一种表达抗原识别区域的通用型细胞治疗产品及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，涉及一种表达抗原识别区域的通用型细胞治疗产品及其制备方法和应用。

背景技术：

嵌合抗原受体t细胞(chimericantigenreceptortcells，cart)是通过基因修饰的手段，使能够特异性识别靶抗原的单克隆抗体的单链可变区(scfv)表达在t细胞表面，同时scfv通过跨膜区与人工设计的t细胞胞内的活化增殖信号阈相耦连。因此，单克隆抗体对靶抗原的特异性识别与t细胞的功能相结合，产生特异性的杀伤作用，且cart能够以非mhc限制性的方式杀伤靶细胞。b细胞非霍奇金淋巴瘤(b-nhl)的肿瘤细胞表面稳定表达cd19分子，这就为免疫治疗提供了靶点。近年来，应用靶向cd19的嵌合抗原受体重组t细胞治疗b细胞急性淋巴细胞白血病(b-all)获得了重大进展，在临床上取得了颠覆性治疗效果。然而，cart的制备耗时较长，花费巨大。需要采集病人自体t细胞，在体外进行扩增，但白血病病人一般需多次化疗，因此t细胞数量少，质量差，甚至一些长期化疗病人的t细胞无法实现体外扩增。这就为cart的广泛应用设置了阻碍。此外，cart推广应用过程中还面临一项巨大挑战，即细胞因子释放综合症(crs)，也称细胞因子风暴。患者接受治疗后，在car分子的共刺激信号的作用下，t细胞大量扩增，并释放大量细胞因子，这些炎症介质引起炎性反应致组织损伤，甚至引起死亡。患者甚至会出现高热，低血压，心动过速，心功能不全，肝衰竭等危及生命的症状。神经毒性也是cart治疗过程中的另一大安全隐患。cart治疗后引发的神经系统症状，如：神经错乱，表达性失语，肌痉挛，癫痫发作等，被认为和细胞因子水平急剧增高有关。

cart治疗肿瘤的原理是利用嵌合抗原受体t细胞特异性识别肿瘤相关抗原靶点，经信号传递至胞内引起t细胞激活和增殖以有效杀伤肿瘤细胞。虽然t细胞在cart疗法中发挥关键作用，但也正是限制cart广泛应用和引发诸多不良反应的原因所在。

目前还未见针对白血病的表达抗原识别区域的通用型细胞治疗产品。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供针对白血病的表达抗原识别区域的通用型细胞治疗产品。

第一方面，本发明提供了一种表达抗原识别区域的细胞，所述表达抗原识别区域的细胞是以淋巴细胞、髓系细胞或间充质干细胞为本体细胞，在所述本体细胞的表面表达能够特异性识别白血病细胞表面抗原的抗体，且不表达免疫细胞的共刺激信号。

作为一种优选的实施方案，所述白血病选自急性淋巴性白血病、慢性淋巴性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、多毛细胞性白血病、t细胞淋巴细胞白血病、大颗粒淋巴细胞性白血病和成人t细胞白血病。

作为另一优选的实施方案，所述白血病细胞表面抗原为cd抗原。

作为另一优选的实施方案，所述cd抗原选自cd19、cd20、cd33、cd52、cd45、cd22、cd25、cd7、cd2、cd3、cd79a、cd79b、cd133和cd13。

作为另一优选的实施方案，所述抗体选自scfv、fab、vhh和单克隆抗体。

作为另一优选的实施方案，所述表达抗原识别区域的细胞其制备方法为：构建表达所述抗体的重组表达载体，然后将所述重组表达载体导入所述本体细胞。

作为另一优选的实施方案，表达所述抗体的核苷酸序列如seqidno：3所示。

第二方面，本发明提供了所述的表达抗原识别区域的细胞在制备治疗白血病的药物中的应用。

第三方面，本发明提供了一种制剂，所述制剂含有所述的表达抗原识别区域的细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

