一种提高动物繁殖力的INH-GNIH双表达基因疫苗、其制备方法与应用与流程

文档序号：19723709发布日期：2020-01-18 03:09阅读：786来源：国知局

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高动物繁殖力的inh-gnih双表达基因疫苗、其制备方法与应用。

背景技术：

泡发育受多种激素的综合调控，既有促进其发育也有抑制其发育的；如促性腺激素、促性腺激素释放激素为促进卵泡发育的激素，，如卵泡抑制素(inhibin，inh)和促性腺激素释放抑制激素(gonadotropininhibitinghormone,gnih)等为抑制卵泡发育的激素。

卵泡抑制素(inh)是转化生长因子-β(tgf-β)家族成员，为分子量31～34kd的异二聚体糖蛋白，其由性腺分泌，通过α亚基(18kd)密切相关的β亚基两个中的一个(βa和βb，大约14kd)组成一种异二聚体糖蛋白激素。亚基α与βa或βb亚基通过二硫键连接，分别形成抑制素a和抑制素b。inh是下丘脑-垂体-性腺轴调控系统中重要的激素之一，通过负反馈调控机体fsh的合成和分泌，进而调控卵泡发育。inh免疫动物能够促进卵泡发育，且有剂量依赖关系。han等在2008年研究分别用10、50和100μg的pcis质粒以20天的间隔免疫大鼠3次，并用50μgpcdna3.1和100μl浓度为0.85％的盐水作对照，发现在第2次和第3次免疫后，试验组的平均成熟卵泡数比对照组多3.6和4.9个(p<0.05)，平均产仔数和胎盘数也显著提高。尤其是高剂量组(100μgpcis)的成熟卵泡数，明显高于其他试验组，能显著增加成熟卵泡数，但对卵巢大小和重量无影响。wang等在2012年研究分别用10、50、100μg/100μl的pcisi质粒免疫小鼠，并用100μgpcmv-s和100μl生理盐水作对照，发现免疫组小鼠的血浆fsh、雌二醇浓度均高于对照组(p<0.05)，且在高剂量组的效果最好(p<0.05)。与对照组相比，所有免疫组的卵巢重量(p<0.05)、长度和宽度(p>0.05)均有变化，特别是高剂量组的成熟卵泡数高于其他各组(p<0.05)，产仔数增加。mao等在2016年研究将120只鸡分为4组，用0、25、75或125μg的pcisi肌肉注射母鸡，20天后进行加强免疫。结果表明，各免疫组的优势卵泡和大白卵泡数均高于对照组(p<0.05)。特别是高剂量组，小黄卵泡数增加(p<0.05)，产蛋性能显著提高。

gnih是rf(精氨酸-苯丙氨酸)酰胺肽(rfrp)，其生物学作用主要抑制垂体前叶分泌fsh(促卵泡素)和lh(促黄体素)，与gnrh相反。gnih能抑制鸡和鹌鹑脑垂体释放lh和fsh。静脉给予rfrp-3可降低性腺切除雄性大鼠的外周血促性腺激素水平，抑制成年小鼠的睾丸类固醇激素生成和精子发生，绵羊lh的脉冲幅度，抑制lh和fsh分泌。此外，也有研究表明，gnih抑制鸡的卵泡发育和类固醇生成。以上研究提示，gnih可能直接或间接抑制卵泡发育和排卵。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种具有提高动物繁殖力作用的inh-gnih双表达基因疫苗的工程菌。本发明的另一个目的是提供一种非抗性筛选的抗抑制素和促性腺激素释放抑制激素的共表达质粒；该质粒可作为dna疫苗免疫动物，提高动物的繁殖能力，克服了一些技术难题。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案：

一种具有提高动物繁殖力作用的inh-gnih双表达基因疫苗的工程菌，该工程菌于2018年8月15日保藏在中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉)，分类命名为猪霍乱沙门氏菌，保藏编号：cctccno：m2018541。

由上述工程菌株制备的inh-gnih双表达基因疫苗工程菌，通过sds碱裂解法抽提即可得到inh-gnih双表达基因质粒(pvax-tpa-sinh-2a'-tpa-srfrp-asd质粒)。

一种提高动物繁殖力的inh-gnih双表达基因疫苗，其包括tpa-sinh基因和tpa-srfrp基因，所述tpa-sinh基因的序列如seqidno.1所示，所述tpa-srfrp基因的序列如seqidno.2所示。

如上所述的inh-gnih双表达基因疫苗，所述tpa-sinh基因和tpa-srfrp基因通过2a'肽进行连接，所述2a'肽的序列如seqidno.3所示，所述inh-gnih双表达基因疫苗的基因序列是seqidno.1、seqidno.3和seqidno.2所示序列依次连接。

一种如上所述提高动物繁殖力的inh-gnih双表达基因疫苗的制备方法，其包括如下步骤：

s1、将质粒pvax-tpa-sinh-asd和pvax-tpa-srfrp-asd进行pcr扩增，获得获得tpa-sinh、tpa-srfrp扩增产物片段；所述tpa-sinh扩增产物片段含如seqidno.1所示的序列，所述tpa-srfrp扩增产物片段含如seqidno.2所示的序列；

s2、将pvax-asd和tpa-srfrppcr扩增产物进行ecori和xhoi酶切，连接，获得质粒pvax-tpa-srfrp-asd；

s3、将pvax-tpa-srfrp-asd和tpa-sinhpcr产物进行bamhi和ecori酶切，连接，获得质粒pvax-tpa-sinh-tpa-srfrp-asd；

s4、2a'肽拼接头经上海生工合成并克隆于puc57载体上；其中，所述2a'肽含如seqidno.3所示的序列；

s5、将pvax-tpa-sinh-tpa-srfrp-asd和puc57-2a'-2a质粒进行ecori酶切，连接，获得质粒pvax-tpa-sinh-2a'-tpa-srfrp-asd。

s6.在步骤s1中，所述对质粒pvax-tpa-srfrp-asd进行pcr扩增的引物对如seqidno.4和seqidno.5所示。

s7.在步骤s1中，将质粒pvax-tpa-sinh-asd进行pcr扩增的引物对如seqidno.6和seqidno.7所示。

s8.在步骤s1中，所述对质粒pvax-tpa-srfrp-asd进行pcr扩增的引物对如seqidno.4和seqidno.5所示，将质粒pvax-tpa-sinh-asd进行pcr扩增的引物对如seqidno.6和seqidno.7所示。

