一种伯克氏菌及其该伯克氏菌的应用的制作方法

本发明属于细菌培养及发酵应用的方法技术领域。

背景技术：

农作物在生长过程中，线虫是一种十分常见的植物虫害。一些植物寄生线虫会破坏植物根的组织，如根结线虫能导致植物根系发育受阻，营养吸收出现障碍，有些线虫还会传播其它病害。线虫估计每年能给农作物造成相当于1000亿美元的损失。根结线虫(meloidogynespp.)、胞囊线虫(heteroderaspp.)是两大类能严重危害多种重要作物的线虫，在全球分布广、危害重。

普通的线虫防治方法主要包括熏蒸、使用化学农药，也可以使用具有杀线虫功能的微生物菌剂。熏蒸由于对环境具有巨大的破坏作用，国家已明令禁止使用。化学合成农药因为残留、对人体、环境和生态平衡具有多种危害。虽然可以通过传统的轮作、土壤改良等途径控制某些植物的线虫病，但对于一些经济作物和林木而言，轮作防病难以实施，甚至根本上不可能进行。生物防治因具有除害增产﹑保护生态平衡﹑减轻环境污染等优势，越来越受到人们的关注。微生物具有天然、无残留等优点，成为最具有发展前景的方法。杀线虫微生物最为常见的是淡紫拟青霉、轮枝孢等真菌，但大田防治效果很不理想。

细菌也是防治线虫的重要生物类型，但应用于产业的种类和报道很少。王贻南等报道了一株越南伯克氏菌(burkholderiavietnamiensis)b418报道具有防治线虫的功效。其它伯克氏菌(burkholderia)抗线虫活性未见报道。

技术实现要素：

本发明正是为了解决上述问题缺陷，提供一种伯克氏菌及其该伯克氏菌的应用。本发明所记述的伯克氏菌为一株尚未报道、具有高效杀线虫活性的阿伯氏伯克氏菌burkholderiaarborisj211，其能够达到在田间高效防治植物线虫病并提高植物品质的效果。

本发明采用如下技术方案实现。

一种细菌，该细菌为伯克氏菌，为burkholderiaarborisj211；保藏编号为cctccno：m2019747。现在保藏在国家知识产权局指定的保藏单位(保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2019年10月10日，保藏编号为cctccno：m2019747。保藏单位地址：武汉，珞珈山，武汉大学内，邮政编码430072)。

进一步，本发明该细菌从云南昆明烟田土壤中分离获得。

进一步，本发明该细菌的培养基为牛肉膏蛋白胨培养基。

进一步，本发明该细菌用于防治植物线虫病。

进一步，本发明该细菌的发酵液用于防治植物线虫病。在大田里具有显著地防治植物线虫病的效果。

本发明所述细菌的应用，该细菌的发酵液的制备方法包括：配制牛肉膏蛋白胨液体培养基→灭菌→冷却→接种→摇床200-300rpm发酵12-72小时→收集菌液。

进一步，本发明该细菌的发酵液的施用方法包括：

a、在作物栽培时，在土壤中挖与苗根大小相对应的栽培穴，放入小苗，将发酵好的菌液浇在植物的根部，菌液用量根据根的大小为10ml-100ml/株；或，

b、将发酵好的菌液和任意比例的浇根用水混合后，在作物栽培时，浇入栽培穴中，或者是覆土后进行浇灌；或，

c、将发酵好的菌液加入灭菌后的麦麸，低温干燥后制成菌粉，在栽培植物时，将干燥的菌粉施用于田间；或，

d、将发酵好的菌液加入灭菌后的麦麸，低温干燥后制成菌粉，将菌粉在营养液中活化后，在栽培时浇入植物的根部；或，

e、将发酵好的菌液进行冷冻干燥后制成纯的菌粉，在栽培植物时，直接施用干燥的纯的菌粉；或，

f、将发酵好的菌液进行冷冻干燥后制成纯的菌粉，将纯的菌粉和其它物质混合后施用；或，

g、将发酵好的菌液进行冷冻干燥后制成纯的菌粉，将菌粉活化后，将含有活化菌的菌液浇在植物的根部。

进一步，本发明该细菌的发酵液的施用方法不包括在根部施用杀细菌剂药物。

进一步，本发明该细菌的发酵液的施用方法包括与其它线虫生防菌剂进行复合使用。

本发明的有益效果为，1、具有明显地提高大田作物抗线虫病的能力；2、提高作物的商品质量；3、提高作物的产量。本产品还可以和其它线虫生防菌剂进行复合使用，以进一步增强本菌剂的防治效果。

下面结合附图和具体实施方式本发明做进一步解释。

附图说明

图1为本发明菌落在牛肉膏蛋白胨培养基平板正面照片图；

图2为本发明菌落在牛肉膏蛋白胨培养基平板反面照片图；

图3为本发明j211菌株的进化树图；

图4为洋葱伯克氏菌群中的部分种类可能存在bcesm基因的遗传连锁标记图；

图5为本发明施用j211菌液后烟草根部效果图；

图6为未施用本发明j211菌液的烟草根部效果图。

具体实施方式

见图3所示。一种细菌，该细菌为伯克氏菌，拉丁名为burkholderiaarborisj211；保藏编号为cctccno：m2019747。现在保藏在国家知识产权局指定的保藏单位(保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2019年10月10日，保藏编号为cctccno：m2019747。保藏单位地址：武汉，珞珈山，武汉大学内，邮政编码430072)。

