miR156及其相关生物材料在调控植物抗病性中的应用的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及mir156及其相关生物材料在调控植物抗病性中的应用。
背景技术：
：microrna(mirna)是一类非编码的小rna(smallrna)。microrna最早发现于1993年，在秀丽新小杆线虫(caenorhabditiselegan)中发现了第一条能时序调控胚胎发育的基因lin-4。2000年，又在线虫中发现了调控晚期幼虫到成虫时期转变的基因let-7，并将这类长度约为21nt的小分子rna命名为strna(smalltemporalrna)。随着分子克隆技术与生物信息学的不断发展，科研人员随后又在拟南芥(arabidopsisthaliana)、小麦(triticumaestivum)和水稻(oryzasativa)等植物中发现了不同类型与数量的小分子rna，并将其称为microrna(mirna)。在植物中，该类rna主要是通过剪切降解下游靶基因来参与植物的生长及胁迫过程。mir156最早发现于拟南芥中，是陆地植物中最保守的mirna。mir156是植物年龄的响应因子，是植物从幼年到成年的主要调控因素之一。在拟南芥中，mir156会随着植物年龄不断增长而逐渐下调，这一现象在玉米和水稻中也普遍存在。当mir156在植物中过表达时，会延长植物幼年期的持续时间，并出现侧枝增多、叶片增多并且生长发育变快和开花延迟等表型。但该基因在抗病方面的相关研究未见报道。白桦(betulaplatyphyllasuk.)是我国东北地区蓄积量最大的乡土速生阔叶树种，也是天然次生林更替的先锋树种。技术实现要素：本发明的目的是提高植物抗病性。本发明首先保护a1)或a2)所示的mirna在调控植物抗病性中的应用；a1)序列表的序列1所示；a2)将序列1删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列1具有相同功能的mirna。本发明还保护b1)或b2)所示的rna在调控植物抗病性中的应用；b1)序列表的序列2所示；b2)将序列2删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列2具有相同功能的rna。本发明还保护与上述mirna或rna相关的生物材料在调控植物抗病性中的应用；所述与mirna或rna相关的生物材料为下述a1)至a12)中的任一种：a1)编码上述mirna或rna的核酸分子；a2)含有a1)所述核酸分子的表达盒；a3)含有a1)所述核酸分子的重组载体；a4)含有a2)所述表达盒的重组载体；a5)含有a1)所述核酸分子的重组微生物；a6)含有a2)所述表达盒的重组微生物；a7)含有a3)所述重组载体的重组微生物；a8)含有a4)所述重组载体的重组微生物；a9)含有a1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；a10)含有a2)所述表达盒的转基因植物细胞系；a11)含有a3)所述重组载体的转基因植物细胞系；a12)含有a4)所述重组载体的转基因植物细胞系。上述应用中，a1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)：1)其编码序列是序列3或序列3第221-412位所示的cdna分子或基因组dna分子；2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述mirna或rna的cdna分子或基因组dna分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述mirna或rna的cdna分子或基因组dna分子。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列1或序列2所示的rna序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述重组载体为含有上述mirna或rna的编码基因的表达载体。在本发明的一个具体实施例中，所述重组载体为pgwb2-mir156；所述pgwb2-mir156为将大小为192bp的dna片段(序列3第221-412位所示的dna片段)通过同源重组整合到pgwb2载体中得到的载体。上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。所述细菌可为农杆菌；所述农杆菌具体可为eha105农杆菌。在本发明的一个具体实施例中，所述重组微生物为含有所述重组载体pgwb2-mir156的eha105农杆菌。上述应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。上述应用中，所述调控植物抗病性为提高植物抗病性，具体体现在如下a1)-a3)中的任一种：a1)当植物中mir156表达量提高时，所述植物的病斑数减少；a2)当植物中mir156表达量提高时，所述植物的超氧化物歧化酶和/或过氧化氢酶和/或过氧化物酶和/或多酚氧化酶和/或苯丙氨酸解氨酶活性提高；a3)当植物中mir156表达量提高时，所述植物的抗病基因表达量提高；所述抗病基因为bpmyb106和/或bpmyb61和/或bprpp13和/或bprpm1。上述应用中，序列表中序列1所示的rna分子为mir156成熟体序列；序列表中序列2所示的rna分子为mir156前体序列；序列表中序列3所示的dna分子为mir156前体序列的编码基因序列。