如上所述的提高动物繁殖力的inh-gnih双表达基因疫苗或制备方法制备的疫苗在制备提高动物繁殖力药品中的应用。

本发明提供的重组质粒将自行制备的牛(bovine)源rfrp融合乙肝表面抗原与人组织纤溶酶信号肽基因pcr扩增，另将猪(swine)源inhα(1-32)融合乙肝表面抗原与人组织纤溶酶信号肽基因pcr扩增，2a'肽拼接头经上海生工合成并克隆于puc57载体上，对tpa-sinh和tpa-srfrppcr产物，puc57-2a'-2a质粒以及pvax-asd质粒进行酶切，连接至pvax-asd载体上，获得pvax-tpa-sinh-2a'-tpa-srfrp-asd双表达质粒，并将该质粒转化到沙门氏菌c500中，获得c500(pvax-tpa-sinh-2a'-tpa-srfrp-asd)，该工程菌株于2018年8月15日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号：cctccno：m2018541。

将含有提高动物繁殖力的inh-gnih双表达基因疫苗的工程菌，(pvax-tpa-sinh-2a'-tpa-srfrp-asd)直接免疫动物或与dna疫苗佐剂混合后免疫动物，能够提高动物繁殖力。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的一种非抗性筛选的抗穆勒氏管激素、抑制素和促性腺激素释放抑制激素的共表达质粒，具体如下优点：

1、抑制素和促性腺激素释放抑制激素的双表达非抗性dna质粒pvax-tpa-sinh-2a'-tpa-srfrp-asd，能够表达免疫原性较强的抑制素(inh)和促性腺激素释放抑制激素(rfrp)两种种蛋白，刺激小鼠产生较高的抗体水平。

2、含有提高动物繁殖力的inh-gnih双表达基因疫苗的工程菌c500(pvax-tpa-sinh-2a'-tpa-srfrp-asd)通过灌胃免疫小鼠后，产生抑制素和促性腺激素释放抑制激素抗体，中和内源性激素，减弱这两种激素对促性腺激素的抑制作用，进而促进小鼠繁殖，其产仔数(15.44±2.13)显著高于pbs对照组(13.6±1.72)以及空质粒对照组(13.66±2.30)，也高于inh单表达组(14.94±2.19)、rfrp单表达组(14.26±1.37)，促繁殖效果明显。

3、含抑制素和促性腺激素释放抑制激素的双表达非抗性dna质粒的工程菌c500(pvax-tpa-sinh-2a'-tpa-srfrp-asd)，可以直接免疫动物，通过喷鼻、口服、拌饲等方式，经粘膜免疫产生抗体。由于不含抗性基因，不须引入外源抗生素进行筛选，所以不产生抗生素残留。相对于其它基因疫苗需要质粒提取、纯化，生产成本较高，肌肉注射麻烦，并使动物产生应激反应，该疫苗生产成本低，使用方便，而且无抗性和注射应激反应。

附图说明

图1为srfrppcr扩增产物电泳；m：markerdl2000；泳道1-9：tpa-srfrppcr产物。

图2为tpa-srfrppcr产物、pvax-asd载体双酶切后图谱，其中，m1：markerdl2000，泳道1和2：pvax-asd载体双酶切；泳道4-6：tpa-srfrppcr产物双酶切；m2：marker3。

图3为pvax-tpa-srfrp-asd质粒双酶切后图谱，其中，m：marker3；泳道1-5：单菌落pvax-tpa-srfrp-asd酶切图。

图4为tpa-sinhpcr扩增产物电泳；其中，m：marker3；泳道1-5：tpa-sinhpcr产物。

图5为pvax-tpa-srfrp-asd质粒以及tpa-sinhpcr产物酶切图；其中，(1)中m：marker3；泳道1-4：pvax-srfrp-asd质粒；(2)中m：marker3；泳道1-4：tpa-sinhpcr产物的酶切产物。

图6为pvax-tpa-sinh-tpa-srfrp-asd双酶切鉴定图谱；其中，m：al5000dnamarker，泳道1-4：pvax-sinh-srfrp-asd双酶切酶切图，经过bamhi和xhoi双酶切，出现两条带，在1000至2000有一条带，和tpa-sinh-tpa-srfrp片段大小一致。

图7为pvax-tpa-sinh-tpa-srfrp-asd和puc57-2a'-2a质粒酶切；其中(1)为puc57-2a'-2a酶切图，m：50bpdnamarker，泳道1-5：puc57-2a'-2a质粒酶切图；(2)为pvax-tpa-sinh-tpa-srfrp-asd酶切图，m：al5000dnamarker，泳道1-2：pvax-tpa-sinh-tpa-srfrp-asd质粒酶切图。

图8为转化后单菌落pvax-tpa-sinh-2a'-tpa-srfrp-asd酶切图谱；其中，m：50bpdnamarker，泳道1-6：转化后单菌落pvax-tpa-sinh-2a'-tpa-srfrp-asd酶切图谱，酶切2a'。

图9为pvax-tpa-sinh-2a'-tpa-srfrp-asdc500的pcr鉴定；其中，m：markeriii；泳道1-2：inva阴性；泳道3-4：crp阴性；泳道5-6：asd阴性；泳道7-8：inh-rfrp阴性；泳道9-10：amh-inh阴性；泳道11-12：inva；泳道13-14：crp；泳道15-16：asd；泳道17-18：inh-rfrp片段；泳道19-20：amh-inh对照。

图10为pvax-tpa-sinh-2a'-tpa-srfrp-asd质粒纯化后酶切图谱；其中，m：markeriii；泳道1-4：pvax-tpa-sinh-2a'-tpa-srfrp-asd质粒hindiii/xhoi双酶切。

图11为pvax-tpa-sinh-2a'-tpa-srfrp-asd转染hela细胞转录水平图谱；其中，m：markeriii；泳道1：inh-rfrp阴性；泳道2：inh-rfrp无处理；泳道3：inh-rfrp转染空载；泳道4：inh-rfrp转染双表达。

图12为不同疫苗免疫小鼠后初次免疫后第8周的抗inh抗体水平。

图13为不同疫苗免疫小鼠后初次免疫后第8周的抗rfrp抗体水平。

具体实施方式

现有的研究表明gnih可能直接或间接抑制卵泡发育和排卵。而本发明人经过大量实验用gnih基因疫苗免疫绵羊和小鼠，发现均可刺激卵泡发育和排卵，并提高产仔数与产羔数。

