在另一优选方式中，所述的终止子ttrpc的核苷酸序列如seqidno.10所示。根据本发明优选实施方式，所述的同源供体dna序列选自针对黑曲霉基因pyrg，moc，和laea设计的同源供体dna序列中的任一种，或两种的组合，或三种的组合。在更具体的实施方式中，针对黑曲霉基因pyrg，moc，和laea设计的同源供体dna序列分别如seqidno.11（donor-pyrg的核苷酸序列）、seqidno.12（donor-moc的核苷酸序列）和seqidno.13（donor-laea的核苷酸序列）所示。在一个具体实施方式，本发明所述的同源供体dna序列是由基因pyrg、moc、或laea上/下游两条同源片段与抗性基因通过gibsonassembly的方法连接而成，通过将所述同源供体dna序列一起导入丝状真菌细胞，可实现高效率同源重组，若不导入同源供体dna序列也能通过非同源端连接（nhej）实现所述基因位点的编辑。在一个具体实施例中，将cas9蛋白的表达框和调控anp-pyrg-sgrna编码dna转录的表达框共转化进入黑曲霉atcc1015菌株的原生质体细胞后，通过非同源端连接（nhej）对pyrg位点特异性dsb的不精确修复，进而得到pyrg突变株。而将cas9蛋白的表达框和anp-pyrg-sgrna编码dna转录的表达框及donor-pyrg共转化进入黑曲霉atcc1015菌株的原生质体细胞后，通过同源重组获得基因编辑突变株，其同源重组效率高达97.2%。本发明中，在一个具体实施例中，将cas9蛋白的表达框，anp-moc-sgrna或/和anp-laea-sgrna以及供体dnadonor-moc或/和donor-laea共转化进入黑曲霉菌株的原生质体细胞后，通过同源重组均能获得基因编辑突变株。第四方面，本发明提供一种重组宿主细胞，包含有上述启动子功能的dna片段，或如上述的调控sgrna编码dna转录的表达载体。在另一优选方式中，所述宿主细胞为真菌细胞，优选为丝状真菌细胞，进一步优选为曲霉。更具体的实施方式中，所述宿主细胞选自但不限于毁丝霉属、梭孢壳霉属、木霉、脉孢菌、青霉、镰刀霉、曲霉属或根霉属中的任意一种，优选为黑曲霉。第五方面，本发明提供一种基因组编辑的方法，采用上述的真核基因组编辑系统对目标丝状真菌基因组进行基因编辑。具体包括将本发明的基因组编辑的系统导入到上述列举的宿主细胞中，在所述宿主细胞中的待编辑的基因组位点进行基因组编辑，利用筛选标记挑选转化子并获得具有稳定遗传性状的基因编辑突变株。而将基因编辑系统的载体和同源供体dna序列共转化进入宿主细胞中的方法没有限定，本领域技术人员可以根据实际需要采用本领域公知的技术进行。通常使用原生质体共转化的方法将所述的基因组编辑的系统导入到相应宿主细胞中。在一个具体实施方式中，将所述的调控sgrna编码dna转录的表达载体、cas9蛋白的表达载体、以及同源供体dna序列共转化进入丝状真菌的原生质体细胞。第六方面，本发明提供一种产苹果酸能力增强的黑曲霉重组菌，其是通过本发明的基因编辑方法对黑曲霉基因moc进行基因编辑获得基因moc突变的黑曲霉重组菌，或者进一步还对黑曲霉基因laea进行基因编辑，获得基因moc和laea双突变的黑曲霉重组菌。这是基于利用本发明基因编辑系统对黑曲霉合成苹果酸过程中有负调控作用的基因（moc和laea）进行编辑，获得了单/双基因缺失的突变体工程菌株，突变体工程菌株的苹果酸合成能力得到了显著提高，从而提高黑曲霉苹果酸合成能力。为了更显著提高黑曲霉苹果酸合成能力，还可以通过基因重组方法过表达黑曲霉基因mae。进一步地，本发明还提供一种提高黑曲霉生产苹果酸的方法，其利用上述构建的黑曲霉重组菌来生产获得苹果酸。具体而言，所述方法包括以下步骤：（a）培养上述的黑曲霉重组菌；（b）收集苹果酸。在更具体的实施方式中，本发明的产苹果酸的黑曲霉重组菌构建的方法，是将cas9蛋白的表达载体、含有上述具有启动子功能的dna片段调控的含有黑曲霉基因moc靶向位点的sgrna编码dna，以及针对黑曲霉基因moc设计的同源供体dna序列导入黑曲霉中，获得基因moc突变的黑曲霉突变株。即将cas9蛋白的表达框和anp-moc-sgrna编码dna转录的表达框及donor-moc共转化进入黑曲霉菌株的原生质体细胞后，通过同源重组获得基因编辑单基因突变株，其苹果酸产量得到显著提高。进一步的实施方式中，同时还导入含有上述的具有启动子功能的dna片段调控的含有黑曲霉基因laea靶向位点的sgrna编码dna，以及针对黑曲霉基因laea设计的同源供体dna序列，获得基因moc和laea双突变的黑曲霉突变株。即将cas9蛋白的表达框和anp-moc-sgrna和anp-laea-sgrna编码dna转录的表达框及donor-moc和donor-laea共转化进入黑曲霉菌株的原生质体细胞后，通过同源重组获得基因编辑双基因突变株，其苹果酸产量得到显著提高。