表达基因VII型新城疫病毒融合蛋白的重组火鸡疱疹病毒候选疫苗株及制备方法与流程

本发明属于基因工程疫苗技术领域，具体涉及一种表达基因vii型鸡新城疫病毒融合蛋白的重组火鸡疱疹病毒构建方法及构建的重组病毒。

背景技术：

新城疫(newcastledisease，nd)是由新城疫病毒(newcastlediseasevirus，ndv)引起的禽类急性、烈性、高度接触性传染病。ndv为有囊膜的单股、不分节段、负链rna病毒，基因组为3'-np-p-m-f-hn-l-5'，依次编码核衣壳蛋白(np)、磷蛋白(p)、基质蛋白(m)、融合蛋白(f)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(hn)和大蛋白(l)。另外，在p基因转录的过程中可出现rna编辑，产生非结构蛋白v和w。f蛋白位于病毒的囊膜上，是病毒的主要结构蛋白，能够诱导机体产生中和抗体。ndv毒力差异的分子基础主要决定于f蛋白前体(f0)的蛋白酶裂解位点(112-117位氨基酸)的氨基酸序列，不同类型毒株的氨基酸序列有很大差异，强毒株是¹¹²r/k-r-q-k/r-r-f¹¹⁷，弱毒株是¹¹²g/e-k/r-q-g/e-r-l¹¹⁷。

ndv只有一个血清型，但基因型较多，根据ndv特定的酶切图谱和f基因核苷酸同源性序列的特征，可将ndv分成classi和classii两类。classi类基因组全长15198bp，可进一步分为9个基因型(1-9型)，是从野生的水禽或者从活禽交易市场分离的，分离株一般均为弱毒株；classii类基因组全长是15186bp或者15192bp，目前国内外学者将classii类划分为15种基因型(i-xv)，是从家禽和野鸟中分离到的毒株，分离毒株有弱毒株和强毒株。自从20世纪90年代中期以来，我国nd的流行的优势基因型主要是基因vii型ndv毒株。

火鸡疱疹病毒(hvt)fc126株在抗原性上与马立克氏病毒(mdv)相近，常用于鸡马立克氏病(md)的预防。由于hvt的基因组含有较多可供外源基因插入的复制非必需区，同时又可以冻干保存，常作为禽用重组病毒疫苗的载体。近年来，在我国流行的ndv强毒株主要是基因vii型，而广泛使用的lasota疫苗毒株是基因ii型。虽然lasota疫苗对基因vii型ndv毒株可提供良好的临床保护，但是并不能有效阻止感染禽的排毒。因此，以hvt为载体研制与ndv流行毒株基因型相匹配的重组疫苗对于nd的防控具有重要意义。

目前，已经有一些关于以hvt为载体表达ndvf蛋白的重组病毒的构建。克里斯迪等将ndvf蛋白重组到hvt复制非必需的ul45-ul46之间，构建表达ndvf蛋白的重组病毒；而法国诗华公司将f基因插入到hvt复制非必需ul45-ul46区，构建重组病毒rhvt-nd-ibd；verstegen以hvt为载体构建共表达ndv克隆-30弱毒株f蛋白和ibdvvp2蛋白的重组病毒；毕建敏将viid亚型ndvf基因裂解位点的氨基酸突变为弱毒株，然后将其插入到hvt复制非必需ul55区，构建重组病毒rhvt-gb-ndvf；毕建敏等将ndvf基因插入到hvt复制非必需的us10和sorf3区，构建表达ndvf蛋白的重组病毒；李永清等基于hvt的细菌人工染色体(bac)，将ndvf基因插入到hvt复制非必需的us1和us10区，构建重组病毒rhvt-vp2-f。本研究以hvt的us2复制非必需区作为外源基因的插入位点，分别构建了表达基因vii型ndv完整f蛋白的重组病毒和表达缺失跨膜区的基因vii型ndvf蛋白的重组病毒。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种表达基因vii型新城疫病毒融合蛋白的重组火鸡疱疹病毒候选疫苗株。

本发明所述的表达基因vii型新城疫病毒融合蛋白的重组火鸡疱疹病毒候选疫苗株，命名为rhvt-ndv-vii-f，它的保藏号是cctccno:v201904。

本发明还提供了所述rhvt-ndv-vii-f的制备方法，包括以下步骤：

(1)以基因vii型ndvdt2014毒株基因组为模板，采用rt-pcr扩增如seqno.1所示的f基因；将f基因插入至真核表达载体-m3中，再经pcr扩增含cmv启动子、tkploya终止子和flag标签的f基因表达盒；