本发明人分别构建了抑制素(inh)、促性腺激素释放抑制激素(rfrp)的单表达dna疫苗pvax-tpa-sinh-asd、pvax-tpa-srfrp-asd，虽在小鼠上表现出了较好的提高繁殖力的效果，鉴于这两种激素均与卵泡发育相关，推测将此两种激素联合表达的效果会优于单表达。本实验室前期构建了双表达pires-tpa-sinh-tpa-srfrp，和对照组相比，显著提高了产仔数，但是使用的是ires(内部核糖体进入位点)，下游基因的表达量为上游的20％-50％，且载体含有氨苄抗性。本实验经大量实验验证后采用了2a'肽介导的多表达，实现了上下游几乎等摩尔表达，且不含抗性基因。

本发明采用2a'肽的基因序列为连接位点，上下游几乎等摩尔表达，使下游基因跟单表达几乎等摩尔表达，等同于双单表达同时免疫，使成本降低。

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。

若未特别指明，下列实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1真核单表达促性腺激素释放抑制激素pvax-srfrp-asd的构建

1、促性腺激素释放抑制激素pcr扩增、序列分析和酶切

根据华中农业大学农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室(繁殖课题组)提供的质粒pvax-tpa-srfrp-asd进行pcr扩增，获得牛(bovine)源的rfrp融合乙肝表面抗原以及人组织纤溶酶信号肽基因片段，具体如下：设计的引物两端连接酶切位点为ecorⅰ和xhoi，插入到pvax-asd载体中，获得能够表达牛(bovine)源rfrp融合乙肝表面抗原以及人组织纤溶酶信号肽质粒pvax-tpa-srfrp-asd，其牛(bovine)源的rfrp融合乙肝表面抗原以及人组织纤溶酶信号肽cdna开放阅读框为840(bp)，编码280个氨基酸。

将pvax-tpa-srfrp-asd，使用高保真酶进行pcr扩增，反应体系总体积50μl，其中含：

模板dna＜500ng

引物tpa-srfrpf(10um)2.5μl

引物tpa-srfrpr(10um)2.5μl

5×nfbuffer10μl

10mmdntp1μl

novostarfastpfupolymerase1μl

ddh2o补充体积至50μl

tpa-srfrp上下游引物为：

srfrpf：(seqidno.4)含ecori位点：

5'ccggaattcgccaccatggatgcaatgaagagagggc3'

tpa-srfrpr：(seqidno.5)含xhoi位点：

5'ccgctcgagttaaatgtatacaaacctctggggc3'

pcr反应步骤：1.预变性94℃4min，2.变性94℃40sec，3.退火58℃30sec，4.延伸72℃50sec，2-4步35循环，5.保温72℃10min。

tpa-srfrppcr扩增产物，序列如seqidno.2所示，电泳结果如图1所示，其中，m：markerdl2000；泳道1-9：tpa-srfrppcr产物。

tpa-srfrppcr产物、pvax-asd载体用ecorⅰ和xhoi酶切，获得片段tpa-srfrp(852bp)和pvax-asd片段(3741bp)，反应体系总体积20μl，其中含：

pvax-asd质粒或tpa-srfrppcr产物≤1μg

10×fastdigestbuffer2μl

ecorⅰ1μl

xhoi1μl

ddh2o补水至20μl

37℃水浴锅反应1h；

最后，将酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳，以markeriii作为分子量标准，观察电泳结果，如图2所示，其中，m1：markerdl2000，泳道1和2：pvax-asd载体双酶切；泳道4-6：tpa-srfrppcr产物双酶切；m2：marker3。

2、连接

用胶回收试剂盒将酶切产物进行回收(参照omegagelextractionkit使用说明书)。回收后的产物，用takara连接酶，连接目的片段和载体，连接体系总体积为10μl：

10×ligationbuffer1μl

t4dnaligation1μl

pvax-asd2μl

tpa-srfrp片段6μl

16℃过夜。连接产物pvax-tpa-srfrp-asd，直接用于转化或者-20℃保存备用。

3、重组质粒pvax-tpa-srfrp-asd转化感受态细菌

1)χ6097(由农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室(繁殖课题组)保存)感受态细胞的制备(氯化钙法)

用无菌接种环挑取冻存的菌种χ6097于含有二氨基庚二酸(dap)(50μg/ml)的lb平板上划线，同时在不加dap的lb平板上划线做对照，37℃培养过夜。次日挑取生长良好的单个菌落于5ml含有dap(50μg/ml)的lb液体培养基中，37℃，220r/min振摇培养过夜。取lml活化后的培养物接种到200ml含有dap(50μg/ml)的lb液体培养基中，37℃振摇培养2.5-3h，使od600值达到0.5左右。在无菌条件下将细菌培养物倒入预冷的无菌大离瓶中，冰浴30min，4℃5000rpm/min，离心10min，弃尽上清。再用10ml冰预冷的0.1mcacl2温和悬起细菌沉淀，冰浴30min，4℃5000rpm/min，离心10min，弃上清，最后用1ml冰预冷的0.1mcacl2再次重悬沉淀，加入终浓度为15％的灭菌甘油，混匀后分装为100μl/管，即获得感受态细菌χ6097，可直接用于转化或置于-80℃冰箱中保存备用。

2)用热休克法将连接产物转化感受态细菌χ6097，方法如下：

(1)取100μl冰浴上融化的感受态细胞，加入10μl重组dna(上述步骤制备的pvax-tpa-srfrp-asd)，轻轻混匀，在冰浴中放置30min。

(2)42℃水浴中热90sec，然后快速将管转移到冰浴中2min，该过程不要摇动离心管。

(3)向每个离心管中加入900μl无菌的lb培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃，220r/min培养45min，使细菌复苏。

(4)1000rpm，5min离心，吸弃上清液，留适量上清液。

(5)将沉淀轻轻吹起，混匀，转移至lb固体培养基(不含抗生素)，将细胞均匀涂开。将平板置于37℃恒温箱，30min后倒置平板，37℃培养过夜。

4、阳性克隆的筛选、鉴定与测序

从上步的平板中挑取阳性克隆(pvax-tpa-srfrp-asd)，接种于lb液体培养基培养，用质粒小量试剂盒抽提质粒(参照天根生化科技(北京)有限公司的质粒提取试剂盒使用说明书)，限制性内切酶ecorⅰ和xhoi双酶切，鉴定片段tpa-srfrp，37℃，反应1h，1.0％琼脂糖凝胶电泳，观察酶切结果，电泳条带与目的条带即852bp大小相符，结果如图3所示，选取其中一个质粒，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。获得真核表达质粒载体pvax-tpa-srfrp-asd。