本发明人经过广泛而深入的研究，在黑曲霉中发现了一个rna聚合酶iii型启动子，并在后续研究中成功验证该启动子具有转录sgrna编码dna的功能。基于此，设计和开发了特异性识别和切割黑曲霉基因组指定位点序列的crispr/cas9基因编辑系统，该系统能够显著提高黑曲霉（aspergillusniger）基因组编辑效率，单基因突变效率由8%提高至97.2%。利用本发明中的基因编辑系统对黑曲霉合成苹果酸过程中有负调控作用的基因（moc和laea）进行编辑，获得了单/双基因缺失的突变体工程菌株，突变体工程菌株的苹果酸合成能力得到了显著提高，从而不仅验证了本发明的rna聚合酶iii型启动子的上述功能，同时更是提供了一种能有效提高黑曲霉苹果酸合成能力的菌种改造方法。在本发明中，对下述术语的含义作一说明。启动子：是指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。基因组编辑：是指对生物的基因组dna进行删除、插入或者替换，从而达到对目的序列修改的目的。靶标位点：或者“protospacer”是限定核酸的一部分的核酸序列，是指sgrna5′端的20碱基的序列，这段序列与目的dna序列相同，在存在足以结合的条件下，sgrna需要这段序列与目的dna结合，cas9与sgrna的复合体对目的dna进行剪切。非同源端连接（nhej）：是指细胞内普遍存在的dna双链断裂（dsb）后的一种修复方式，nhej可在整个细胞周期发生，因为修复不需要模板，只基于断裂末端的结构而容易产生错误，包括缺失、插入和点突变。同源重组：“重组”是指两个多核苷酸之间交换遗传信息的过程。就本发明而言，“同源重组（hr）”是指在通过同源定向修复机制修复细胞内双链断裂期间所发生的此类交换的特殊形式。这一过程需要核苷酸序列同源，使用“供体”分子为模板来修复“靶标位点”分子（即发生双链断裂的分子），因为其导致遗传信息从供体转移到靶上。供体dna序列：“序列”是指任意合适长度的核苷酸序列，其可以是dna或rna，可以是线状、环状或分支状，而且可以是单链或者双链。术语“供体dna序列”是指被插入基因组中的核苷酸序列。供体序列可以为任意长度，例如，优选长度在约500个与3000个核苷酸之间（或它们之间的任意整数值）。附图说明图1为cas9表达载体（上）和sgrna表达载体（下）示意图。图2为cas9蛋白在不同启动子调控下对靶基因pyrg编辑的效率。图3为无供体dna条件下靶基因pyrg的编缉后的测序结果。图4为添加同源供体dna条件下靶基因pyrg突变菌株的pcr鉴定核酸电泳图。图5为突变体anm1δmoc以及anm1δmocδlaea苹果酸产量图。具体实施方式为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，应理解，本发明并不局限于实施例的详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。对本发明产品或方法的等效替换或具体方式的选择等，均落在本发明的范围之内。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，例如sambrook等人所著的《分子克隆：实验室手册》(newyork:coldspringharborlaboratorypress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。其中，实施例中所用引物和核酸测序均由金唯智生物科技有限公司合成；实施例中所出现的百分比浓度如无特别说明均为质量百分比浓度。实施例1：anp启动子的克隆在自然进化中，不同的物种之间u6smallnuclearrna的启动子序列差异性较大，但u6smallnuclearrna本身的核酸序列存在一定的保守性，因此以嗜热毁丝霉u6smallnuclearrna序列为参照，在黑曲霉atcc1015的基因组中进行核酸序列分析比对，其中identities大于90%，e-value小于1e-10，经过比对发现了2个rnapolymeraseiii型核小rna（snrna）候选基因。u6smallnuclearrna启动子的特点为起始转录位点为“g”，该核苷酸与上游第二“g”之间间隔一定数量的核苷酸（>30bp）。经本发明分析和研究，发现了其中一条rnapolymeraseiii型核snrna的上游启动子序列满足其特点，作为进一步研究的候选启动子。为了研究该候选启动子是否能调控sgrna编码dna的转录，进而应用于基因组编辑，利用引物（如表1所示）从黑曲霉atcc1015基因组中扩增出该rnapolymeraseiii型snrna候选基因上游523bp的dna片段（如seqidno.1所示），作为sgrna表达框的候选启动子（命名为anp）。