(2)将f基因表达盒克隆到中间质粒pfr，构建转移载体pfr-f；

(3)将pfr-f与rhvt-egfp基因组dna共转染cef，拯救出重组病毒rhvt-ndv-vii-f。

本发明试验过程中，以基因vii型ndvdt2014毒株基因组为模板，采用rt-pcr扩增f基因(seqno.1)。将f基因插入至真核表达载体-m3中，再经pcr扩增含cmv启动子、tkploya终止子和flag标签的f基因表达盒。将f基因表达盒克隆到中间质粒pfr(吴艳涛，等.一种表达h9亚型禽流感病毒ha基因的重组火鸡疱疹病毒株.专利申请号：cn201710517830.5，申请公布号：cn107142280a)，构建转移载体pfr-f。对f基因的跨膜区进行分析，显示f蛋白含有两个跨膜区，分别位于117-139和502-525位氨基酸的位置；以pfr-f为模板，采用重叠延伸pcr的方法分别对两个跨膜区进行缺失，构建缺失跨膜区的转移载体pfr-δf。分别将pfr-f和pfr-δf与rhvt-egfp基因组dna共转染cef，拯救出两株重组病毒rhvt-ndv-vii-f和rhvt-ndv-vii-δf。进一步根据spf鸡免疫保护效力试验优选出重组病毒rhvt-ndv-vii-f作为候选疫苗株。

本发明提供了一种表达基因vii型鸡新城疫病毒融合蛋白的重组火鸡疱疹病毒构建方法，以及利用该方法构建的两株组病毒rhvt-ndv-vii-f和rhvt-ndv-vii-δf，两株重组病毒分别携带在cmv启动子序列控制下的ndv完整f基因(seqno.1)和缺失跨膜区编码序列的f基因△f(seqno.2)的表达盒。

本发明研制的两株重组病毒均表达基因vii型ndvf蛋白，与当前国内流行的ndv野毒株基因型完全匹配，根据spf鸡免疫保护效力试验，优选出rhvt-ndv-vii-f株作为用于预防ndv感染的基因工程疫苗候选株。

本发明研制的重组病毒表达的ndvf蛋白在其c端带有flag标签，方便重组病毒的鉴定。

附图说明

图1：转移载体pfr-f构建流程图。

图2：ndvf基因跨膜区缺失示意图。

图3：转移载体pfr-f和pfr-△f表达盒的酶切电泳图(m：dl10000dnamarker；泳道1：转移载体pfr-△f酶切后目的条带；泳道2：转移载体pfr-f酶切后的目的条带)。

图4：转移载体pfr-f和pfr-△f瞬时转染cef后western-blot试验鉴定f蛋白表达图(m：蛋白marker；泳道1：转移载体pfr-f，a是f蛋白条带，b是f蛋白裂解后f1条带；泳道2：转移载体pfr-△f，c是缺失跨膜区f蛋白条带)。

图5：转移载体pfr-f和pfr-△f瞬时转cef后ifa试验鉴定f蛋白表达图(a：转移载体pfr-△f；b：转移载体pfr-f；c：293t细胞阴性对照)。

图6：重组病毒构建流程图。

图7：pcr鉴定重组病毒rhvt-ndv-vii-f和rhvt-ndv-vii-δf目的基因插入电泳图(m：dl10000dnamarker；泳道1：缺失跨膜区f基因pcr产物；泳道2：f基因pcr产物)。

图8：pcr鉴定重组病毒rhvt-ndv-vii-f和rhvt-ndv-vii-δf目的基因表达盒插入电泳图(m：dl10000dnamarker；泳道1：缺失跨膜区f基因表达盒pcr产物；泳道2：f基因表达盒pcr产物)。

图9：ifa试验鉴定重组病毒rhvt-ndv-vii-f和rhvt-ndv-vii-δf目的蛋白表达图(a：重组病毒rhvt-ndv-vii-δf；b：重组病毒rhvt-ndv-vii-f；c：hvt阴性对照)。

图10：western-blot试验鉴定重组病毒rhvt-ndv-vii-f和rhvt-ndv-vii-δf目的蛋白表达图(m：蛋白marker；泳道1：重组病毒rhvt-ndv-vii-f，a是f蛋白条带，b是f蛋白裂解后f1条带；泳道2：重组病毒rhvt-ndv-vii-δfc是缺失跨膜区f蛋白条带)。