上述mirna或rna或生物材料在培育抗病性提高的转基因植物或植物育种中的应用也属于本发明的保护范围。本发明最后保护一种培育抗病性提高的转基因植物的方法。本发明提供的培育抗病性提高的转基因植物的方法包括提高受体植物中上述mirna或rna的表达量，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的抗病性高于所述受体植物。上述方法中，所述转基因植物的抗病性高于所述受体植物体现在如下(1)-(3)中的任一种：(1)所述转基因植物的病斑数少于所述受体植物；(2)所述转基因植物的超氧化物歧化酶和/或过氧化氢酶和/或过氧化物酶和/或多酚氧化酶和/或苯丙氨酸解氨酶活性高于所述受体植物；(3)所述转基因植物的抗病基因表达量高于所述受体植物；所述抗病基因为bpmyb106和/或bpmyb61和/或bprpp13和/或bprpm1。进一步的，所述提高受体植物中上述mirna或rna的表达量的方法为在受体植物中过表达上述mirna或rna；所述过表达的方法为将上述mirna或rna的编码基因导入受体植物；所述mirna或rna的编码基因是序列3或序列3第221-412位所示的dna分子。在本发明的一个具体实施例中，所述mirna或rna的编码基因是通过重组载体pgwb2-mir156导入受体植物。所述重组载体pgwb2-mir156为将大小为192bp的dna片段(序列3第221-412位所示的dna片段)通过同源重组整合到pgwb2载体中得到的载体。上述方法中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物可为白桦；所述白桦具体可为东北白桦。本发明以转mir156白桦为研究对象，以野生型白桦为对照，通过检测病害发生后的病斑数，测定超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶活性，从生理角度研究了mir156对染病植物受损伤程度的影响；并通过分析转mir156白桦及对照中抗病相关基因的表达情况，进一步证明了mir156对植物抗病途径的调控。本发明对揭示mir156的抗病功能及抗病白桦品种的培育具有重大意义，有助于丰富林木育种资源。附图说明图1为转mir156白桦的pcr检测。m：markerdl2000；1：pgwb2-mir156；2：野生型白桦wt；3-10：转mir156白桦株系。图2为各转mir156白桦株系中mir156的定量分析。图3为野生型白桦wt及转mir156白桦株系ox156叶片在100倍电镜下的病斑。图4为野生型白桦wt及转mir156白桦株系的sod活性测定。图5为野生型白桦wt及转mir156白桦株系的pod活性测定。图6为野生型白桦wt及转mir156白桦株系的ppo活性测定。图7为野生型白桦wt及转mir156白桦株系的pal活性测定。图8为野生型白桦wt及转mir156白桦株系的cat活性测定。图9为野生型白桦wt及转mir156白桦株系中抗病基因的表达量检测。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中的pgwb2载体记载于文献“颜斌,武丹阳,李慧玉.白桦bpbee2基因的遗传转化及抗逆性分析[j].植物研究,2019,39(02):287-293”中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。下述实施例中的东北白桦记载于文献“吕梦燕,东北白桦comt1和cesa4基因克隆及反义comt1遗传转化,东北林业大学硕士论文，2013”中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。本发明中的mir156成熟体序列为序列表中序列1所示的rna分子。本发明中的mir156前体序列为序列表中序列2所示的rna分子。本发明中的mir156前体序列的编码基因序列为序列表中序列3所示的dna分子。实施例1、mir156在调控白桦抗病性中的应用一、转mir156白桦的构建及鉴定应用gateway技术构建过表达载体pgwb2-mir156，并采用根瘤农杆菌介导的合子胚法进行白桦的遗传转化，通过pcr和定量pcr的方法鉴定得到转mir156白桦。具体步骤如下：1、转mir156白桦的构建(1)过表达载体pgwb2-mir156的构建将含有mir156成熟序列的大小为192bp的dna片段(序列3第221-412位所示的dna片段)通过gateway技术构建到入门载体pentr(购自invitrogen公司)中，然后使用gatewaylrclonasetmⅱenzymemix(购自invitrogen公司)通过lr反应将大小为192bp的dna片段(序列3第221-412位所示的dna片段)进行同源重组整合到pgwb2载体中，得到过表达载体pgwb2-mir156。(2)重组菌的构建将步骤(1)构建的过表达载体pgwb2-mir156导入eha105农杆菌(购自上海唯地生物技术有限公司)中，得到含有过表达载体pgwb2-mir156的重组菌eha105/pgwb2-mir156。(3)转mir156白桦的获得将步骤(2)构建的重组菌eha105/pgwb2-mir156采用根瘤农杆菌介导的合子胚法进行东北白桦的遗传转化，得到转mir156白桦。具体步骤如下：将一定量的种子用流水冲洗2-3d左右，至种子吸水饱满，当即将要露出芽点时，停止冲洗。在超净工作台下用30％h2o2浸泡10-15min，期间不断摇晃，最后用无菌水冲洗种子4-5次，以除去其表面的h2o2，置于无菌的培养皿中备用。