一株发酵乳杆菌及其强化发酵米粉的方法与流程

本发明涉及一株发酵乳杆菌及其强化发酵米粉的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术：

米粉是中国著名的传统食品之一，它有超过2000年的历史。米粉作为大米加工产品，在我国乃至东南亚各国都十分受欢迎，消耗量巨大，已然成为日常生活中主食的重要替代品。米粉的分布广泛，形式多样，因其地域不同，米粉的制作方法，食用品质也都不尽相同。随着人们生活水平的提高，米粉的消费前景广阔，近年来市场及研究都加大了对米粉的关注，以期推动米粉产品向品质更好，更适应市场需求的方向发展。

直至今日，米粉的生产工艺已经十分成熟，但大部分是针对非发酵米粉设计，少数涉及发酵的生产也缺乏专业的控制，多依靠经验进行。对于米粉发酵的机理国内已有一定程度的探究，研究主要集中在发酵过程中原料理化组分变化、微生物组成，以及发酵对米粉口感品质的提升等方面。中国农业大学李里特教授团队对米粉发酵机理进行了比较深入且系统的研究。研究指出米粉自然发酵中微生物主要为乳酸菌和酵母菌，微生物所产乳酸及各种酶能够降解大米中蛋白、脂肪，促使灰分溶出、水解支链淀粉无定形区，从而起到纯化淀粉的作用，最终在产品上体现为米粉凝胶拉伸性能增强，米粉筋道感增加。显然，由于自然发酵微生物组成复杂，影响因素复杂多样，因此很难做到有效控制，相反，利用合适的微生物进行强化发酵，在优化米粉品质的同时，能够实现对产品品质的控制，提高工业生产的稳定性。此外，自然发酵中常常出现发臭、长霉等情况。长霉会增加原料损耗，同时给食品生产带来安全风险；而发臭则会增加用于原料清洗和离心的生产成本。因此要开发更高效稳定的发酵米粉生产体系，需要找到在风味形成和抑菌方面都具有优越特性的菌株。

技术实现要素：

针对现有的技术难点及存在的问题，本发明提供了一种用于米粉发酵的发酵乳杆菌及其发酵米粉的方法。

本发明的第一个目的是提供一种用于米粉发酵的发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)stb11，已于2019年10月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccm2019794，保藏单位地址为中国武汉，武汉大学。

本发明的第二个目的是提供一种微生物制剂，含有≥1×10⁶cfu/ml或1×10⁶cfu/g发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)stb11。

在一种实施方式中，所述微生物制剂是发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)stb11在mrs培养基中培养获得的。

本发明的第三个目的是提供一种应用所述发酵乳杆菌stb11发酵米粉的方法，是将发酵乳杆菌stb1发酵液和大米以1：(90～110)的比例混合后，研磨成粉，进行发酵；再将发酵产物调至成米浆，熟化并挤压成型。

在一种实施方式中，所述发酵乳杆菌的发酵液是按如下方法制备：将发酵乳杆菌stb11接种至mrs培养基中，35～37℃活化16～24h；再将活化后的stb11以0.5～2％的接种量接种到mrs培养基中培养至少6h得到发酵液。

在一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：

(1)将发酵乳杆菌stb11接种至mrs培养基中，37℃、200r/min活化24h；

(2)将活化后的stb11以1％的接种量接种到mrs培养基中培养6h得到发酵液；

(3)将晚籼米清洗干净，浸泡3h后沥干；

(4)将发酵液和大米以1：90～110的比例混合后，研磨成粉，进行发酵；

(5)向发酵产物中加入35～45％(w/w)水及一定比例的ph调节剂调制成米浆，过胶体膜研磨至无颗粒感，入蒸汽式米粉机熟化并挤压成型。

在本发明的一种实施方式中，mrs培养基的成分为蛋白胨10g，牛肉浸粉5g，酵母浸粉4g，葡萄糖20g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸三铵2g，乙酸钠5g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温801g，ph＝6.2±0.02(25℃)。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵液和大米粉的混合比例为1：99。

在一种实施方式中，发酵是在25～37℃持续1～6d。

在本发明的一种实施方式中，ph调节剂种类为碳酸钠和碳酸钾。

在本发明的一种实施方式中，ph调节剂的添加比例为0-0.20％(与原料的干基质量比)。

本发明的还要求保护所述发酵乳杆菌在制备以米粉为原料的发酵食品中的应用。

本发明的还要求保护所述菌株或其发酵方法在食品发酵、饲料制备中的应用。

本发明的有益效果：

应用本发明的发酵乳杆菌进行发酵的产品在长达6d的发酵周期中，原料中霉菌始终控制在≤150cfu/g，没有发生霉菌超标情况，而采用自然发酵和其他菌株发酵时，发酵三天后内均出现了霉菌超标的情况；同时，本发明的发酵乳杆菌发酵的产品质构性质接近自然发酵，蒸煮、感官品质以及气味明显优于自然发酵。此外，本发明提出了一种全新的发酵米粉生产工艺，工艺省略了发酵后原料清洗环节，简单高效，有广阔的应用前景。