图11：hvt亲本毒和重组病毒rhvt-ndv-vii-f和rhvt-ndv-vii-δf在cef上的生长曲线图。

图12：重组病毒rhvt-ndv-vii-f和rhvt-ndv-vii-δf攻毒后3天呼吸道排毒检测结果统计图。

图13：重组病毒rhvt-ndv-vii-f和rhvt-ndv-vii-δf攻毒后3天消化道排毒检测结果统计图。

图14：攻毒后试验鸡生存曲线图。

重组病毒rhvt-ndv-vii-f于2019年1月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国武汉大学。保藏编号：cctccno:v201904；分类命名为：重组火鸡疱疹病毒rhvt-ndv-vii-f。

重组病毒rhvt-ndv-vii-δf于2018年12月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国武汉大学。保藏编号：cctccno:v201872；分类命名为：重组火鸡疱疹病毒rhvt-ndv-vii-δf。

具体实施方式

下面将通过附图和具体实施方式对本发明做进一步的具体描述，但不能理解为是对本发明保护范围的限定。

实施例一：转移载体pfr-f和pfr-δf的构建

1、新城疫病毒株(dt-2014)f基因的克隆与鉴定

1.1引物设计

参照基因vii型新城疫病毒dt-2014株f基因的序列(genbank登录号：mn125616；seqno.1)，用primer5.0软件设计一对特异性的引物，其中上游引物包含kozak序列，下游引物去掉终止密码子。引物序列如下：

ndf-f(seqno.3):5'-gccaccatgggctccaaactttctacc-3'

ndf-r(seqno.4):5'-tgctcttgtagtggctctcatct-3'

1.2中间质粒pm3-f的构建

取基因vii型ndvdt-2014株无菌尿囊200μl，提取rna，以ndf-f/ndf-r为引物，进行rt-pcr，反应结束后进行1％琼脂糖凝胶电泳，胶回收f基因的条带，回收的产物与-m3(北京全式金生物技术有限公司)载体连接，以通用引物cmv-pa-f(seqno.5)和ndf-r(seqno.4)为引物进行菌液pcr鉴定。鉴定正确的阳性菌液送至安徽通用公司测序。测序正确的菌液，扩菌并提取质粒，质粒命名为pm3-f。

2、转移载体pfr-f的构建

2.1引物设计

参照真核表达载体-m3序列，使用premier5.0软件设计一对扩增表达盒的特异性引物。f基因克隆到真核表达载体-m3上，经pcr扩增后而获得f基因表达盒的序列。表达盒由巨细胞病毒早期启动子(cmv)、f基因、tkpolya三部分组成。设计引物送南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

引物序列如下：

2.2f基因表达盒的pcr扩增

将质粒pm3-f按照1:1000倍稀释后作为模板，以cmv-pa-f(seqno.5)和cmv-pa-r(seqno.6)为引物，pcr扩增f基因表达盒，反应结束后进行1％琼脂糖凝胶电泳，胶回收2700bp的f基因表达盒条带，回收产物放置-20℃保存备用。

2.3中间质粒pcmv-f的构建

胶回收的f基因的表达盒产物与-blunt(北京全式金生物技术有限公司)克隆载体连接，用通用引物m13f(seqno.7)和m13r(seqno.8)对菌液进行pcr鉴定。鉴定正确的菌液送安徽通用公司测序。构建的质粒命名为pcmv-f，并于-20℃保存备用。

m13f(seqno.7)：gtaaaacgacggccagt

m13r(seqno.8)：caggaaacagctatgac

2.4转移载体pfr-f的构建

质粒pfr和pcmv-f用noti、avrii进行双酶切。1％凝胶电泳后，胶回收noti-ndv-f-avrii片段和noti-pfr-avrii片段，回收后的片段用t4连接酶进行连接，构建转移载体pfr-f的流程如图1所示。