进一步，本发明该细菌从云南昆明烟田土壤中分离获得。

见图1，图2所示。进一步，本发明该细菌的培养基为牛肉膏蛋白胨培养基。

进一步，本发明该细菌用于防治植物线虫病。

进一步，本发明该细菌的发酵液用于防治植物线虫病。在大田里具有显著地防治植物线虫病的效果。

本发明所述细菌的应用，该细菌的发酵液的制备方法包括：配制牛肉膏蛋白胨液体培养基→灭菌→冷却→接种→摇床200-300rpm发酵12-72小时→收集菌液。

见图5、图6所示；进一步，本发明该细菌的发酵液的施用方法包括：

a、在作物栽培时，在土壤中挖与苗根大小相对应的栽培穴，放入小苗，将发酵好的菌液浇在植物的根部，菌液用量根据根的大小为10ml-100ml/株；或，

b、将发酵好的菌液和任意比例的浇根用水混合后，在作物栽培时，浇入栽培穴中，或者是覆土后进行浇灌；或，

c、将发酵好的菌液加入灭菌后的麦麸，低温干燥后制成菌粉，在栽培植物时，将干燥的菌粉施用于田间；或，

d、将发酵好的菌液加入灭菌后的麦麸，低温干燥后制成菌粉，将菌粉在营养液中活化后，在栽培时浇入植物的根部；或，

e、将发酵好的菌液进行冷冻干燥后制成纯的菌粉，在栽培植物时，直接施用干燥的纯的菌粉；或，

f、将发酵好的菌液进行冷冻干燥后制成纯的菌粉，将纯的菌粉和其它物质混合后施用；或，

g、将发酵好的菌液进行冷冻干燥后制成纯的菌粉，将菌粉活化后，将含有活化菌的菌液浇在植物的根部。

进一步，本发明该细菌的发酵液的施用方法不包括在根部施用杀细菌剂药物。

进一步，本发明该细菌的发酵液的施用方法包括与其它线虫生防菌剂进行复合使用。

图5，施用j211菌液后，烟草虽然受到轻度的根结线虫侵染，但是须根系依然明显。

图6，未施用菌液的空白对照，烟草根系受到根结线虫侵染严重，根系膨大明显。

见图4所示。洋葱伯克氏菌群中的部分种类可能存在bcesm基因的遗传连锁标记，该毒力基因只存在于致病性菌株中。针对bcesm基因设计引物bcesm1：5'-ccacggacgtgactaaca-3'；bcesm2：5'-cgtccatccgaacacgat-3'，扩增片段长度为1418bp。电泳结果可以看出在1400bp左右的位置上没有目的条带的出现，证明j211不含毒力基因bcesm。m：2000bpmarker，1-4：j211

有此得知，本发明的菌株十分安全的，不含对人致病的基因。

上述实验结论由以下实验步骤得来，但以下实施例不构成对本发明保护范围的限定。本发明主要关键技术点在于：1.阿伯氏伯克氏菌株j211；2.菌株是安全的，不含对人致病的基因；3.线虫防治大田使用效果好。

实施例一

按常规要求整理好烟田土壤。选取健壮、整齐、株高10cm左右的烟苗，株距50cm,窝深15cm。在每个烟苗栽培的穴内，先施入10ml伯克氏菌burkholderiaarborisj211菌株菌液，然后将烟草按照烟苗栽培规范进行覆土、浇水等措施进行管理，可以见烟苗正常生长。可以烟株生长后，看到线虫防治的效果。

实施例二

选取正常生长的番茄苗，在根旁开挖小穴，深到侧根处。在每个穴内，施入50ml伯克氏菌burkholderiaarborisj211菌株菌液然后覆土，然后按菜苗正常管理方法进行管理即可，可见菜苗正常生长。

实施例三

按常规要求整理好烟田土壤。选取健壮、整齐、株高10cm左右的烟苗，株距50cm,窝深15cm。在每个烟苗栽培的穴内，先施入100ml伯克氏菌burkholderiaarborisj211菌株菌液，然后将烟草按照烟苗栽培规范进行覆土、浇水等措施进行管理，可以见烟苗正常生长。可以烟株生长后，看到线虫防治的效果。

实施例四

按常规要求整理好烟田土壤。选取健壮、整齐、株高10cm左右的烟苗，株距50cm,窝深15cm。在每个烟苗栽培的穴内，先将伯克氏菌burkholderiaarborisj211菌株菌液冻干菌粉1克，溶解于浇根水1升中，然后将烟草按照烟苗栽培规范进行覆土、浇水等措施进行管理，可以见烟苗正常生长。可在烟株生长后，看到线虫防治的效果。

实施例五

按常规要求整理好烟田土壤。选取健壮、整齐、株高10cm左右的烟苗，株距50cm,窝深15cm。然后将烟草按照烟苗栽培规范进行覆土、浇水等措施进行管理，可以见烟苗正常生长。在每个烟苗栽培的穴内，先施入20ml伯克霍尔德氏菌burkholderiaarborisj211菌株菌液，并在烟株定植后，在三个不同时期，每次将10ml菌液用90ml清水稀释后灌根，其余按烟株正常管理方法进行管理即可。

以上所述的仅是本发明的具体实施例，方案中公知的具体特性等常识在此未作过多描述。应当指出，上述实施例不以任何方式限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

<110>云南大学

<120>一种伯克氏菌及其该伯克氏菌的应用

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<212>dna

<213>人工序列

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<211>18

<212>dna

<213>人工序列

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