实施例2：真核双表达抑制素、促性腺激素释放抑制激素质粒pvax-tpa-sinh-2a'-tpa-srfrp-asd的构建

1、抑制素激素pcr扩增、序列分析和酶切

根据质粒pvax-tpa-sinh-asd(inhα1-32)(华中农业大学构建，具体操作见附录1)进行pcr扩增，获得猪(swine)源的inhα(1-32)融合乙肝表面抗原以及人组织纤溶酶信号肽基因片段，设计引物两端的酶切位点为bamhi和ecori，酶切tpa-sinh以及pvax-tpa-srfrp-asd(华中农业大学构建，具体操作见附录2)，连接，转化，挑取单菌落，小提，酶切，从电泳条带与目的条带大小相符的质粒中，选取其中一个质粒，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

获得质粒pvax-tpa-sinh-tpa-srfrp-asd，将pvax-tpa-sinh-tpa-srfrp-asd和puc57-2a'-2a质粒进行ecori酶切，连接，转化，挑取单菌落，小提，酶切2a'片段，看是否连接2a'，获得pvax-tpa-sinh-2a'-tpa-srfrp-asd。

具体操作如下：

将pvax-tpa-sinh-asd，使用高保真酶进行pcr扩增，反应体系总体积50μl，其中含：

模板dna＜500ng

引物tpa-sinhf(10um)2.5μl

引物tpa-sinhr(10um)2.5μl

5×nfbuffer10μl

10mmdntp1μl

novostarfastpfupolymerase1μl

ddh2o补充体积至50μl

上下游引物为：

tpa-sinhf：(seqidno.6)含bamhi位点：

5'cgcggatccgccaccatggatgcaatgaagagagggc3'

tpa-sinhr：(seqidno.7)含ecori位点：

5'ccggaattcttgtctgtggcagtcggcg3'

pcr反应步骤：1.预变性94℃4min，2.变性94℃40sec，3.退火58℃30sec，4.延伸72℃50sec，2-4步35循环，5.保温72℃10min。

tpa-sinh扩增产物是在seqidno.1所示的两端增加bamhi和ecori的酶切位点，其序列如seqidno.1所示，进行电泳扩增，结果如图4所示。其中，在图4中，m：marker3；泳道1-5：tpa-sinh的pcr扩增产物。

tpa-sinhpcr产物和pvax-tpa-srfrp-asd用bamhi和ecori酶切，获得片段tpa-sinh(855bp，不算两端酶切位点)以及pvax-tpa-srfrp-asd(4574bp)，反应体系总体积20μl，其中含：

tpa-sinhpcr产物和pvax-tpa-srfrp-asd≤1μg

10×fastdigestbuffer2μl

bamhi1μl

ecori1μl

ddh2o补水至20μl

37℃水浴锅反应1h；

最后，将酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳，以marker3作为分子量标准，观察电泳结果，结果如图5所示，其中，图5(1)为pvax-tpa-srfrp-asd质粒的电泳结果，m：marker3，泳道1-4：pvax-tpa-srfrp-asd质粒；图5(2)为tpa-sinhpcr扩增产物酶切，m：marker3；泳道1-4：tpa-sinhpcr扩增产物的酶切产物。

2、连接

用胶回收试剂盒将上述酶切产物进行回收(参照omegagelextractionkit使用说明书)。回收后的产物，用takara连接酶，连接目的片段和载体，连接体系总体积为10μl：

16℃过夜。连接产物pvax-tpa-sinh-tpa-srfrp-asd，直接用于转化或者-20℃保存备用。

3、重组质粒pvax-tpa-sinh-tpa-srfrp-asd转化感受态细菌

1)χ6097(由农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室(繁殖课题组)提供)感受态细胞的制备(氯化钙法)

用无菌接种环挑取冻存的菌种χ6097于含有dap(50μg/ml)的lb平板上划线，同时在不加dap的lb平板上划线做对照，37℃培养过夜。次日挑取生长良好的单个菌落于5ml含有dap(50μg/ml)的lb液体培养基中，37℃，220r/min振摇培养过夜。取lml活化后的培养物接种到200ml含有dap(50μg/ml)的lb液体培养基中，37℃振摇培养2.5-3h，使od600值达到0.5左右。在无菌条件下将细菌培养物倒入预冷的无菌大离瓶中，冰浴30min，4℃5000rpm/min，离心10min，弃尽上清。再用10ml冰预冷的0.1mcacl2温和悬起细菌沉淀，冰浴30rnin，4℃5000rpm/min，离心10min，弃上清，最后用1ml冰预冷的0.1mcacl2再次重悬沉淀，加入终浓度为15％的灭菌甘油，混匀后分装为100μl/管，即获得感受态细菌χ6097，可直接用于转化或置于-80℃冰箱中保存备用。

2)用热休克法将连接产物转化感受态细菌χ6097，方法如下：

(1)取100μl冰浴上融化的感受态细胞，加入10μl重组dna

(pvax-tpa-sinh-tpa-srfrp-asd)，轻轻混匀，在冰浴中放置30min。

(2)42℃水浴中热90sec，然后快速将管转移到冰浴中2min，该过程不要摇动离心管。

(3)向每个离心管中加入900μl无菌的lb培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃，220r/min培养45min，使细菌复苏。

(4)1000rpm，5min离心，吸弃上清液，留适量上清液。

(5)将沉淀轻轻吹起，混匀，转移至lb固体培养基(不含抗生素)，将细胞均匀涂开。将平板置于37℃恒温箱，30min后倒置平板，37℃培养过夜。

4、pvax-tpa-sinh-tpa-srfrp-asd阳性克隆的筛选、鉴定与测序

从上步的平板中挑取阳性克隆(pvax-tpa-sinh-tpa-srfrp-asd)，接种于lb液体培养基培养，用质粒小量试剂盒抽提质粒(参照天根生化科技(北京)有限公司的质粒提取试剂盒使用说明书)，限制性内切酶bamhi和xhoi双酶切，鉴定片段tpa-sinh-tpa-srfrp，37℃，反应1h，1.0％琼脂糖凝胶电泳观察酶切结果，观察酶切结果，电泳条带与目的条带(即1713bp)大小相符，结果如图6所示，其中，m：al5000dnamarker；泳道1-4：pvax-tpa-sinh-tpa-srfrp-asd双酶切的酶切产物。选取其中一个质粒，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。获得真核表达质粒载体pvax-tpa-sinh-tpa-srfrp-asd。