2.5转移载体pfr-δf的构建

2.5.1预测分析f基因的跨膜区

对f基因的跨膜区进行预测分析，f基因显示有两个跨膜区，分别位于117-139和502-525位氨基酸的位置，然后设计两对引物对跨膜区分别进行缺失。

2.5.2中间质粒pfr-δf1的构建

依据跨膜区117-139位氨基酸所在的位置，跨膜区缺失引物序列如下：

以pfr-f(1:1000倍稀释)为模板进行重叠延伸pcr扩增，取pcr产物5μl1％琼脂糖凝胶电泳，鉴定目的条带正确后，2μldpni酶对剩余的pcr产物37℃降解1.5h。pcr降解后的产物直接转化dmt感受态细胞，冰上静置30min，42℃热激45s，冰浴2min，加入无抗lb37℃摇菌培养1h，在含有氨苄抗性的固体平板上培养生长12h，挑取单克隆菌落，以cmv-pa-f和cmv-pa-r为引物菌液pcr鉴定正确的目的条带送测序，并提取质粒，命名pfr-δf1

2.6转移载体pfr-δf的构建

依据跨膜区502-525位氨基酸所在的位置，跨膜区缺失引物设计如下：

以pfr-δf1(1:1000倍稀释)为模板用以上引物进行重叠延伸pcr扩增，具体方法同上，以cmv-pa-f和cmv-pa-r为引物菌液pcr鉴定目的条带正确送测序，并提取质粒，构建转移载体pfr-δf的流程如图2所示。

2.7转移载体pfr-f和pfr-δf的鉴定

2.7.1酶切鉴定

将转移载体pfr-f和pfr-δf用限制性内切酶noti、avrii进行双酶切，37℃酶切1.5h。经1％凝胶电泳后，pfr-f可见到约2700bp的f基因表达盒条带和5800bp的载体条带，pfr-δf可见到约2600bp的缺失跨膜区f基因表达盒条带和5800bp的载体条带，如图3所示。

2.7.2western-blot试验鉴定

将转移载体pfr-f和pfr-δf瞬时转染293t细胞，继续培养24h后收集细胞，制备蛋白样品。western-blot试验鉴定f蛋白表达，以flag标签单抗作为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体为二抗，用增强型化学发光法(ecl)显色，观察蛋白条带，如图4所示。2.4.3间接免疫荧光试验(ifa)鉴定

转移载体pfr-f和pfr-δf瞬时转染于铺有293t细胞的48孔板中，24h后进行间接免疫荧光试验，其中以基因vii型ndv的阳性血清为一抗，异硫氰酸荧光素标记羊抗鸡抗体为二抗，荧光显微镜下观察转染细胞的荧光情况，如图5所示。

实施例二：重组病毒rhvt-ndv-vii-f和rhvt-ndv-vii-δf的拯救与纯化

1、重组病毒rhvt-egfp的扩大培养

重组病毒rhvt-egfp由扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室保存并提供(吴艳涛，等.一种表达h9亚型禽流感病毒ha基因的重组火鸡疱疹病毒株.专利申请号：cn201710517830.5，申请公布号：cn107142280a)。复苏保存于液氮中的重组病毒rhvt-egfp，用含5％类胎牛血清的m199培养基10倍倍比稀释复苏的细胞病毒液。制备次代cef铺到6孔细胞培养板中，培养2h后接种倍稀释的病毒液，每孔900μl，置于细胞培养箱中培养，24h后弃去培养液，加入45℃预热的1％琼脂培养液，静置10min，等琼脂培养液凝固后，倒置放入细胞培养箱中培养3-5d。在荧光显微镜下观察并标记纯的绿色荧光蚀斑，用20μl0.25％的胰酶滴加到标记的病毒蚀斑上，用枪头反复吸打直至蚀斑被完全消化。吸出病毒液再用有限稀释法10倍倍比稀释。制备次代cef铺到96孔细胞培养板中，每个蚀斑设置三个稀释度，接种100μl于96孔细胞培养板中培养3-5d。显微镜下观察挑选一个孔中只有一个且全部带荧光的蚀斑，并扩大培养。

2、rhvt-egfp重组病毒的基因组的提取

(1)弃去维持液，pbs清洗三次，每瓶t-75细胞瓶中加入5mlpk裂解液(200mmtris-hcl，ph8.0；10％sds；1.5mnacl；0.5mmedta，ph8.0；1mg的pk)，作用10min，将细胞吸出加入到50ml离心管中，37℃温箱裂解1.5h；

(2)向裂解后的细胞中加入1/2体积的平衡酚，轻轻颠倒混匀，使蛋白变性；再加入1/2体积的氯仿/异戊醇(24:1)溶液，轻轻颠倒混匀，8000r/min离心15min；

(3)将上层的水相吸到新的离心管中，再加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)溶液进行抽提，8000r/min离心15min；