其中，pcr反应体系为：5×phusionhfbuffer10μl，10mmdntps1μl，上游/下游引物各2.5μl，模板dna1μl，phusiondnapolymerase0.5μl，ddh2o32.5μl。pcr反应条件为：先98℃30s；然后98℃10s，65℃30s，72℃0.5min，34个循环；最后72℃10min，4℃10min。而后于金唯智测序公司进行测序，并与原始序列比对，确保克隆序列正确后用于后续的研究。实施例2：构建crispr/cas9介导的黑曲霉基因组编辑载体(1)cas9蛋白表达载体构建将来自酿脓链球菌的cas9蛋白编码基因进行密码子优化并人工合成，在其n-端添加3个纯化标签以及嗜热毁丝霉转录因子haci的核定位信号序列（pprkraktede），在c-端添加2个并排的sv40核定位信号序列（dpkkkrkvdpkkkrkv）和1个上述haci的核定位信号序列（pprkraktede）。cas9蛋白的编码核苷酸序列如seqidno.8所示，cas9蛋白的氨基酸序列如seqidno.9所示。从黑曲霉atcc1015基因组分别扩增翻译延伸因子tef1的启动子（如seqidno.5所示），磷酸甘油醛脱氢酶gpda的启动子（如seqidno.6所示），糖苷水解酶gala的启动子（如seqidno.7所示），分别作为cas9蛋白编码基因的转录启动子，以构巢曲霉ttrpc为终止子。载体构建所需的pcr引物序列如表1所示，pcr反应体系为：5×phusionhfbuffer10μl，10mmdntps1μl，上游/下游引物各2.5μl，模板dna1μl，phusiondnapolymerase0.5μl，ddh2o32.5μl。pcr反应条件为：先98℃30s；然后98℃10s，65℃30s，72℃2.5min，34个循环；最后72℃10min，4℃10min。而后，将上述pcr片段用gibsonassembly技术体系连接至已线性化的p0380-bar上spei和ecori之间，从而构建了在不同启动子调控下的3个cas9表达框质粒p0380-ptef1-cas9，p0380-pgpda-cas9和p0380-pglaa-cas9（如图1所示）。（2）sgrna表达框载体的构建通过软件sgrnacas9tool设计目标基因的靶标位点。采用融合pcr方法将实施例1获得的序列anp启动子、靶标位点及sgrna骨架连接在一起，采用基因重叠延伸（soe）方法构建sgrna表达框载体。sgrna表达框载体所需引物序列如表1中所示。pcr反应体系为：5×phusionhf缓冲液10μl，10mmdntps1μl，上游/下游引物2.5μl，模板dna1μl，phusiondna聚合酶0.5μl，ddh2o32.5μl。pcr反应条件为：先98℃30s；然后98℃10s，65℃30s，72℃1min，34个循环；最后72℃10min，4℃10min。通过soe-pcr的扩增形成sgrna表达质粒anp-pyrg-sgrna、anp-moc-sgrna和anp-laea-sgrna，其序列分别为seqidno.2，seqidno.3，和seqidno.4所示。（3）同源供体dna载体构建本实施例中同源供体dna片段分别由目标基因上/下游约1000bp同源片段，潮霉素或遗传霉素（g418）抗性基因表达框ptrpc-hph或ptrpc-neo片段，通过gibsonassembly的方法连接到由限制性内切酶xbai和ecorv线性化的质粒ppk2bargfp中，最终构建供体dna片段donor-pyrg、donor-moc、和donor-laea，其核酸序列分别如seqidno.11，seqidno.12和seqidno.13所示。构建供体dna片段其所需的pcr引物序列如表1所示。表1:实施例1和实施例2所用的引物seqidno.引物序列（5’-3’）18ptef1-fggcccggcgcgccgaattcgtttaaacttaattaattctggtacggtaccaaatc19ptef1-rtggtccttgtaatcgccatcatggtccttgtagtccatgatgacggttgtgaatgaactc20pgpda-fccaccatgttgggcccggcgcgccgaattcttcgacactgaaatacgtc21pgpda-rgtccttgtaatcgccatcatggtccttgtagtccatggtgatgtctgctcaagcggg22pglaa-fcccggcgcgccgaattcgtttaaacttaattaaaagggacagcaagtatatgatg23pglaa-rtcgtggtccttgtaatcgccatcatggtccttgtagtccattgctgaggtgtaatgatgctg24cas9-fatggactacaaggaccatgatg25cas9-rtcatcactcatcttctgttttg26