5、插入2a'片段

1)pvax-tpa-sinh-tpa-srfrp-asd和puc57-2a'-2a酶切

将质粒pvax-tpa-sinh-tpa-srfrp-asd和puc57-2a'-2a用ecori酶切，获得片段2a'(63bp，不算酶切位点)以及pvax-tpa-sinh-tpa-srfrp-asd(5443bp)，反应体系总体积20μl，其中含：

pvax-tpa-sinh-tpa-srfrp-asd和puc57-2a'-2a质粒≤1μg

10×fastdigestbuffer2μl

ecori1μl

ddh2o补水至20μl

37℃水浴锅反应1h；

最后，pvax-tpa-sinh-tpa-srfrp-asd酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳，puc57-2a'-2a用12％聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)分离2a'，以50bpdnamarker以及al5000作为分子量标准，观察电泳结果，结果如图7所示，其中，图7(1)为puc57-2a'-2a酶切产物，m：50bpdnamarker，泳道1-5：puc57-2a'-2a质粒酶切图；图7(2)为pvax-tpa-sinh-tpa-srfrp-asd酶切图，m：al5000dnamarker，泳道1-2：pvax-tpa-sinh-tpa-srfrp-asd质粒酶切产物。

2)连接

16℃过夜。连接产物pvax-tpa-sinh-2a'-tpa-srfrp-asd，直接用于转化或者-20℃保存备用。

3)重组质粒pvax-tpa-sinh-2a'-tpa-srfrp-asd转化感受态细菌

用热休克法将连接产物转化感受态细菌χ6097，方法如下：

(1)取100μl冰浴上融化的感受态细胞，加入10μl重组dna(上述连接产物pvax-tpa-sinh-2a'-tpa-srfrp-asd)，轻轻混匀，在冰浴中放置30min。

(2)42℃水浴中热90sec，然后快速将管转移到冰浴中2min，该过程不要摇动离心管。

(3)向每个离心管中加入900μl无菌的lb培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃,220r/min培养45min，使细菌复苏。

(4)1000rpm，5min离心，吸弃上清液，留适量上清液。

(5)将沉淀轻轻吹起，混匀，转移至lb固体培养基(不含抗生素)，将细胞均匀涂开。将平板置于37℃恒温箱，30min后倒置平板，37℃培养过夜。

4)pvax-tpa-sinh-2a'-tpa-srfrp-asd阳性克隆的筛选、鉴定与测序

从上步的平板中挑取阳性克隆(pvax-tpa-sinh-2a'-tpa-srfrp-asd)，接种于lb液体培养基培养，用质粒小量试剂盒抽提质粒(参照天根生化科技(北京)有限公司的质粒提取试剂盒使用说明书)，限制性内切酶ecori酶切，鉴定是否插入2a'片段，用12％聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)分离2a'，观察酶切结果，电泳条带与目的条带(63bp，不算酶切位点大小)大小相符，结果图8所示，其中，m：50bpdnamarker，泳道1-6：转化后单菌落pvax-tpa-sinh-2a'-tpa-srfrp-asd酶切产物，酶切2a'。选取其中一个质粒，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。获得真核表达质粒载体pvax-tpa-sinh-2a'-tpa-srfrp-asd。

实施例3：真核双表达抑制素、促性腺激素释放抑制激素质粒pvax-tpa-sinh-2a'-tpa-srfrp-asdc500感受态工程菌的制备

1.感受态的制备用无菌接种环挑取冻存的菌种c500(由农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室(繁殖课题组)提供)于含有dap(50μg/ml)的lb琼脂平板上划线，同时在不加dap的lb琼脂平板上划线做对照，37℃培养过夜。次日挑取生长良好的单个菌落于5ml含有dap(50μg/ml)的lb液体培养基中，37℃振摇培养过夜。取3ml活化后的培养物接种到300ml含有dap(50μg/ml)的lb液体培养基中，37℃振摇培养2.5-3h，使od600值达到0.5左右。在无菌条件下将细菌培养物倒入预冷的无菌离心瓶，冰浴30min，4℃5000rpm/min离心10min，弃尽上清，再用10ml冰预冷的10％甘油溶液温和悬起细菌沉淀，冰浴10min，4℃5000rpm/min离心10min，弃上清，重复用10ml冰预冷的10％甘油溶液温和悬起细菌沉淀，冰浴10min，离心10min后，弃上清，最后用1.5ml冰预冷的10％甘油重悬，悬浮的感受态细胞按80μl分装，立刻用于电转化或置于-80℃冰箱中保存备用。

2.质粒电转化c500

取20μl小提的质粒，加入到新鲜的80μl上述感受态细胞中，混合后放冰上预冷30min。设置电转仪参数：电压1.8kv，时间4ms-6ms。将冷却的混合物加入电转杯中，把杯外面的水擦干净后电击，立刻加入soc培养基于37℃摇床复苏45min。8000rpm/min，离心1min，吸弃1ml上清液，剩余的涂布于预先在培养箱中预热的麦康凯固体平板，37℃培养过夜。

3.pcr鉴定

从麦康凯平板中挑取单菌落于不添加任何抗生素的lb培养基中，采用pcr法鉴定筛选阳性克隆，inva、crp、asd检验是否为目的菌；amh-rfrp、inh-rfrp检测目的菌中是否转染目的质粒进去。20μlpcr反应体系中含上、下游引物各1μl，2×taqpcrmix10μl，模板2μl，ddh2o6μl。反应程序为：94℃预变性4min，然后94℃变性40sec，58℃退火30sec，72℃延伸50sec，共35个循环，最后72℃延伸10min。其中，所用的各扩增引物如下表1所示，将pcr产物进行电泳扩增，结果如图9所示，m：markeriii；泳道1-2：inva阴性；泳道3-4：crp阴性；泳道5-6：asd阴性；泳道7-8：inh-rfrp阴性；泳道9-10：amh-inh阴性；泳道11-12：inva；泳道13-14：crp；泳道15-16：asd；泳道17-18：inh-rfrp片段；泳道19-20：amh-inh对照。