活化菌种至od600的值为0.4-0.5左右。纵切合子胚，去掉种皮，将切好的合子胚放入菌液(重组菌eha105/pgwb2-mir156菌液)中5min，同时设置两个对照，对照不用侵染，直接纵切放入到培养基中即可。侵染后的合子胚置于共培养培养基中，暗培养2-3d后，置于选择培养基中进行选择。约20d左右，选择培养得到抗性愈伤，将其切下置于分化培养基中。抗性愈伤在分化培养基中分化得到不定芽，逐步生长为丛生苗。在丛生苗中选择生长健壮的抽茎苗剪下，置于生根培养基中，获得生根苗。为了降低假阳性的存在，将转基因的生根苗的叶片或茎部剪下来，沿叶脉处从中间切开，露出伤口，将有伤口的叶片或茎段放到分化培养基的平板上，用封口膜封口。大约7-10d后在叶片的伤口处长出抗性愈伤，抗性愈伤切下置于新的分化培养基的平板上，直至长出不定芽。2、转mir156白桦的鉴定(1)pcr检测以步骤1构建的转mir156白桦的总dna为模板，以过表达载体pgwb2-mir156作为阳性对照，以野生型白桦(wt)作为阴性对照，分别采用载体引物与基因引物(引物序列如表1所示)进行pcr扩增，检测目的基因是否成功整合到植物体中。pcr反应体系为20μl，反应体系具体组分和用量如表2所示，反应程序如下：94℃条件下预变性4min，94℃变性45s，58℃退火15s，72℃延伸1min，35个循环后继续在72℃延伸10min。pcr产物以1.0％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。表1、pcr检测所用的引物序列表2、转基因白桦的pcr反应体系组份体积/μl10×rtaqbuffer2dntpmix(2.5mmol/l)2引物-f(10μmol/l)0.5引物-r(10μmol/l)0.5rtaq酶0.3模板(dna)1水13.7结果表明：8个转mir156白桦株系均在285bp的位置扩增出条带，与阳性对照扩增结果一致，而野生型白桦(wt)中没有检测到对应条带(图1)，说明mir156已经成功整合到了白桦基因组中。将8个阳性转mir156白桦株系分别命名为ox156-1、ox156-2、ox156-3、ox156-4、ox156-5、ox156-6、ox156-7和ox156-8。(2)qrt-pcr检测以经步骤(1)pcr鉴定为阳性的8个转mir156白桦株系ox156-1、ox156-2、ox156-3、ox156-4、ox156-5、ox156-6、ox156-7和ox156-8和野生型白桦(wt)叶片为材料，采用北京百泰克生物技术有限公司的通用植物microrna提取试剂盒(离心柱型)及biotekemirnacdna第一链合成试剂盒提取microrna，并反转录为cdna。以反转录获得的cdna为模板，采用北京全式金生物技术有限公司的uransstarttopgreenqpcrsupermix试剂盒进行实时定量pcr扩增。实时定量pcr体系如下：expresssybrpremixedrox0.6μl，mirna-forwardprimer0.24μl，universalqpcrprimer0.24μl，模板2μl，depc-treatedwater3.52μl，总体系12μl，循环反应参数为50℃孵育2min，95℃预变性2min，95℃变性15s，60℃退火延伸1min，循环40次，60～95℃绘制溶解曲线。以上反应在abi7500荧光定量pcr仪上完成。选取u6作为内参基因，所有试样均进行3次生物重复，采用–δδct方法进行基因的相对定量分析。定量pcr引物序列如下：mirna156：上游引物：5′-ttgacagaagagagtgagcacaca-3′；下游引物：5′-gcttgacagaagatagagagcacaa-3′；u6：上游引物：5′-ggtccttcgggacatccgat-3′；下游引物：5′-gggaccatttctcgatttatgcgtg-3′。结果表明：8个阳性转mir156白桦株系ox156-1、ox156-2、ox156-3、ox156-4、ox156-5、ox156-6、ox156-7和ox156-8中mir156的相对表达量均显著高于野生型对照株系(wt)，尤其是ox156-2和ox156-4株系中mir156的表达量最高，分别比对照株系上调了24.25和7.46倍。上述实验表明：转mir156白桦株系ox156-1、ox156-2、ox156-3、ox156-4、ox156-5、ox156-6、ox156-7和ox156-8中外源mir156稳定存在并表达。选取转mir156白桦株系ox156-1、ox156-2、ox156-3、ox156-4、ox156-5、ox156-6、ox156-7和ox156-8用于下述抗病性分析。二、转mir156白桦的抗病性分析将步骤一构建的转mir156白桦株系(ox156-1、ox156-2、ox156-3、ox156-4、ox156-5、ox156-6、ox156-7和ox156-8)及野生型白桦(wt-1和wt-2)通过组织培养的方式进行扩繁，待其生根后移栽到10cm×10cm的营养钵中，营养钵中加入相同重量的基质(黑土：草炭土：蛭石＝2:2:1)，随机区组排列，在东北林业大学白桦育种基地室外开放状态下统一培养管理。在2018年夏季染病严重阶段选取二年生转mir156白桦株系和野生型对照白桦(wt)的叶片进行病斑数统计、生理指标测定及抗病基因的表达量检测。