生物材料保藏

发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)stb11，分类命名为lactobacillusfermentumstb11；已于2019年10月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccm2019794，保藏单位地址为中国武汉，武汉大学。

附图说明

图1为stb11菌株细胞显微观察结果；

图2为菌株l.fermentumstb11生长曲线；

图3为发酵样品风味喜好度评价；

图4为发酵温度对l.fermentumstb11强化发酵米粉风味的影响；l.f：采用l.fermentumstb强化发酵的样品；l.p：采用分离的l.plantarum强化发酵的样品；后缀表示发酵的温度。样品间的距离越远，表明样品的风味差异越大。判别因子(discriminationindex为负值说明存在风味无法区分的两个样品)

图5为发酵时间对l.fermentumstb11强化发酵米粉风味的影响；样品间的距离越远，表明样品的风味差异越大。

图6为两款添加剂在原料酸味去除中的应用效果。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行进一步的阐述。

发酵培养基：mrs培养基，成分为蛋白胨10g，牛肉浸粉5g，酵母浸粉4g，葡萄糖20g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸三铵2g，乙酸钠5g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温801g，ph＝6.2±0.02(25℃)。

风味测定方法：

样品处理：电子鼻分析采用顶孔萃取进样法。称取3～5g样品于顶孔进样品中，轻微震荡，使样品在管底铺平，静置30min后进样。每个样品设置3个平行。

电子鼻测定条件：采样时间1s/组；传感器自清洗时间60s；传感器归零时间10s；样品准备时间5s；进样流量400ml/min；分析采样时间120s。采用主成分分析法(pca)和判别因子分析法(dfa)对原始数据进行分析。

ph及可滴定酸度(tta)测定方法：

取10g传统发酵样品，加入90ml蒸馏水，使用磁力搅拌器充分搅拌混匀，用校准后的酸度计测定其ph值。使用0.1mol/lnaoh溶液滴定上述溶液，至其ph值为8.6。tta即为上述步骤消耗的naoh溶液的体积(ml)。重复三次实验，最终结果取三次实验平均值。

酸度值测定方法：

将碳酸钠和碳酸钾以一定的比例添加到调制好的米浆(即将用于挤压的原料)中充分溶解和混匀，3500rpm离心3min，取上清采用电子舌进行酸味值的测定。

糊化曲线测定方法：

称取20g发酵后的大米粉，加入同等质量的去离子水，用胶体磨研磨，然后置于-80℃冷冻，用真空冷冻干燥机干燥72h(-20℃，15pa)，研钵轻轻捣碎后过100目筛，用密封袋盛装置于干燥器中保存。使用前测定水分含量。

采用快速粘度分析仪(rapidlyviscosityanalyzer,rva)测定样品的糊化特性。称取一定质量样品，与去离子水混合于rva铝盒中，配制成6g/100g(以干基计)的悬浮液。采用rva标准程序2进行测定。以峰值粘度和回升值表征原料的加工性质变化。

质构测定方法：

米粉质构测定模式为tpa，测定参数设置为：测前速度1.0mm/s，测中速度1.0mm/s，测后速度1.0mm/s，压缩比70％，平行测定次数10次/样。测定指标包括：硬度、粘性、弹性、咀嚼性、凝聚性、回复性等。

感官评定方法：

喜好度评定采用排序法，感官评定人员10人，具体参照gbt12315-2008标准。描述性检验评定打分采用五分制，具体评定内容及评定标准如表1：

表1米粉描述性检验评价方法

评分制度(5分制喜好度评分)：1：不喜欢；2：不太喜欢；3：不喜欢，也不讨厌；4：比较喜欢；5：非常喜欢。

实施例1发酵菌株的筛选

从广西桂林米粉门店采集发酵样品。称取1g样品放入无菌均质袋，加入10ml无菌生理盐水，拍打均质10min。再取均质液进行梯度稀释(10¹、10²、10³、10⁴、10⁵和10⁶)，各取100μl涂布在添加0.1g/l放线菌酮的mrs培养基平板上，置30℃培养2d。观察菌落生长情况，选取形态不同的菌落作为初筛菌株，接种到发酵培养基中，30℃，200r/min，振荡培养3天。培养液经过12000r/min离心5min，收集菌泥，用于后续菌种鉴定。