第四方面，本发明提供了所述的表达抗原识别区域的细胞的制备方法，所述制备方法为：构建表达所述抗体的重组表达载体，然后将所述重组表达载体导入所述本体细胞。

本发明优点在于：

本发明提供了一种通用型细胞产品及利用该通用型细胞产品治疗白血病的新策略，即在不具有hla限制的通用细胞上携带针对肿瘤细胞抗原的抗原识别区域，治疗后该抗原被降解，肿瘤细胞发生一系列改变，直至死亡，进而能起到治疗白血病的作用。

cart治疗原理在于识别肿瘤细胞和激活效应t细胞杀伤肿瘤。

间充质干细胞(mesenchymalstemcells，mscs)是一类来源于中胚层和神经外胚层且不表达造血系相关标志的具有多项分化潜能的成体多能干细胞，在肺及呼吸系统疾病、心血管疾病、神经系统疾病、自身免疫性疾病以及再生医学与组织工程等方面都有较为广泛的研究和应用。mscs与肿瘤的关系也有较多的研究。目前研究表明，mscs对肿瘤可能存在抑制或促进生长两种作用，mscs对肿瘤生物学行为的促进或抑制作用可能是多种因素综合作用的结果。但目前关于mscs作用于肿瘤的机制研究并不充分，具有较大的复杂性和不确定性。

本发明的治疗方法与cart治疗或mscs治疗相比，有着本质上的不同。

实验证实，本发明的表达抗原识别区域的通用型细胞与肿瘤细胞在体内接触后，肿瘤细胞的靶抗原完全消失，进一步导致肿瘤细胞自发凋亡，显著抑制白血病模型小鼠肿瘤进展，治疗效果非常显著。

相比于cart治疗策略，本发明不仅能够减轻危重病人负担，缩短细胞制备周期，降低细胞制备及运输成本，造福更多白血病患者，而且本发明的抗原识别区域中无共刺激信号，效应细胞不会产生大量细胞因子，所以不会发生细胞因子风暴，也不具有神经毒性，因此在未来的临床使用中更安全可靠。

本方案可针对不同肿瘤抗原靶点，因此可以广泛应用于不同肿瘤的治疗。本发明可使用的通用型细胞种类繁多，包括淋巴细胞、髓系细胞和间充质干细胞，还可使用其他通用细胞类型。因此本发明为后续研究奠定了基础，为大范围临床使用带来了希望，具有科研及临床双重指导意义。

附图说明

附图1是cd19car-jurkat，cd133car-jurkat，scfv-jurkat，scfv-k562，scfv-msc细胞示意图。

附图2是靶细胞sem，reh和效应细胞cd19car-jurkat，cd133car-jurkat，scfv-jurkat，scfv-k562，scfv-msc共培养不同时间后cd19的表达。

附图3是靶细胞reh，sem和效应细胞scfv-k562共培养24h后，cd19-pi3k-akt-cmyc信号通路变化。

附图4是cd19-pi3k-akt-cmyc信号通路示意图。

附图5是靶细胞sem，reh和效应细胞scfv-jurkat，scfv-k562，scfv-msc共培养不同时间后，靶细胞凋亡情况。

附图6是效应细胞scfv-msc的体内治疗效果。

附图7是pcdh-mcs-t2a-copgfp-mscv病毒载体图谱。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1

1细胞制备

本发明根据ctl019序列，设计cd19car和cd19抗原识别区域，从可以分泌特异识别cd133的igg1单抗ac133的杂交瘤细胞株hb-12346中获得编码该抗体可变区重链(vh)和轻链(vl)的cdna序列，拼接合成能够结合cd133抗原识别区域，引入膜定位信号(cd8leader)，铰链区(cd8hinge)，跨膜区(cd8transmenber)，共刺激信号(cd28，4-1bb，cd3-zata)(序列见表1)。委托生工生物工程(上海)有限公司合成整个表达框，经pcr扩增，引入酶切位点ecori和bamhi，酶切后插入pcdh-mcs-t2a-copgfp-mscv病毒载体(图7，购于systembiosciences，货号为cd523a-1)ecori-bamhi位点之间，经测序正确后，使用promega公司质粒提取试剂盒提取质粒。慢病毒包装：使用pspax2，pmd2g病毒包装系统，lenti-x细胞，用cacl2转染试剂进行转染，收获病毒后，进行纯化。细胞株的遗传修饰：获得的病毒侵染jurkate6.1，k562及原代间充质干细胞msc，获得稳转细胞株：cd19car-jurkat，cd133car-jurkat，scfv-jurkat，scfv-k562，scfv-msc。示意图如图1所示。