ttrpc-facgtgccaaaacagaagatgagtgatgaggatccacttaacgttactgaaatcatca27ttrpc-rgtccggtcctgcccgtcaccgagatttgaccatgggagctccctctaaacaagtgtacctg28anp-fcagttacttataagcttggag29grna-raaaaagcaccgactcggtgc30anpyrg-rctatttctagctctaaaacaaggagagctgacttccgactttgaattatataggaataa31gpyrg-fgtcggaagtcagctctccttgttttagagctagaaatag32anpmoc-rtctagctctaaaacaacaggttgcggtagaaggctttgaattatataggaataat33gmoc-fcctatataattcaaagccttctaccgcaacctgttgttttagagctagaaatagc34anplaea-ragctctaaaacttggtagctgtagttattgctttgaattatataggaataatg35glaea-ftataattcaaagcaataactacagctaccaagttttagagctagaaatagca36anpyrg_up-ftgtggagtgggcgcttacacagtacacgaggactttgcagcagggaatacgagctc37anpyrg_up-raagcccaaaaatgctccttcaatatcatcttctgcctcacccaacgcgcgcgtc38anpyrg_dn-facgccccagcactcgtccgagggcaaaggaatagtgtcgagcacgggtagtcag39anhph-fcagaagatgatattgaaggag40anhph-rctattcctttgccctcggacga41anneo-fcgacgttaactgatattgaag42anneo-rtcagaagaactcgtcaagaag43anmoc_up-fatgtggagtgggcgcttacacagtacacgaggacttaaggagcaggccacgagtgg44anmoc_up-rcaaaaaatgctccttcaatatcagttaacgtcgtcagtcgttggcggcgaatttggt45anmoc_dn-fatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgacgtcggaactgtcatgaagga46anmoc_dn-ratgtacagactcggtcgtagccgcgcattggcgtcggccttcgccgcgcccaaggtttct47anlaea_up-fatgtggagtgggcgcttacacagtacacgaggacttgcggctgcaacaaccttaaag48anlaea_up-rcaaaaaatgctccttcaatatcagttaacgtcgactcgaagccatagtaattggctg49anlaea_dn-fatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgaggaacaggaccgtctcgatat50anlaea_dn-rtcatgtgattgtaatcgaccgacggaattgaggatcagtgttggtacgagttcaagpcr反应体系与pcr反应条件均与上述cas9蛋白表达载体构建中所述条件相同。实施例3：不添加同源供体dna条件下crispr/cas9系统对黑曲霉pyrg基因位点的编辑（1）黑曲霉原生质体a、菌丝体准备将成熟的黑曲霉atcc1015孢子，用0.05%吐温-80灭菌水收集，经擦镜纸过滤除去菌丝后，接种于mm液体培养基中，30℃，200rpm培养16h。b、原生质体制备将菌丝过滤收集后置于30ml裂解液（配方：0.15g裂解酶，30ml溶液a，过滤除菌；溶液a：磷酸二氢钾1.0361g，山梨醇21.864g，溶于90ml去离子水，ph调至5.6，定量至100ml，高温灭菌）中，30℃裂解2h，每隔30min轻轻摇动。而后用擦镜纸过滤后，4℃2000rpm离心10min，弃上清，加入4ml溶液b（配方：氯化钙0.735g，山梨醇18.22g，tris-hcl（1m，ph7.5）1ml，溶于90ml去离子水，ph调至7.6，定量至100ml，高温灭菌），2000rpm4℃离心10min；弃上清，按200μl原生质体/质粒加入一定体积溶液b。c、原生质体转化在预冷的15ml离心管中，依次加入50μl预冷peg（12.5gpeg6000，0.368g氯化钙，500μltrishcl（1mph7.5）），将待转化的dna片段混合好后加至200μl原生质体中。