实施例2发酵乳杆菌菌株的鉴定及生长曲线测定

(1)发酵乳杆菌菌株的鉴定：

发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)的菌落表型特征为菌落边缘不规则，表面光滑、呈微黄色、较湿润、半透明、易挑起、不起皱，显微镜下菌体为短杆状，无芽孢；生理生化特征为革兰氏染色镜检呈阳性，过氧化氢酶试验呈阴性。接种符合上述特征的菌株stb11至mrs培养基中(stb11菌株显微镜检结果如图1所示)，30℃培养过夜，提取该菌的总dna作为pcr模板。采用细菌16srdna通用引物27f和1492r进行pcr扩增，pcr扩增条件：95℃5min,94℃30s,55℃30s,72℃90s,循环34次；72℃10min。将pcr扩增产物连接pmd18-t载体构建重组质粒，琼脂糖电泳检测后进行测序，测序结果显示，该菌株的16srdna与genbank数据库中发酵乳杆菌lactobacillusfermentum的16srdna有极高的同源性。然后用clustalw2.0软件进行多重序列比对分析，最后用mega7.0软件(neighbor-joining法)构建系统发育树，结果显示stb11系统发育进化树与lactobacillusfermentum也呈现出稳定的亲缘关系。结合菌株的形态特征、16srdna序列比对及系统发育树分析，初步将该菌株鉴定为乳杆菌目(lactobacillales)乳杆菌科(lactobacillaceae)乳杆菌属(lactobacillus)发酵乳杆菌种(lactobacillusfermentum)，并保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccm2019794，保藏地址为中国武汉，武汉大学。

(2)菌株生长曲线测定

挑取stb11菌株接种到mrs培养基中，37℃、静置活化培养24h。将活化后的stb11以1％的接种量接种到mrs培养基中，37℃静置培养，每隔2h取样一次测定发酵液od600，并据此绘制菌株生长曲线。stb11生长曲线如图2所示，可以看出，stb11在2h之内就已经进入对数生长期，在第8h之前一直处于快速增殖状态，8h后菌浓度达到饱和，即发酵乳杆菌菌株stb11的对数生长期为2～8h，菌体浓度达10⁷cfu/ml。

实施例3发酵米粉的制备

挑取单菌落接种至mrs培养基中，37℃、200r/min活化24h，将活化后的菌液以1％的接种量接种到mrs中培养10h得到对数生长期发酵液。将晚籼米清洗干净，清洗浸泡3h后沥干，加入stb11发酵液后粉碎成粉，分别在25℃、30℃和37℃下发酵1-6d，向发酵产物中加入40％(w/w)的水及一定比例的ph调节剂调制成米浆，过胶体膜研磨至无颗粒感，入蒸汽式米粉机熟化并挤压成型。

以另外一株不同来源的发酵乳杆菌(l.fermentum，购买自商城北纳创联生物技术有限公司，菌株编号：bncc194390)为对照，按照上述相同的方法制备发酵米粉。

实施例4发酵样品风味喜好度评价

按照前文所述方法对实施例3在30℃发酵后的原料进行风味喜好度评价。如图3所示，发酵乳杆菌强化发酵的样品风味喜好度均显著高于自然发酵(得分：2.2分)(p<0.05)，其中l.fermentumstb11得分达3.5，略高于l.fermentumbncc194390(得分：3.4)。

实施例5不同发酵方案抑制霉菌效果对比

模拟传统桂林米粉固态发酵条件，即30℃发酵3d，进行自然发酵和强化发酵，比较不同发酵方式下样品的酸度及霉菌含量，其中自然发酵利用原料中自带的菌群进行发酵，强化发酵则是在发酵开始前分别接入1％(v/w)的l.fermentumbncc194390、l.fermentumstb11菌液进行发酵。表3展示了为期3d的发酵过程中，原料中相关指标的测定结果。结果显示，l.fermentumstb11(ph＝3.57，tta＝1.35)比l.fermentum(ph＝3.62，tta＝1.10)具有更强的产酸能力。此外，自然发酵和l.fermentum强化发酵的菌株在发酵三天内都出现了霉菌超标的情况(gb7099-2015规定霉菌应该控制在≤150cfu/g)，相反菌株发酵乳杆菌stb11显示出良好的霉菌抑制效果，在发酵过程中都没有发生霉菌超标情况。发酵乳杆菌stb11优越的霉菌抑制特性可能与其产酸能力及产酸种类存在联系。

表2发酵样品生化指标测定

注：根据gb7099-2015规定，霉菌数量≤150cfu/g视为未超标。

实施例6发酵温度对l.fermentumstb11强化发酵米粉风味的影响

具体实施方式同实施例5，区别在于，将发酵温度分别设置为25℃、30℃、37℃3个温度梯度，比较不同发酵温度下米粉风味的变化。图4展示了不同发酵温度条件下样品的风味变化(以分离的植物乳杆菌l.plantarum为对照)。样品在二维图谱上的距离代表了两者在风味上的近似度。对比发酵乳杆菌(l.fermentum)stb11和植物乳杆菌(l.plantarum)的发酵结果，可以看出在不同温度下发酵乳杆菌发酵风味的相似性要明显高于植物乳杆菌，其在25℃、30℃和37℃发酵样品的风味通过电子鼻无法区分，发酵风味受温度变化的影响小；同时观察同组样品的平行性发现，30℃和37℃发酵样品的风味更为稳定，因此于37℃和30℃为发酵乳杆菌强化发酵的合适温度，但从经济角度考虑，30℃为更理想的stb11发酵米粉的发酵温度。