具体步骤如下：1、叶片病斑数统计使用电子显微镜对染病后的各转mir156株系(ox156-1、ox156-2、ox156-3、ox156-4、ox156-5、ox156-6、ox156-7和ox156-8)及野生型白桦(wt-1和wt-2)的叶片进行镜检，具体步骤如下：于移栽后第二年的盛夏取染病后的各转mir156株系及野生型对照株系的第五片叶子的中、下部进行100倍电镜下的病斑观察，每个叶片拍照3张，统计病斑数，并计算病斑数的平均值。每个株系选取3株植株。结果表明：各转mir156白桦株系叶片的病斑数明显少于野生型对照株系，单位视野内野生型对照株系最高病斑个数为12个，各转mir156株系的病斑数最高则为4个(表3和图3)。表3、100倍电镜下转mir156白桦和野生型对照白桦的病斑数2、生理指标的测定编号wt-1wt-2ox156-1ox156-2ox156-3ox156-4ox156-5ox156-6ox156-7数目8±1.212±1.52±0.23±0.32±0.164±0.262±02±0.31±0取各转mir156株系及野生型对照株系的第5-7片叶子，测定超氧化物歧化酶(sod)、过氧化氢酶(cat)、过氧化物酶(pod)、多酚氧化酶(ppo)、苯丙氨酸解氨酶(pal)的活性。具体测定步骤参见文献“李合生,孙群,赵世杰等.植物生理生化实验原理和技术[m].北京:高等教育出版社,2000”中的方法。每个样品设置3次重复。每个株系选取3株植株。(1)sod活性测定转mir156白桦中的超氧化物歧化酶(sod)活性与野生型对照株系差异显著，转mir156白桦株系的sod活性均明显高于野生型对照株系(图4)，其中野生型白桦wt-1的sod活性最低，为27.3u/g，转mir156白桦株系ox156-3中的sod活性最高，为71.7u/g，比野生型对照株系(wt-1)的sod活性提高了162％。(2)pod活性测定转mir156白桦中的过氧化物酶(pod)活性与野生型对照株系显著差异，各转mir156白桦的pod酶活性均高于野生型对照白桦(图5)，其中野生型白桦wt-1的pod酶活性为0.11u/g，转mir156白桦株系ox156-3中pod酶活性最高，为0.66u/g，比野生型对照株系(wt-1)提高了500％。(3)ppo活性测定转mir156白桦中的多酚氧化酶(ppo)活性普遍高于野生型对照株系(图6)，其中野生型白桦wt-2的ppo酶活性最低，为0.215(g·min)-1，转mir156株系ox156-7中的ppo酶活性最高，为0.470(g·min)-1，比野生型对照株系(wt-2)提高了118.6％。(4)pal活性测定转mir156白桦中的苯丙氨酸转氨酶(pal)活性均高于野生型对照株系(图7)，其中野生型白桦wt-1的pal酶活性最低，为44.49(g·h)-1，转mir156株系ox156-2的pal酶活性最高，为81.45(g·h)-1，比野生型对照株系(wt-1)提高了83.1％。(5)cau活性测定转mir156白桦中的过氧化氢酶(cat)活性均高于野生型对照株系(图8)，其中野生型白桦wu-1的cat酶活性最低，为89.6(g·min)-1，转mir156株系ox156-7的cat酶活性最高，为128.1(g·min)-1，比野生型对照株系(wt-1)提高了43.0％。3、抗病基因表达分析采用北京百泰克生物技术有限公司的通用植物rna提取试剂盒(离心柱型)提取各转mir156株系及野生型对照株系的总rna。通过eppendorf紫外检测仪，检测提取的rna样品的质量及浓度。使用toyobo的revertraaceqpcrrtkit试剂盒进行反转录cdna。根据白桦基因组序列，获得白桦病程相关基因myb2(akn79284.1)、myb106(amr97400.1)、myb61(alv66190.1)、wrky57(wrky57基因序列如序列表中序列4所示)、rpp13(rpp13基因序列如序列表中序列5所示)、rpm1(基因序列如序列表中序列6所示)的同源基因，设计引物进行定量pcr，选用18srrna作为内参基因。引物序列如下：myb106：上游引物：5′-ggaatggagaattcgttgtcg-3′；下游引物：5′-atagtagtcactgccactcc-3′；myb2：上游引物：5′-ccaccactacgagtaactcc-3′；下游引物：5′-agagcttgaacttgatgttgg-3′；myb61：上游引物：5′-cgaacttcatgcagttctcg-3′；下游引物：5′-tagccttgtgcagcaattgg-3′；wrky57：上游引物：5′-ggacaacaacactagcaacagc-3′；下游引物：5′-ccatcttcaagatgatcaacc-3′；rpp13：上游引物：5′-aacaagagagaagtgcaatgc-3′；下游引物：5′-ggaactgcttctgaagttcc-3′；rpm1：上游引物：5′-ggtgcaaattgttgctgagg-3′；下游引物：5′-gaagttcatgtcttctagtagg-3′；18srrna：上游引物：5′-atcttgggttgggcagatcg-3′；下游引物：5′-cattactccgatcccgaagg-3′。荧光定量pcr采用sybrgreenrealtimepcrmasuermix试剂盒进行，反应体系如下：sybrgreeni10.0μl，cdna2μl，上、下游引物各0.8μl，水6.4μl，总体积20μl。每个样品重复3次。