置于冰上20min后加入2ml预冷peg液体，置于室温5min，而后加入4ml溶液b，轻轻混匀。取3ml上述溶液加入12ml融化的含1.5mg/mlfoa的mm培养基中，平铺于平板中，35℃培养，3d后于挑取单个菌丝体于相应抗性平板生长。（2）crispr/cas9系统对黑曲霉pyrg基因位点的编辑a、将cas9蛋白表达质粒p0380-ptef1-cas9，p0380-pgpda-cas9及p0380-pglaa-cas9分别与anp-pyrg-sgrna表达质粒以等分子摩尔比例共转化进入黑曲霉atcc1015菌株的原生质体细胞后，cas9在sgrna介导下，通过靶向位点与宿主细胞基因组上的目标基因pyrg的dna配对来识别靶标位点进而精确切割双链dna，通过非同源端连接（nhej）对位点特异性dsb的不精确修复，从而达到编辑基因组目的，通过在平板中加入5-氟乳清酸（5-fluorooroticacid，foa）筛选出转化子，如图2显示当cas9蛋白的启动子为ptef1时转化子最多，其次为pgpda与pglaa，下面将主要针对p0380-ptef1-cas9和anp-pyrg-sgrna的转化子进行pcr验证。b、黑曲霉atcc1015转化子验证黑曲霉基因组提取方法如下：采用酚氯仿法从上述转化过程中挑选的转化子提取基因组dna，具体包括以下操作：1）2.0ml的无菌的dna提取管中加入200mg的锆珠及1ml的裂解液（配方：0.2mtris·hcl(ph7.5)，0.5mnacl，10mmedta，1％sds（w/v）），挑取平板中生长的黑曲霉菌丝于dna提取管中；2）将所有dna提取管置于助磨器上，最大转速振荡30s，重复两次；3）65℃水浴30min，在水浴过程中每隔几分钟漩涡振荡；4）水浴结束后取出，每管加入80μltris·hcl（1m，ph7.5）中和；5）加入400μl的酚：氯仿（1:1），13000rpm离心5分钟；6）取300μl上清液于新的1.5mlep管中，加入600μl95％的乙醇（dna级）；7）冰上孵育一小时，随后4℃、13000rpm离心，可看到白色的dna沉淀于ep管底部；8）用75％的酒精（dna级）400μl清洗，4℃13000rpm离心，轻轻取出上清液；9）将ep管置于真空浓缩仪中，除去残留的酒精；10）加入50μlddh2o溶解dna，用nanodrop测dna浓度，测完浓度后将提取的dna置于-20℃冰箱保存，以备下一步进行pcr验证。c、pcr验证转化子以上述提取的基因组dna为模版，用引物pyrg-seq-f和pyrg-seq-r对转化子进行基因pcr验证。pcr反应试剂购于南京诺唯赞生物科技有限公司。引物序列如下：pyrg-seq-f:atgtcctccaagtcgcaattga（seqidno.51）pyrg-seq-r:ttagtttccgccgacacgggcca（seqidno.52）pcr反应体系为：10×taqbuffer2μl，10mmdntpmix0.2μl，上游/下游引物各0.4μl，dna模板1μl，taqdnapolymerase0.2μl，水15.8μl。pcr反应条件为：先94℃5min；然后94℃30s，55℃30s，72℃1.2min，30个循环；最后72℃7min，4℃10min.实验结果：对pcr扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳（110v电压，30分钟），在凝胶成像系统下可观察到明显基因扩增条带，pcr条带的大小为~0.9kb。随后对目的片段进行测序验证，测序结果如图3所示，表明cas9在sgrna介导下对目标靶点的第三个核酸碱基进行了切割，并通过非同源端连接（nhej）对位点特异性dsb的不精确修复，得到基因组编辑突变株，说明如seqidno.1所示的dna片段（anp）具有调控sgrna编码dna的转录的启动子功能。实施例4添加同源供体dna条件下crispr-cas9系统对黑曲霉pyrg基因的编辑如实施例3中的操作方法，将cas9蛋白表达质粒p0380-ptef1-cas9、anp-pyrg-sgrna表达质粒和同源供体dnadonor-pyrg以等比例混合后共转化进入黑曲霉atcc1015原生质体细胞后，cas9在sgrna介导下，通过靶标序列与宿主细胞基因组上的目标基因的dna配对来识别靶标位点进行切割，随后供体dna片段与靶标位点两侧序列发生同源重组，从而达到编辑基因组的目的，通过在平板中加入潮霉素筛选转化子。黑曲霉转化子验证：（1）基因组提取方法与上述一致。（2）pcr验证转化子以上述提取的基因组dna为模版，用下述引物pyrg-yz-f和pyrg-yz-r对转化子进行基因pcr验证。pcr扩增所用引物为：pyrg-yz-f:ccacatcatcaactgcagcat（seqidno.53）pyrg-yz-r:tccttgtgccacaccatagta（seqidno.54）pcr反应试剂购于南京诺唯赞生物科技有限公司。