表1

4.碱裂解法提取质粒

(1)从麦康凯平板中挑取单菌落于5ml不添加任何抗生素的lb培养基中，37℃，220rpm/min震荡培养过夜。

(2)取2ml菌液转入2mlep管中，13000rpm离心lmin,弃上清。

(3)将沉淀重悬于100μl冰预冷的solutionⅰ,涡旋震荡至菌体充分悬浮。

(4)加入200μl新配制的solutionⅱ，立即颠倒混匀，冰浴5min。加入150μl冰预冷的solutionⅲ，轻轻的上下颠倒混匀后,冰浴5min。

(5)13000rpm离心5min，将上清转移至新的ep管中。

(6)加入等体积苯酚:氯仿:异戊醇(按体积比为25:24:l),充分混匀。

(7)13000rpm离心5min，小心吸取上层水相,转移至新的pe管中,加入2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30min。

(8)13000rpm离心10min，弃上清，用75％乙醇洗沉淀一次。

(9)13000rpm离心5min，弃上清。

(10)将ep管室温静止几min，加入适量的te，重悬沉淀，56℃作用30min。

5.dna产物纯化(参照天根说明书操作)

(1)向吸附柱cb2中加入500μl的平衡液bl，13,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cb2重新放回收集管中。

(2)加入所需纯化的质粒，向其中加入5倍体积的结合液pb，充分混匀。

(3)将上一步所得溶液加入一个吸附柱cb2中(吸附柱放入收集管中)，室温放置2min，13,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cb2放入收集管中。注意：吸附柱容积为800μl，若样品体积大于800μl可分批加入。

(4)向吸附柱cb2中加入600μl漂洗液pw(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，静置2-5min再离心，13,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cb2放入收集管中。

(5)重复操作步骤4。

(6)将吸附柱cb2放回收集管中，13,000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱cb2置于室温放置数min，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。

(7)将吸附柱cb2放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30-50μl洗脱缓冲液eb，室温放置2min。13,000rpm离心2min收集dna溶液。

6.dna产物纯化后酶切

限制性内切酶hindiii和xhoi双酶切，37℃，反应1h，1.0％琼脂糖凝胶电泳，观察酶切结果，结果如图10所示，其中，m：markeriii；泳道1-4：hindiii/xhoi。结果说明菌液中含有目的片段，质粒成功转染c500中。

将该工程菌株保藏于在中国典型培养物保藏中心，分类命名：猪霍乱沙门氏菌c500/pvax-sinh-2a-srfrp-asd(salmonellaentericac500/pvax-sinh-2a-srfrp-asd)，地址：湖北省武汉市武汉大学，保藏编号：cctccno：m2018541，保藏日期为：2018年8月15日。

实施例4：真核双表达抑制素、促性腺激素释放抑制激素质粒pvax-tpa-sinh-2a'-tpa-srfrp-asd质粒在体外表达的检测

pvax-tpa-sinh-2a'-tpasrfrp-asd质粒转染细胞后转录水平的检测：

用质粒提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)抽提实施例3中制备的质粒，待hela细胞(人子宫颈癌细胞的细胞系)单层长至60％-70％时按lipofectamine3000脂质体转染试剂盒(购自invitrogen公司)说明书进行转染。转染hela细胞48h后，用胰酶消化并收集细胞。按照trizol(购自invitrogen公司)使用说明书提取细胞的mrna，反转录获得cdna，根据抑制素、促性腺激素释放抑制激素基因引物(见实施例3中的inh-rfrp)。进行扩增。

以反转录得到的cdna为模板，用inh-rfrp的primers进行inh-rfrp目的片段的扩增。经1％琼脂糖电泳检测可发现1027bp(inh-rfrp)左右的片段结果如图11所示，其中，m：markeriii；泳道1：inh-rfrp阴性；泳道2：inh-rfrp无处理；泳道3：inh-rfrp转染空载；泳道4：inh-rfrp转染双表达。结果说明质粒能够在真核细胞中表达。

实施例5：一种抑制素、促性腺激素释放抑制激素、及双表达的非抗性dna质粒在促进动物繁殖中的应用

经大量实验研究证明用已经构建好的非抗性筛选疫苗(pvax-tpasinh-asd、pvax-tpasrfrp-asd)免疫小鼠，其能够提高小鼠的产仔数。因此本实验采用非抗性筛选抗抑制素、促性腺激素释放抑制激素基因疫苗c500(pvax-tpasinh-asd、pvax-tpasrfrp-asd)作为阳性参照物，来比较新型的实施例3制备的双表达抑制素、促性腺激素释放抑制激素基因疫苗pvax-tpasinh-2a'-tpasrfrp-asd是否能够达到提高小鼠产仔数的效果，鉴定疫苗的免疫效果，试图推动新型的双表达抑制素、促性腺激素释放抑制激素基因疫苗在生产中的应用。

1.材料和方法

1.1质粒和菌株

质粒pvax-tpa-sinh-asd、pvax-tpa-srfrp-asd均由本实验室构建与保存；双表达抑制素、促性腺激素释放抑制激素菌株猪霍乱沙门氏菌c500(pvax-tpasinh-2a'-tpasrfrp-asd)成功构建并保存于-80℃。

1.2实验动物饲养管理

自湖北省疾控中心购自5周龄的spf级雌性昆明小鼠，预饲1周后，随机分组，进入试验期，饲养于实验室专门的动物房，控制饲养温度在25℃左右，标准饲料和常规饮水饲养。实行笼养，每笼5只，每周进行一次卫生清洁，每天观察采食饮水是否正常，是否出现由于肌肉注射或采血应激而死亡现象。免疫后观察小鼠的体重增长情况。

1.3疫苗免疫小鼠试验分组

将预饲1周后的昆明雌鼠随机分20只/组。试验分组如下表2：

表2

1.4小鼠免疫方式

根据试验分组对小鼠进行免疫，免疫前4h移除小鼠的水和鼠料，采取灌胃方式，免疫前30min灌胃200μl的碳酸氢钠(7.5％)，之后灌胃200μl的疫苗。2周后按同样方式加强免疫一次，免疫后连续一周观察小鼠的精神和身体状况。

1.5小鼠的称重和血液采集

在免疫前、免疫后1w，2w同一时间段对小鼠进行称重并记录体重数据。0w、8w尾静脉采血，将血液收集于有20μl肝素钠抗凝剂/管的1.5mlep管中，3000r/min离心10min，小心吸取上层血浆，置于-20保存备用。