(4)重复步骤(3)3-4次，直至无杂蛋白抽出；吸取上层的水相至新离心管中，加入1/10体积的3m醋酸钠(ph5.2)轻轻混匀，再加入2倍体积预冷的无水乙醇，轻轻颠倒直至出现乳白色絮状成团的基因组为止，-20℃静置1h，5000r/min离心5min；

(5)轻轻的把上清倒掉，加入提前预冷的70％乙醇5ml清洗基因组，5000r/min离心5min，弃去上清，瞬离并吸干上清。

(6)将基因组溶解于te缓冲液(ph8.0)中，4℃保存备用。

3、重组病毒rhvt-ndv-vii-f和rhvt-ndv-vii-δf的拯救与纯化

线性化的转移载体pfr-f和pfr-δf分别与rhvt-egfp基因组dna用磷酸钙共沉淀的方法共转染cef细胞，同源重组的技术原理如图6所示。配制转染体系，超净台中静置30min。静置结束后将上述体系用移液器轻轻吹吸混匀，加入到60mm的培养皿中。然后放置37℃、5％co2细胞培养箱中培养4h后进行休克。

配制甘油休克液，弃去培养皿中培养基，用不添加血清的m199培养基清洗细胞3次，加入已经配制的甘油休克液1ml并室温静置1min，再次用不添加的血清的m199培养基清洗3次，加入m199生长液，37℃、5％co2细胞培养箱中培养5-7d。荧光显微镜下观察挑取不带荧光的蚀斑或者部分不带有荧光的蚀斑，按有限稀释法在96孔细胞培养板中纯化病毒，直至某一孔中仅有一个蚀斑并且蚀斑不带荧光，纯化后的重组病毒命名为rhvt-ndv-vii-f和rhvt-ndv-vii-δf。

4、重组病毒rhvt-ndv-vii-f和rhvt-ndv-vii-δf的鉴定

4.1pcr鉴定重组病毒

将初步纯化的重组病毒rhvt-ndv-vii-f和rhvt-ndv-vii-δf分别接种在已经长满的单层cef细胞上，37℃，5％co2培养，待细胞病变达50％后，消化并收集病毒液，提取病毒dna。以此dna为模板，用cmv-pa-f(seqno.5)+cmv-pa-r(seqno.6)和ndf-f(seqno.3)+ndf-r(seqno.4)两对引物分别进行pcr鉴定，如图7和图8所示。并将其扩增产物送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。

4.2间接免疫荧光试验(ifa)鉴定重组病毒

将纯化后的重组病毒接种于已铺有次代cef细胞的96孔细胞板中，同时设置接种hvt亲本毒的cef细胞作为阴性对照。利用基因vii型新城疫病毒阳性血清作为一抗和异硫氰酸荧光素标记的羊抗鸡荧光抗体作为二抗进行间接免疫荧光试验。荧光显微镜下观察感染重组病毒的细胞孔可看到清晰的绿色荧光，被hvt感染的细胞未看到绿色荧光，如图9所示，证明重组病毒的f蛋白能够成功表达。

4.3western-blot试验鉴定重组病毒

将重组病毒接种于已经铺好的次代cef细胞的6孔板中，待90％的细胞出现病变后收获细胞并制备蛋白样品。用western-blot检测重组病毒能否表达ndvf蛋白。试验中以flag标签单抗作为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体为二抗，用增强型化学发光法(ecl)显色，结果显示，重组病毒rhvt-ndv-vii-f对应泳道可观察到两条特异性条带大小分别约55kda和60kda；重组病毒rhvt-ndv-vii-δf对应泳道可观察到一条特异性条带大小约60kda，如图10所示。

5、重组病毒在cef上的生长曲线

将2株重组病毒和亲本hvt分别以100pfu的剂量接种到铺有单层cef的6孔细胞培养板中，每个毒株接种6个孔，3株毒共计接种3个细胞培养板。37℃，5％co2条件下进行培养。分别在感染病毒后的0h、24h、48h、72h、84h和96h消化收集细胞。将收集的细胞置于2ml的ep管中用m199培养基定容至2ml，充分混匀后吸取100μl病毒液进行10倍的倍比稀释(共计8个稀释梯度)，分别接种到长有单层cef细胞的24孔板中，置37℃、5％co2培养箱培养4-5d进行蚀斑计数，测出每个时间点的病毒效价，利用graphpad软件绘制出重组病毒和亲本hvt在cef中的生长曲线，分析重组病毒在cef中的生长特性，如图11。