pcr反应体系为：10×taqbuffer2μl，10mmdntpmix0.2μl，上游/下游引物各0.4μl，dna模板1μl，taqdnapolymerase0.2μl，水15.8μl。pcr反应条件为：先94℃5min；然后94℃30s，55℃30s，72℃1.2min，30个循环；最后72℃7min，4℃10min.（3）对pcr扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳（110v电压，30分钟），在凝胶成像系统下显示出明显的基因扩增条带，突变体的pcr扩增条带为1.70kb，野生型菌株目的条带为0.65kb，结果如图4所示，表明供体dna片段与靶标位点两侧序列发生同源重组，进而得到基因编辑突变株。在获得的36个转化中，有35个转化子发生同源重组，其同源重组效率高达97.2%。实施例5crispr/cas9系统对黑曲霉苹果酸合成负调控基因moc进行编辑为构建黑曲霉苹果酸合成菌株，首先将苹果酸转运蛋白编码基因在黑曲霉中进行过表达，具体如下：1.黑曲霉苹果酸合成菌株的构建a、表达载体构建苹果酸转运蛋白基因mae（核酸序列及其对应的蛋白质氨基酸序列分别如seqidno.59和seqidno.60所示）表达载体构建以pv2质粒（genbank:kj569568.1）为骨架，以ptef为启动子（如seqidno.1所示），以来源于嗜热毁丝霉的tpgk为启动子（如seqidno.61所示）。pcr扩增后将上述片段连接入被hindiii/ecorv线性化的pv2质粒中，获得mae表达载体pv2-mae。pcr的反应体系和反应条件如实施2所述。pcr所用引物如下：antef_mae-f:gggccccccctcgaggtcgacggtatcgataagctttcgaataaccactgtcggggt（seqidno.62）antef_mae-r:actctcatcttcactctctctctctctcgagacctaatcagatacatcctcatc（seqidno.63）tpgk_mae-f:catgtacccgggtaaagatgaggatgtatctgattaggtctcgagagagagagagag（seqidno.64）tpgk_mae-r:ctagtggatcccccgggctgcaggaattcgatatcaaacaccaatcccaactcgtc（seqidno.65）mae-f:atgctgacacctcccaagtttg（seqidno.66）mae-r:ctaatcagatacatcctcatcttta（seqidno.67）b、转化子验证及表型分析如实施例3中的操作方法，将苹果酸转运蛋白基因mae表达载体pv2-mae导入黑曲霉atcc1015原生质体中，通过在平板中加入潮霉素筛选转化子。用如实施例3中所述基因组提取方法，获得转化子的基因组dna，而后用引物antef_mae-f和tpgk_mae-r对转化子进行pcr验证，将获得的阳性突变株命名为anm1菌株。pcr反应体系为：10×taqbuffer2μl，10mmdntpmix0.2μl，上游/下游引物各0.4μl，dna模板1μl，taqdnapolymerase0.2μl，ddh2o15.8μl。pcr反应条件为：先94℃5min；然后94℃30s，55℃30s，72℃1.2min，30个循环；最后72℃7min，4℃10min.将上述验证的转化子接种至250ml三角瓶中的50ml培养基中（配方：葡萄糖75g/l，蛋白胨6.0g/l，kh2po40.15g/l，k2hpo40.15g/l，cacl2·2h2o0.10g/l，mgso4·7h2o0.10g/l，碳酸钙80.0g/l，生物素（0.5g/l）1ml/l，微量元素液1ml/l；微量元素配方：c6h8o·7h20.5g/l，znso4·7h2o0.5g/l，fe(nh4)2(so4)·6h2o0.1g/l，cuso4·5h2o0.025g/l，mnso4·h2o0.005g/l，h3bo30.005g/l，namoo4·2h2o0.005g/l），接种量为2.5*105个/ml，30℃，200rpm培养，第5天取样测定苹果酸含量。（1）样品处理：取1ml发酵液于15ml离心管中，并添加1ml1mh2so4，而后80℃下放置30min，每个隔10min进行充分震荡。之后将2ml双蒸水添加至离心管中，充分震荡后，取1ml液体于1.5ml离心管中，12000rpm离心10min，取上清液测定苹果酸含量。（2）苹果酸含量测定处理后的样品用高效液相色谱测定苹果酸含量，其中检测器为紫外检测器，5mmh2so4为流动相，流速为0.5ml/min。结果显示过表达苹果酸转运蛋白基因mae，能显著促进苹果酸的生产，第5天时转化子anm1的苹果酸产量为36.4g/l，与出发菌种（野生型黑曲霉atcc1015）相比提高了25%（如图5）。