1.6小鼠交配后的产仔数、产子窝重统计

疫苗加强免疫后2w，将所有母鼠分笼(每笼2只)，标记。健康雄性小鼠与雌鼠合笼，直至雌鼠全部怀孕。记录小鼠产仔数，产子窝重，仔鼠重。

1.7inh/rfrp抗体的检测

用间接elisa方法检测免疫后小鼠体内inh/rfrp抗体的生成情况，具体步骤如下：

(1)96孔板酶标板每孔包被inh/rfrp抗原50ng/100μl，4℃孵育过夜。

(2)弃反应液，pbst洗涤3次，300μl/孔，每次3min。

(3)加封闭液(即1％bsa溶液)200μl/孔，37℃孵育1h。

(4)弃反应液，pbst洗涤3次，300μl/孔，每次3min。

(5)加稀释待测血浆，100μl/孔，同时设置阴性对照孔、非特异性吸附孔(及pbst代替血浆)以及零调控，37℃孵育90min。

(6)弃反应液，pbst洗涤5次，300μl/孔，每次3min。

(7)加山羊抗鼠igg-hrp(谷歌，1:3000稀释)100μl/空，37℃反应1h。

(8)弃反应液，pbst洗涤5次，300μl/孔，每次3min。

(9)加tmb底物显色液150μl/孔，避光反应15min。

(10)加2mol/lh2so4终止液50μl/孔，终止反应，15min内在450nm波长处测定各孔的od值。

2结果与分析

2.1免疫反应

2.1.1不同疫苗免疫小鼠后抗inh抗体水平

将分别包含质粒pvax-asd、pvax-tpa-sinh-asd以及pvax-tpa-sinh-2a'-tpa-srfrp-asd的减毒沙门氏菌c500菌液，按照10¹⁰cfu/ml的剂量免疫小鼠，初免免疫8w采集血液检测抗inh抗体。结果如图12可见，实验组均产生了抗inh抗体，且各实验组之间差异不显著(p>0.05)。

2.1.2不同疫苗免疫小鼠后抗rfrp抗体水平

将分别包含质粒pvax-asd、pvax-tpa-srfrp-asd以及pvax-tpa-sinh-2a'-tpa-srfrp-asd的减毒沙门氏菌c500菌液，按照10¹⁰cfu/ml的剂量免疫小鼠，初免免疫8周采集血液检测抗rfrp抗体。由图13可见，实验组均产生了抗rfrp抗体，且各实验组之间差异不显著(p>0.05)。

2.2不同疫苗免疫鼠后产仔数及出生重的比较

统计不同疫苗免疫小鼠后产仔数及出生重，结果如表3所示。

表3不同疫苗免疫鼠后的产仔数及窝重比较

注：同一列中数据上标有的小写字母完全不相同表示差异显著(p＜0.05)，反之，表示差异不显著(p＞0.05)，所有数据为均值±标准差表示。

结果表明产仔数：pvax-tpa-sinh-2a'-tpa-srfrp-asd组产仔数显著高于pbs组、pvax-asd组，高于单表达pvax-tpa-sinh-asd组、pvax-tpa-srfrp-asd组。出生重：统计各组的出生重，结果显示，不同疫苗免疫母鼠不影响仔鼠的出生重，各组之间差异不显著(p>0.05)。

结果说明：本发明构建的pvax-tpa-sinh-2a'-tpa-srfrp-asd的dna疫苗可有效提高动物的繁殖能力。

附录1载体pvax-tpa-sinh-asd的构建

1.1tpa-sinh片段的扩增

以pires-tpa-sinh-tpa-srfrp质粒为模板，进行pcr扩增，采用20μl的pcr反应体系：其中，模板1.5μl，tpa-sinh片段上、下游引物各1μl，2×taqpcrmix10μl，ddh2o6.5μl。pcr的反应程序为94℃预变性4min，然后94℃变性40s，66℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸10min，4℃10min。

pcr扩增中所用的tpa-sinh上游引物带有kpni酶切位点，下游引物带有ecori酶切位点，引物序列如下：

1.2tpa-sinh片段与pmd19t(simple)连接

扩增产物进行电泳，电泳结束后在紫外灯下从凝胶上切下tpa-sinh片段的琼脂糖凝胶，并按照takaraminibestagarosegeldnaextractionkitver.4.0试剂盒说明书进行回收，具体步骤如下：1％琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下从琼脂糖胶上切取单一的目的dna条带，放入一个干净的1.5ml的ep管中，加入3倍质量体积的(100mg＝100μl)buffergm，混合均匀后于室温溶解胶块，其间轻弹ep管，使凝胶完全融化。然后将融化的液体转至一吸附柱，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，加入500μlbufferwb，12000rpm离心30s，洗涤两次；最后12000rpm离心1min，除去吸附柱内痕量液体。将吸附柱转移至一干净的1.5mlep管中，加入30μl的elutionbuffer，于室温放置2min，12000rpm离心1min洗脱dna。电泳检测回收纯度，并测浓度，收集的dna溶液用于下一步实验或-20℃保存备用。

将tpa-sinh片段与pmd19t-simple载体连接，具体步骤如下：根据回收后的dna浓度计算出载体和目的片段的连接体积比，使用solutioni连接pmd19t和tpa-sinh片段，连接体系采用10μl体系：pmd19t0.5μl，tpa-sinh片段4.5μl，solutioni5μl。混匀，短暂离心，16℃水浴连接过夜。

1.3细菌的转化

(1)将感受态细胞dh5α从-80℃中取出冰浴解冻，加入10μl连接产物，轻轻混匀，冰浴30min。

(2)转至42℃热激90sec，然后迅速取出放在冰上2min，该过程不能摇动离心管。

(3)加入400μl不含抗生素的lb液体培养基，混匀后置于37℃，200r/min振荡培养1h。使细菌复苏。

(4)3000r/min离心5min，弃去400μl上清。

(5)轻轻混匀剩余液体，使用涂布器均匀涂于含amp抗生素(50μg/ml)的lb固体培养基上，37℃恒温培养12-14h，观察是否有转化菌落长出。

1.4阳性克隆的筛选与鉴定

挑取单菌落于含amp抗生素(50μg/ml)的lb液体培养基中，37℃200r/min振荡培养12h左右，使用天根试剂盒进行质粒小提，pmd19t-tpa-sinh质粒经过kpni和ecori进行双酶切鉴定。酶切体系如下：