实施例三：重组病毒rhvt-ndv-vii-f和rhvt-ndv-vii-δf的免疫效力评价

1、重组病毒的免疫保护试验

试验设计共分为5个组，每组选取20只spf鸡，将所有试验鸡分组放于隔离器中饲养。重组病毒rhvt-ndv-vii-f免疫组和rhvt-ndv-vii-δf免疫组，在1日龄时颈部皮下注射相应的重组病毒，注射剂量为5000蚀斑形成单位。lasota疫苗免疫组则在鸡只7日龄时，接种1羽份的lasota疫苗；非免疫攻毒组于1日龄和7日龄分别接种pbs；同时设置不接种任何疫苗的空白对照组。除空白对照组外，其他各组在鸡只21日龄时，将ndv强毒株以10⁵eid50剂量用滴鼻点眼的方式进行攻毒。详见表1。

表1rhvt-ndv-vii-f和rhvt-ndv-vii-δf对ndv的免疫保护试验

2、排毒监测

攻毒后的第3天，从每个试验组随机挑选10只鸡，分别采集口咽和泄殖腔棉拭样品，提取样品中的rna并反转录为cdna，通过绝对荧光定量pcr方法检测各组的排毒情况。结果如图12和13所示，非免疫攻毒组口咽和泄殖腔棉拭样品中病毒cdna的拷贝数显著高于两株重组病毒免疫组(p<0.001)；重组病毒rhvt-ndv-vii-f免疫组口咽和泄殖腔棉拭样品病毒cdna的拷贝数显著低于lasota疫苗免疫组(p<0.001)；重组病毒rhvt-ndv-vii-δf免疫组口咽和泄殖腔棉拭样品中病毒cdna的拷贝数低于lasota疫苗免疫组(p<0.01)。综上所述，攻毒后两株重组病毒免疫组在呼吸道和消化道中的排毒量显著低于非免疫攻毒组。lasota疫苗免疫组检出的排毒量低于非免疫攻毒组而高于两株重组病毒免疫组，而重组病毒rhvt-ndv-vii-f免疫组的排毒量低于重组病毒rhvt-ndv-vii-δf免疫组

3、不同试验组在攻毒后的生存曲线和保护率

每天观察21日龄攻毒后的试验鸡群鸡只的状态，根据记录的试验鸡群死亡情况绘制生存曲线，如图14所示。表2统计数据显示，lasota疫苗免疫组可达90％的保护率；重组病毒rhvt-ndv-vii-f免疫组有40％的保护率。

表2各组鸡免疫后攻dt-2014毒株保护效力测定

根据免疫效力试验结果，重组病毒rhvt-ndv-vii-f对ndv强毒株dt-2014株可提供更好的免疫保护。

序列表

<110>扬州大学

<120>表达基因vii型新城疫病毒融合蛋白的重组火鸡疱疹病毒候选疫苗株及制备方法

<160>12

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1659

<212>dna

<213>新城疫病毒(newcastlediseasevirus)

<400>1

atgggctccaaactttctaccaggatcccagtacctctaatgctaatcactcggattatg60

ctgacattgagctgcatccgtctgacaagctctcttgacggcaggccccttgcagctgca120

ggaattgtagtaacgggagataaggcagtcaatgtatacacctcgtctcagacagggtca180

atcatagtcaagttgctcccgaatatgcccagagataaggaggcatgtgcaagagcccca240

ctggaggcatataacagaacactgactactctgctcactcctcttggtgactccatccgc300

aagatccaagggtctgtatccacgtccggaggaaggagacaaagacgttttataggtgct360

gttattggcagtgtagctcttggggttgcaacagcggcacagataacagcagctgcggcc420

ctgatacaagccaaacagaatgccgccaacatcctccggcttaaggagagcattgctgca480

accaatgaagctgtgcatgaagtcaccgacggattatcacaactatcagtggcagttggg540

aagatgcagcagtttgtcaatgaccagtttaataatacggcgcgagaattggactgcata600

aaaatcacacaacaggtcggtgtagaactcaacctatacctaactgaattaactacagta660

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ttagctggtggcaatatggactacttattaactaagttaggtataggaaacaatcaactc780

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tcctgtttgagcggcaacacatcagcctgcatgtattcaaagactgaaggcgcactcact1140

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agacattcgtgtaatgtcttatcgttagacggaataactctgaggctcagtggggaattt1320

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cttgatatatcaactgaacttggaaacgtcaacaattcaatcagcaatgccttggatagg1440

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