实施例7l.fermentumstb11强化发酵原料风味变化

具体实施方式同实施例5，区别在于，将发酵时间设置为1～6d不等(以0d为空白对照)，比较不同发酵时间下stb11发酵米粉风味的变化。如图5所示，两个样品在二位图谱上的距离即表征了两者在风味上的差别，距离越近，代表风味越相似。从图中可以看出样品发酵一天后风味就产生了很大改变；前三天样品发酵气味都较为接近，样品散发出香甜的发酵风味；发酵进行到第四天，样品的风味开始发生阶段性变化，通过感官嗅闻发现，这种变化体现为样品气味变酸；之后，风味的变化继续加大，酸味也越来约明显。因此，从风味方面考虑，发酵乳杆菌stb11发酵米粉的发酵周期不应超过3d。

实施例8l.fermentumstb11强化发酵原料淀粉性质变化

具体实施方式同实施例7，比较不同发酵时间下原料淀粉性质的变化。表4展示了样品在为期6d的发酵过程中原料淀粉性质的变化。观察数据发现，发酵进行到第三天，原料的糊化峰值粘度变化减缓，而回升值在两天后变化就已经减缓，反映出原料微观结构的变化主要发生在前三天。综合实施例7的结果，发酵乳杆菌stb11发酵米粉的最适发酵周期确定为3d。

表3lactobacillusfermentumstb11强化发酵对原料淀粉性质的影响

实施例9两款添加剂在原料酸味去除中的应用效果

虽然l.fermentumstb11强化发酵的样品风味良好，且不会滋生霉菌，但强化发酵过程中会积累有机酸，给产品带来酸味，因此考虑好需要采用碳酸钠和碳酸钾这两种食品中可用的ph调节剂(参照gb2760-2014，碳酸钠的最大使用量为60g/kg，碳酸钾可按生产需要适量使用)去除发酵带来的酸味。分别按照0、0.05％、0.10％、015％、0.20％(原料干基质量比)的添加量向发酵好的大米粉中加入碳酸钠或碳酸钾，以2:5的比例加水调制成米浆，3500rpm/min离心取上清，利用电子舌测定上清液的酸味值。

如图6所示，自然发酵和发酵乳杆菌强化发酵后的酸味值相当，分别为0.56和-0.06，添加ph调节剂后，酸度随调节剂浓度增加而下降，碳酸钠和碳酸钾添加量在达到0.10％(与原料的干基质量比)时，都能有效去除样品的酸味(当酸度值小于-13时，表示样品没有酸味)。从酸味的去除效果来看，碳酸钠的效果优于碳酸钾，同时结合相关限量标准，选择0.10％碳酸钠最为合适。基于以上工艺，发酵后的原料无需进行清洗，节约了生产中的水及能耗，简化了生产工艺，具有极大的应用价值。

实施例10发酵米粉品质评价

按照实施例3的方法于30℃进行自然发酵和强化发酵(l.fermentumstb11)，发酵过程持续3d，比较不同发酵方式对米粉品质的影响。分析表5数据可知，发酵乳杆菌stb11强化发酵三天后的样品，其质构性质接近自然发酵，蒸煮及感官品质优于空白及自然发酵，并且，发酵乳杆菌强化发酵的样品在气味上具有明显优势。

表4发酵米粉品质评价

a：为了突出发酵对产品风味的影响，在挤压成形前，发酵原料未经清洗，自然发酵的样品由于气味难闻，无法进行感官评价。b：气味的秩次代表气味接受度排名，秩次越小，表示气味的接受度越高。

实施例11发酵米粉工艺

综合实施例2-10，可以得到一条全新高效的发酵米粉生产工艺，工艺的具体步骤如下：

(1)大米清洗除杂后浸泡3h；

(2)沥干水分，添加1％(v/w)l.fermentumstb11对数生长期菌液，粉碎混匀后置30℃发酵3d；

(3)向原料中添加碳酸钠0.10％(与原料的干基质量比)及水(40％，w/w)，入胶体磨研磨至无颗粒感；

(4)采用蒸汽糊化挤压工艺成型，机器型号：广州金本机械设备有限公司，yc-30型米粉机；机器预热：5min；挤压温度：105℃，获得条状米粉。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。