表1

2westernblot检测效应细胞和靶细胞共培养后cd19，cd133抗原表达情况

效应细胞：cd19car-jurkat，cd133car-jurkat，scfv-jurkat，scfv-k562，scfv-msc，各1×10⁶，分别和靶细胞：reh或sem(all细胞系)以1:1共培养于12孔板中，同时设置对照组，即jurkat，k562，msc分别和靶细胞以1:1的比例共培养。每种效应细胞和靶细胞37摄氏度分别孵育0h，2h，4h，6h，8h后，收集细胞于1.5mlep管中，制备蛋白裂解液。scfv-msc和靶细胞分别共培养0h，12h，24h，36h，48h，收集细胞于1.5mlep管中，制备蛋白裂解液。westernblot检测cd19，cd133表达情况和内参gapdh表达(cd19抗体购于abclonal公司，货号：a2577；cd133抗体购于santacruz公司，货号：30220；gapdh抗体购于sigma公司，货号：g8795)。结果如图2所示，效应细胞和靶细胞共培养后，靶细胞表面的cd19逐渐降低，直至完全消失，说明all细胞在cd19-scfv的作用下会出现cd19抗原逃逸的现象，且cd19抗原被彻底降解，此结果必然导致靶细胞出现分子层面的变化；此外cd133car-jurkat细胞导致sem细胞表面的cd133抗原消失，说明抗原在抗原识别区域的作用下，发生逃逸后降解是一个广泛存在的现象。可针对此类抗原，研发新的治疗方案，致力于突破cart使用过程中局限。

3westernblot检测scfv-k562和reh，sem共培养后cd19下游信号通路变化

效应细胞scfv-k562和靶细胞reh，sem，各1×10⁶，以1:1共培养于12孔板中，同时设置对照组，即k562和靶细胞以1:1的比例共培养，24h后收集细胞于1.5mlep管中，制备蛋白裂解液。检测cd19-pi3k-akt-cmyc信号通路的蛋白表达情况(pi3k抗体购于cst公司，货号：4249；akt和p-akt抗体购于cst公司，货号：4685和4060；c-myc抗体购于santacruz公司，货号：sc-40)。结果如图3所示，当cd19降解后，其下游pi3k，p-akt，c-myc表达都被下调。此前c-myc被报道与all白血病细胞的增殖存活密切相关，在c-myc被敲低后的all负瘤小鼠生存期显著提高，因此效应细胞和靶细胞共培养后，发生cd19降解的all细胞极可能会发生自发凋亡。

4annexin-v标记法检测scfv-jurkat，scfv-k562和scfv-msc细胞对reh，sem细胞的诱导凋亡作用

将效应细胞scfv-jurkat，scfv-k562，scfv-msc分别用celltraceyellow(thermofisher，c34567)标记，靶细胞reh，sem分别用cfse(sigma，21888)标记，以1:1共培养于24孔板中。24h，48h，72h和96h，取部分细胞，用50μlannexin-v(bd，550475)体系标记凋亡细胞，15min后加入200μlboundingburrer,上机检测。结果如图5所示，随天数增加，靶细胞reh，sem逐渐开始凋亡，说明cd19信号通路被抑制，导致下游c-myc消失，因为c-myc与all白血病细胞的存活，增殖密切相关，因此all白血病细胞自发走向凋亡。

5体内实验

1.5×10⁶的sem-gl细胞成瘤的nod/scid移植瘤小鼠，作为all白血病的研究模型，接种肿瘤细胞后第三天开始通过尾静脉注射的方式治疗，对照组1用pbs治疗，对照组2用1.5×10⁶的msc细胞治疗，实验组用1.5×10⁶的scfv-msc细胞治疗，每周治疗两次，共进行6次治疗。分别在第10，15，20，27天，进行活体成像，监测肿瘤细胞的分布及进展情况。结果如图6所示，scfv-msc细胞治疗组肿瘤进展情况明显缓于对照组，且msc细胞治疗组进展情况与对照组无差异，说明scfv-msc在体内能起到明显的治疗效果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

sequencelisting

<110>上海交通大学医学院附属瑞金医院

<120>一种表达抗原识别区域的通用型细胞治疗产品及其制备方法和应用

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