混匀，短暂离心，37℃水浴反应过夜。

将10μl酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出疑似pmd19t-tpa-sinh的质粒，送到武汉擎科创新生物科技有限公司进行测序，将序列比对正确的质粒所对应的菌液扩大培养，提取质粒，-20℃保存备用。

1.5载体pvax-asd和质粒pmd19t-tpa-sinh的酶切与回收

参照thermo说明书稍作改动，具体步骤如下：用限制性内切酶kpni和ecori双酶切pvax-asd质粒和pmd19t-tpa-sinh质粒，露出两端的粘性末端，酶切体系分别如下：

混匀，短暂离心，37℃水浴反应过夜。

酶切后经1％的琼脂糖凝胶电泳，分离出目的条带，使用takaraminibestagarosegeldnaextractionkitver.4.0试剂盒回收tpa-sinh和线性pvax-asd片段，回收后电泳检测回收纯度，并测其浓度。

1.6tpa-sinh片段与载体pvax-asd连接

按照thermot4连接酶说明书操作规范进行，具体步骤如下：根据回收后检测的dna浓度计算出载体和目的片段的连接比，使用t4dnaligase连接pvax-asd和tpa-sinh片段，连接体系如下：

混匀，短暂离心，16℃水浴连接过夜。

1.7χ6097感受态细胞的制备(氯化钙法)

用无菌接种环取冻存的菌种χ6097，于含有dap(50μg/ml)的lb平板上划线，同时在不加dap的lb平板上划线做为对照，37℃培养过夜。次日挑取生长良好的单菌落于5ml含有dap(50μg/ml)的lb液体培养基中，37℃振摇培养过夜。取1ml活化后的培养物接种到100ml含有dap(50μg/ml)的lb液体培养基中，37℃振摇培养2.5-3h，使od600值达到0.5左右。在无菌条件将细菌培养物倒入预冷的无菌离心管中，冰浴30min，4℃5000r/min离心10min，弃尽上清。再用10ml冰预冷的0.1mcacl2温和悬起细菌沉淀，冰浴30min，4℃5000r/min离心10min，弃尽上清，最后用冰预冷的0.1mcacl2再次重悬沉淀，加入终浓度为15％的灭菌甘油，混匀分装为100μl/管，直接用于转化或置于-80℃冰箱中保存备用。

1.8细菌的转化

(1)将感受态细胞χ6097从-80℃中取出冰浴解冻，加入10μl连接产物，轻轻混匀，冰浴30min。

(2)转至42℃热激90sec，然后迅速取出放在冰上2min，该过程不能摇动离心管。

(3)加入400μl不含抗生素的lb液体培养基，混匀后置于37℃，200r/min振荡培养1h。使细菌复苏。

(4)3000r/min离心5min，弃去400μl上清。

(5)轻轻混匀剩余液体，使用涂布器均匀涂布不含任何外源物质的lb平板，37℃恒温培养18-20h，观察是否有转化菌落长出。

1.9阳性克隆的筛选与鉴定

挑取单菌落于不含任何外源物质的lb液体培养基中，37℃200r/min振荡培养12h左右，使用天根试剂盒进行质粒小提，pvax-tpa-sinh-asd质粒经过kpni和ecori进行双酶切鉴定。酶切体系如下：

混匀，短暂离心，37℃水浴反应过夜。

将10μl酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出疑似pvax-tpa-sinh-asd的质粒，送到武汉擎科创新生物科技有限公司测序，将序列比对正确的质粒所对应的菌液扩大培养，提取质粒，-20℃保存备用。

附录2载体pvax-tpa-srfrp-asd的构建

2.1tpa-srfrp片段的扩增

具体pcr体系和程序如1.2。tpa-srfrp上游引物带有kpni酶切位点，下游引物带有ecori酶切位点，引物序列如下：

2.2tpa-sinh片段与pmd19t(simple)连接

具体步骤可参照1.2。

2.3细菌的转化

具体步骤可参照1.3。

2.4阳性克隆筛选与鉴定

具体步骤可参照1.4。

2.5载体pvax-asd和质粒pmd19t-tpa-sinh的酶切与回收

具体步骤可参照1.5。

2.6目的基因连接

按照thermot4连接酶说明书操作规范进行，具体步骤如下：根据回收后检测的dna浓度计算出载体和目的片段的链接比，使用t4dnaligase连接pvax-asd和tpa-srfrp片段，连接体系如下：

混匀，短暂离心，16℃水浴连接过夜。

2.7细菌的转化

具体过程可参照1.8。

2.8阳性克隆的筛选与鉴定

具体过程可参照1.9。

序列表

<110>华中农业大学

<120>一种提高动物繁殖力的inh-gnih双表达基因疫苗、其制备方法与应用

<160>21

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>867

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ggatccgccaccatggatgcaatgaagagagggctctgctgtgtgctgctgctgtgtgga60

gcagtcttcgtttcgcccagcgctagcatggagagcacaacatcaggattcctaggaccc120

ctgctcgtgttacaggcggggtttttcttgttgacaagaatcctcacaataccacagagt180

ctagactcgtggtggacttctctcaattttctagggggagcacccacgtgtcctggccaa240

aattcgcagtccccaacctccaatcactcaccaacctcttgtcctccaatttgtcctggc300

tatcgctggatgtgtctgcggcgttttatcatattcctcttcatcctgctgctatgcctc360

atcttcttgttggttcttctggactaccaaggtatgttgcccgtttgtcctctacttcca420

ggaacatcaactaccagcacgggaccatgcaagacctgcacgattcctgctcaaggaacc480

tctatgtttccctcttgctgctgtacaaaaccttcggacggaaactgcacttgtattccc540

atcccatcatcctgggctttcgcaagattcctatgggagtgggcctcagtccgtttctcc600

tggctcagtttactagtgccatttgttcagtggttcgtagggctttcccccactgtttgg660

ctttcagttatatggatgatgtggtattgggggccaagtctgtacaacatcttgagtccc720

tttttacctctattaccaattttcttttgtctttggcatatgtccaccgcccctctgccc780

tggccttggtcccccgccgcgctgcgcctgctgcagaggcccccggaggaacccgctgtg840

cacgccgactgccacagacaagaattc867

<210>2

<211>864

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gaattcgccaccatggatgcaatgaagagagggctctgctgtgtgctgctgctgtgtgga60

gcagtcttcgtttcgcccagcgtcgacatggagagcacaacatcaggattcctaggaccc120