2.利用crispr/cas9系统敲除moc基因如实施例3中的操作方法，将cas9蛋白表达质粒p0380-ptef1-cas9、anp-moc-sgrna表达质粒和同源供体dnadonor-moc以等比例混合后共转化进入黑曲霉anm1原生质体细胞后，cas9在sgrna介导下，通过靶标序列与宿主细胞基因组上的moc的dna配对来识别靶标位点进行切割，随后供体dna片段与靶标位点两侧序列发生同源重组，从而达到编辑基因组的目的，通过在平板中加入g418筛选转化子。a、黑曲霉转化子验证（1）基因组提取方法与上述一致。（2）pcr验证转化子以上述提取的基因组dna为模版，用下述引物moc-yz-f和moc-yz-r对转化子进行基因pcr验证。pcr扩增所用引物为：moc-yz-f:acctcccactcacaacaaacta（seqidno.55）moc-yz-r:acaacaacctcttccaacccta（seqidno.56）pcr反应试剂购于南京诺唯赞生物科技有限公司。pcr反应体系为：10×taqbuffer2μl，10mmdntpmix0.2μl，上游/下游引物各0.4μl，dna模板1μl，taqdnapolymerase0.2μl，ddh2o15.8μl。pcr反应条件为：先94℃5min；然后94℃30s，55℃30s，72℃1.2min，30个循环；最后72℃7min，4℃10min.（3）对pcr扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳（110v电压，30分钟），在凝胶成像系统下显示出明显的基因扩增条带，突变体的pcr扩增条带为1.7kb，野生型菌株目的条带为0.9kb，表明供体dna片段与靶标位点两侧序列发生同源重组，最终得到基因编辑突变株anm1δmoc菌株。b、转化子表型分析将上述验证的转化子接种至250ml三角瓶中的50ml培养基中（配方同上），接种量为2.5*105个/ml，30℃，200rpm培养，第5天取样测定苹果酸含量。（1）样品处理处理方式与上述一致（2）苹果酸含量测定处理后的样品用高效液相色谱测定苹果酸含量，其中检测器为紫外检测器，5mmh2so4为流动相，流速为0.5ml/min。结果通过本发明的crispr/cas9系统对黑曲霉苹果酸合成负调控基因moc进行编辑后，能显著促进苹果酸的生产，第5天时苹果酸产量为61.2g/l，与对照菌株anm1相比提高了68%（如图5）。实验说明本发明的crispr/cas9能显著提高黑曲霉遗传改造效率，促进宿主细胞目标产量的提高。实施例6crispr/cas9系统对黑曲霉苹果酸合成负调控基因moc和laea同时进行编辑如实施例3中的操作方法，将cas9蛋白表达质粒p0380-ptef1-cas9、sgrna表达框（anp-moc-sgrna和anp-laea-sgrna）以及同源供体dna（donor-moc和donor-laea）以等比例混合后共转化进入黑曲霉anm1原生质体细胞后，cas9在相应sgrna介导下，通过靶标序列与宿主细胞基因组上的moc和laea的dna链配对来识别靶标位点进行切割，随后供体dna片段分别与靶标位点两侧序列发生同源重组，从而达到编辑基因组的目的，通过在平板中加入g418筛选转化子。a、黑曲霉转化子验证（1）基因组提取方法与上述一致。（2）pcr验证转化子以上述提取的基因组dna为模版，用下述引物moc-yz-f/r和laea-yz-f/r分别对转化子基因组moc和laea位点进行基因pcr验证。pcr扩增所用引物为：laea-yz-f:gcagcctgcatacaccctgtt（seqidno.57）laea-yz-r:ggacatccgtgctactgtgaa（seqidno.58）pcr反应试剂购于南京诺唯赞生物科技有限公司。pcr反应体系为：10×taqbuffer2μl，10mmdntpmix0.2μl，上游/下游引物各0.4μl，dna模板1μl，taqdnapolymerase0.2μl，ddh2o15.8μl。pcr反应条件为：先94℃5min；然后94℃30s，55℃30s，72℃1.2min，30个循环；最后72℃7min，4℃10min.（3）对pcr扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳（110v电压，30分钟），在凝胶成像系统下显示出明显的基因扩增条带，突变体的pcr扩增条带为~1.7kb，野生型菌株目的条带为~0.9kb，表明供体dna片段与两个靶标位点两侧序列分别发生了同源重组，进而得到基因编辑突变株anm1δmocδlaea菌株，说明本发明中crispr/cas9系统能够同时对黑曲霉基因组上的至少两个基因位点进行编辑。