使用实时数据采集模式，循环反应参数为：94℃预变性30s，94℃变性12s，56℃退火45s，72℃延伸45s，循环45次，在78.5℃读板1s，收集荧光，绘制溶解曲线，温度由58℃开始，至99℃止，以上反应在abi9700pcr仪上完成。以野生型白桦叶片为对照，采用-△△ct计算对应基因的相对表达量。结果表明：基因bpmyb106、bpmyb61、bprpp13、bprpm1在转mir156白桦中均上调表达(>2倍)，尤其是bpmyb106基因上调倍数达8倍，其次是bpmyb61基因和bprpm1基因，分别上调了近4倍。说明在病害侵染的作用下，mir156增强了myb106、myb61、rpp13及rpm1的表达，从而提高了转基因植株的抗病性。对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。序列表<110>东北林业大学<120>mir156及其相关生物材料在调控植物抗病性中的应用<160>6<170>patentinversion3.5<210>1<211>20<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1cacgagugagagaagacagu20<210>2<211>715<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2tguuuuuguuuuuguuuuuguuuguuucguuuucuuuuuucuuggguuuguggauuuuuu60ucugggucugaaaaaacccuaaauccucauugaaaguuucccaguuuuagaccaaaagag120aaugggaauaugggauuuggguugcuuuuccugaaaugggucucagaucugacuuuuuuu180uuuguucuuucuucuuugaguuuguucgcugaauccuuugguuuccacaucugggaauaa240gcugucuuuauuauuccuuuucuaauuuucuguuuguuucccugggacauagaaauugac300agaagagagugagcacacagaggccauaugguauaaagucuauacuaaugcuuuugcgug360cucacuucucuuucugucagauuccagucccggaggaguccugccauuguuccagauccu420aucuuuuuucuuuuuugaugaauauuuuucuccuucaacuucaacagcugcgcaagaaga480agauaacagugcaucuagaguacucuauuguuugaauuuugacgaauaauuacaccuguu540aauuaauuauauauaauuauauauguuguaguggugauugugugaaagcgugacuuuuga600ugguguuuucaugagaaggugagccugauuacugugcggauuaagcggcaaauuaucuug660uuuauauauaaauauauauauuauaucuauauauauauaucaugggaccauuccc715<210>3<211>715<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3tgtttttgtttttgtttttgtttgtttcgttttcttttttcttgggtttgtggatttttt60tctgggtctgaaaaaaccctaaatcctcattgaaagtttcccagttttagaccaaaagag120aatgggaatatgggatttgggttgcttttcctgaaatgggtctcagatctgacttttttt180tttgttctttcttctttgagtttgttcgctgaatcctttggtttccacatctgggaataa240gctgtctttattattccttttctaattttctgtttgtttccctgggacatagaaattgac300agaagagagtgagcacacagaggccatatggtataaagtctatactaatgcttttgcgtg360ctcacttctctttctgtcagattccagtcccggaggagtcctgccattgttccagatcct420atcttttttcttttttgatgaatatttttctccttcaacttcaacagctgcgcaagaaga480agataacagtgcatctagagtactctattgtttgaattttgacgaataattacacctgtt540aattaattatatataattatatatgttgtagtggtgattgtgtgaaagcgtgacttttga600tggtgttttcatgagaaggtgagcctgattactgtgcggattaagcggcaaattatcttg660tttatatataaatatatatattatatctatatatatatatcatgggaccattccc715<210>4<211>900<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4atggacgacggggacaaatccgatccaggaaacgagttcgccagcgacgactcgagctgg60ccgctcgggcctgactcggagagcgtttacttcttctccaacgacagagagagcagcata120ctaagcgagttcgggtggaatcttcacccggaggatccgaaccggatcggcttcgacgat180gcctccgatttggcgggaagcttcggcctgccggacaacaacactagcaacagccccttg240cagggctccgacccggcagctccggtcgggtcggacagcaaggtcggcgacgcgtcgact300tcgaataatccgtccatgtcgtcgagtcccagcgaagatctgccggagaggtccacgggc360tccggcggaaaaccgcccgagataccgaataaagttagaaagaaggggcaaaagcgaatc420cggcagccacgttttgcatttatgacgaagagtgaggttgatcatcttgaagatggctac480cgatggcgcaaatatggacagaaggccgtcaaaaatagtccatttcctaggagttactac540cgctgcacaaacagcagatgcaccgttaagaaaagggtggagcgctcgtcggaagatccc600actattgttataacaacatatgaaggtcaacactgtcatcacaccgttgggttcccccga660ggtggagtcattagtcatgaaacctttgctgggcagtttcatcctccggtctcacaattt720tattatccaactggcgctcctttacctcaagaaaatccttttattattacacagtctcag780caaataccaggtgaagctggtgatgaatcatcccgagcaatgccaggaccaactccacag840tttccttctaatgaaggtctacttggggacatcgtgcctcctaacatgcgtaacagatga900<210>5<211>3084<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5atggccgactatgttgttaatttcctggtagagtacttgtcccagcaactcgaaaaggaa60gcaaatttctttggtggaatggagggtcaagtcaagtcgctccatagagagcttagactg120ataaatatcttcctggagagctccatggagaaacggaatgagcatgcaatagtgaaggag180gtggtcggacagatcagggaggtggcttacgaggctgaggatgttatcgacatgttcata240ctcaaggttgcagagcacaggaggaggagcctgatggagaggatatttcttagccccaag300cacgcaatgatgcttcacgaagttggaaagaagattgcagacatcaagaatgcaatcaat360gaaatttacaacaatagagaaaggtatggcattgaaagagctacagagagtgtagatgcg420acggcggcggcggaggcactacacaagcgtaggagagaagtcgaggaagatgacgtggtg480ggcttcgttgatgactcaacgacactggtgaagcaacttactggagggagtcgtaagtgt540gatgccatttcgatcattggtatgggcgggttggggaagacaactcttgctagaaaaatc600tacaataatgttgacgtcaagagacactttcagtgccgtgcatgggtgtatgtatctcaa660gatttcaaaactagagagctcttgcttaaaattttgaaagagatgcaaatatcagatctg720tggaggacactagaagacatgggagtacaacaattaaaagagaagttgttcgaatgcttg780ctaagaaagaggtacctaatagtcatggacgacatctggaaaattgaagtctgggatgag840gtaagatctgcttttcccgatgacttgaatggaagcagaatattgatcaccagccgcata900acagaagtggcttcacatgcaagccttactcctccctactttctccgatttcttgacgaa960gatgaaagttggaaactctttattaagaaagtgttccgaggaggaacatgtcctcccgag1020ctgaaaactctggggagaaaaatcacagatgattgtcgtggcttaccactttccattgtg1080gtattagggggccttttagcaaacaaagagaagacaccccgaacatggtccaaattaatt1140ggcaaggtaaactggtaccttactgaggctaatacaatctgcaaagacatattggcctta1200agctacaccaacttgcctctacgcttgaaaccatgctttttgtattttggtgtataccca1260gaagaccatgagattgctgtaaggcaactgatccacctgtggacagctgagggattcata1320cagcacactggcaatagaagcgtagaggatgttgccgaagactacttggaggagctcatc1380gatcgaagcttgatacaagtggctaggcggaagatagatggaagcgtaaagacattccgt1440attcatgatcttctacgagacctctgcatatacgagagcaaggaagacaaatttcttgag1500ctactcagagatgacatctattcattcacgaacaaatctcgcagagtttccttgcatggt1560gatggtagctttcctctatacaatgttccaaacttccctgatcctccatgtgcccgttct1620ttgtttttctttagcgattacggatatgaataccgggatttgttcatcgaaaagttcaag1680ctgattcgggtgcttaatttcgagcgtacaatccactcccttcccaaaagcatagaaaca1740atgatccacttgaggtacttgaggataaatttaccttctacagaaagggttattcctgat1800tccattggtaaccttacgaatctggaaacacttttcatagagggtagaacagttggatcg1860tatgtttcgataaccgggatatttaagctacaacgtttaagcaatctgtatctggaaaca1920atcctgtcgttgttgccttaccatttggatgaagctctgcggaacctccaagtcctttcc1980accgcaacactttgctttgatgtagaggaaacttttcctgtcgcactcaacaagtttcct2040tgtgtaagggaactaggaatacgatatttttccacgagggattttaattgtgagggtgaa2100agcaaagcagaagattatttgaagggcctccaccatttacgttatcttcaaatactgagc2160atcgagcgtttcccaatgcttcctaatgatttgaattcatttccattgacaatcaccaaa2220ctaactttatacgacgttcggttcagaggcggtggcggcatgacagtgctcggaaacctt2280cccaatcttcggatactgaaaataaaattttgcagcgatatttttgatctgcaaatcttt2340ggagattcatttcctcaactcgaagtccttaaattgcaatggttgggacaagttaaagaa2400tggaaacaagagagaagtgcaatgccatgccttagatatttggttatcaaacattgcgat2460ggtttgactatgctccctccggaactatggagtttgactgccttgcaaaaggtggaggtg2520ttacaacccaactcagaattggcacacatgcttcaggaattggagatgaaggttaactgt2580atactttcgctggctgaaatcgcactttgtacttttgattttgatcacaggagtatggga2640ctcattgaagtatcgcggatgcagacggaacttcagaagcagttccatggagaacaggag2700atgatgttagagacacagagaaagatggaagatgacaggatgaaggccgccgcatctaac2760ctagatgatccttctgctctactatcaaatgcagtgcttccatcctctgctgatgacaaa2820tcagtaatcttgaaaccggatcaagaaaaaaccggacctggagctagtaattccaacacc2880atagctgaaggcggtcctgggacaagattaggaaatgaaaggcacaaattaccggggatt2940ggggactgggtgaaggtgattctaatgctccaccgaggaaacgagcaagagcagatcaaa3000catcaacatcatcaactaaatctgcatctgaatgaaatcttatttataccatggcatttt3060tcctcccccaagttgacagggtag3084<210>6<211>2838<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6atggctgaaattgtagtaacctatgtcctcaacaatctgacgagcctgatgcaagaagag60gtgcaactattgaagggggtgaaggaagcagctgattcaatcgcagacgaactggaaaac120atcaaggccttcctaagagctgcggatgaaatggaagagaggactcctcaactcgatgtg180tgggttaagcaagtgagagatgtagcctatgaaatcgaagatgctcttgacgagtacagg240cttcgcctcaatcctcatactgggcattatttacacgcctctcttgctaaaattgttccc300ttcataaagaatttgatagcccgccatcagattggttcagaaatcctacgcatcagatcc360agattcgcaagtatttcagaaggccaacagagattcaagagcgaaactaatctacttgac420tccaagattgccacccagacatggcgtgaccgtcgacaggacggcctgcttctagaagaa480gccgatctggtcggcatcgaaaagcccaaaaagcagctcatcagctggcttatccaggcc540gacaccggacgggaactggtttcggtggtcggaatgggtgggttggggaagaccaccttg600gtcaaaaaagtctacgatgatgcacaagtgaagctacatttccaataccgtacatggtta660tttgtttctcaatcttttaaaatggaagatctcctaaaagacatgcttcagcaactgtac720aaggtaaaaaggaagccagttcctcaaggagtcggcagcatgagcaacgatcagctaaga780acgaaaatcaaaagctttttgcaacaaaagaggtacctgattgtgttagacgacgtgtgg840catattgacgattgggatgcgatcaaatacgcattcccaaacaacgatggcagccgagta900atgctcacaactcgcaactctgaaatcgcctctgcctcctgcaaggacttcaacggtaaa960gtccatactttaaagcctctggcttttgaagagtcctggactttattttgtaggaagact1020tttggggacaacaattgccctccagatttgaagactcttacagaaaacattcttagaaga1080tgcgaaggattgccgcttgcaattgttgcgctcagtggtgttttggcgaccaaggacaga1140atagagcaatgggatttgattcaacggtgtcttgccgatgagctcgaagaaaatgttaga1200ctcaatagcatggggaaaattttgtcgctcagttataatgatttgccttactatctcaag1260tcctgttttctgtattttagcgtctttcctgaaaatcgtgtaatcgaccaaatgagactg1320attcggttatgggtggcggaaggatttgttaaagaaaaggaaggaaagacgttggaagaa1380gtcgcagagggttacctgtacgagctctttaacagaagcctgattcaagtggcggagaca1440accagtgaagggaggatcaaaacatgccgcatccatgacctgcttcgtgagattatcatt1500tccaaatcaagagatcagaatttcgtcacagtcgctcgaggccaaaacatgatttggccg1560gaaaaagttcgtcgcctatcaatacaaaaaaccaaacaggatgtgcaggaaaaccagagc1620atctctcggcttcgttctttgctcatgtttcggagagtcgatccgctgtctgaatattcc1680aagtccatttcatttcctctcaattttaggctgcttaaagtgttggatttgcgaggtgcg1740actctagagatatttccaaacgagatcgtcaagctactgctcctgaaatatctaagcttg1800agggccacaaagatcaaaacaattccaagctcaatcaagaatctgcagaacctggagacg1860ttggatcttaaacactcttacgtcactgcattgcctgtcgagatctcgcaacttcagaaa1920cttcgccacctcttggtttatcggtacgaaatagattcttatgcacgcataaattccaaa1980tacggtttcaaggcgatgccgcaattaggaaatctccggttcttgcaaaagctctgcttc2040atagaggcggatcacggcggcaacgagctaatgaaagagctcggaaggctgaatcagctc2100cggcggctaagcattgtgaagttcagtagagaaaatggggtttccctctgctcttccatt2160gaaaacctaacaaacctccgctctctgtctataacttcaacagaagaggacgagataatc2220gatctcggaaacctctcttccccgccgccatttcttcaacggctatacctgaccggacgg2280ttagagaagttaccgcactggattccttctctccggagtttggcgaaggtgtctttgaaa2340tggagccaattgagggacgatcatgacccgcttcaatcgcttcaagatttgcccaatctt2400gtgcatcttgaatttctacaggcttacgtgggagacacgttgcgttttaaggccgaggga2460tttcaaaagctgaaggttttgggcctcgaaaacatggatggactgaaaacagtaacggtg2520gaaatgggagcgatgcctctccttgaaaagctcatcctccagcggtgcaaattgttgctg2580aggctgccatctggcattgaacacctcagcaagctgaaactgctggaattttttgacatg2640ccttttgagttaatcatgacattacgtccggacaaagaaggtggggatggggattattgg2700aaggttgaaaatgtgcccgaaattaactctatatattggagagatggtggttgggacgtg2760tactcgttggagagatcgatagaaggaggagagggttcggcccctactagaagacatgaa2820cttccttattggaaatag2838当前第1页12