b、转化子表型分析将验证的转化子全部接种至250ml三角瓶中的50ml以葡萄糖为碳源培养基中（配方同实施例5），接种量为2.5*105个/ml，30℃，200rpm培养，第5天取样。样品经实施例5所述方法进行处理后，测定发酵液中苹果酸含量。结果显示通过本发明中的crispr/cas9系统对黑曲霉苹果酸合成负调控基因moc和laea同时进行编辑后，能显著促进苹果酸的生产，第5天时anm1δmocδlaea菌株苹果酸产量为67.1g/l，与对照菌株anm1以及anmδmoc相比分别提高了86.4%和10%（如图5）。实验说明本发明中的crispr/cas9能同时编辑黑曲霉基因组的两个位点，显著提高黑曲霉遗传改造效率，促进宿主细胞目标产量的提高。序列表<110>中国科学院天津工业生物技术研究所<120>一种调控sgrna转录的启动子、表达载体，及其基因组编辑系统和应用<160>67<170>patentinversion3.1<210>1<211>523<212>dna<213>aspergillusniger<400>1cagttacttataagcttggagcttggatctctttgcggtggaccttccttgaagggtttc60ttctctgtactatcatgcgaatgctaaagcagaactttaacagaaccaccagtgtctaat120aaattcgatccgtatattgtgcaccattactcatctgtgtttcccccaaacatgcagtct180cctgcgcagatagactgtcaactatagtaattcccgtccgcgaagccgccctatccaaaa240gtgtattaccctctcttgtatgcaacaagagtcgttctttctcgcgctaatacccatccg300tctatcgcacaattaaaccttctgatccctacaatttgcctgacaaaataaatgaagttc360aacgtgcaaacaagctagagccagtgtacattgagtatcatctgcagctctactcaaggt420actatagtacctcagccaatttgatgttcctgccttcccgcccctcgcttagccgaccaa480ttagagttcgttaattctaaccattattcctatataattcaaa523<210>2<211>624<212>dna<213>aspergillusniger<400>2cagttacttataagcttggagcttggatctctttgcggtggaccttccttgaagggtttc60ttctctgtactatcatgcgaatgctaaagcagaactttaacagaaccaccagtgtctaat120aaattcgatccgtatattgtgcaccattactcatctgtgtttcccccaaacatgcagtct180cctgcgcagatagactgtcaactatagtaattcccgtccgcgaagccgccctatccaaaa240gtgtattaccctctcttgtatgcaacaagagtcgttctttctcgcgctaatacccatccg300tctatcgcacaattaaaccttctgatccctacaatttgcctgacaaaataaatgaagttc360aacgtgcaaacaagctagagccagtgtacattgagtatcatctgcagctctactcaaggt420actatagtacctcagccaatttgatgttcctgccttcccgcccctcgcttagccgaccaa480ttagagttcgttaattctaaccattattcctatataattcaaagtcggaagtcagctctc540cttgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaa600agtggcaccgagtcggtgcttttt624<210>3<211>624<212>dna<213>aspergillusniger<400>3cagttacttataagcttggagcttggatctctttgcggtggaccttccttgaagggtttc60ttctctgtactatcatgcgaatgctaaagcagaactttaacagaaccaccagtgtctaat120aaattcgatccgtatattgtgcaccattactcatctgtgtttcccccaaacatgcagtct180cctgcgcagatagactgtcaactatagtaattcccgtccgcgaagccgccctatccaaaa240gtgtattaccctctcttgtatg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