一种天麻素作为α-葡萄糖苷酶抑制剂及其应用的制作方法

本发明涉及功能食品因子分析提取技术领域，尤其涉及天麻素提取物作为α-葡萄糖苷酶抑制剂在降血糖食品或保健食品中的用途及其制备方法。

背景技术：

天麻是兰科天麻属多年生草本寄生植物，具有肥厚的根状茎，其根状茎入药用以治疗头晕目眩、肢体麻木和小儿惊风等病症，是名贵中药，与琼珍灵芝合用用于治疗头痛、失眠。天麻块茎的主要药用成分为天麻素，天麻素从天麻的块茎中提取。天麻素能显著降低高糖刺激下huvecs胞外ldh的活性，减轻高糖对血管内皮细胞造成的损伤；天麻素能显著降低糖尿病小鼠的血糖，降低小鼠血清中甘油三酯、总胆固醇及丙二醛浓度，提高超氧化物歧化酶（sod）的活性，显示出明显的抗糖尿病作用。

传统的提取方法主要有煎煮法、浸渍法、回流提取法等。煎煮法方便易行，但煎出液中的杂质较多，易发生霉变、腐败，一些不耐热或挥发性成分在煎煮的过程中容易被破坏、挥发和损失。浸渍法是比较简便，但操作时间比较长，有效成分往往不易完全的浸出。回流提取法是采用乙醇等易挥发的有机溶剂提取药材成分，将浸出液加热蒸馏，其中挥发性溶剂馏出后又被冷凝，重复流回浸出器中浸提药材，直至有效成分回流提取完全的方法。

传统的提取方法往往存在提取工艺复杂、溶剂需要量大、成本高、提取率低等缺点。连续式低温高压破碎提取技术是在低温或常温的条件下，利用高压作用使液体样品高速通过狭窄的缝隙时受到强大的剪切力、撞击、湍流作用及在压力瞬间释放产生的空化效果等作用效果总和，使得细胞瞬间膨胀并破碎，促进细胞内有效成分溶出。目前，现有技术并未公开连续式低温高压破碎提取天麻中天麻素的方法。发明人长期研究、优化天麻素提取制备工艺，在大量的试验研究中惊喜地发现，先用绿色木霉对粉碎的葛根药材进行固体发酵处理，然后再进行提取，可大大提高天麻素的提取收得率，为天麻素单体的制备提供了含量高、质量好、成本低的天麻素提取物，从而完成了本发明。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种天麻素提取物作为α-葡萄糖苷酶抑制剂及其在特膳食品中的应用，通过先用绿色木霉对粉碎的葛根药材进行固体发酵处理，然后再进行提取，对其进行α-葡萄糖苷酶抑制活性、抑制动力学和热力学实验，揭示抑制作用机制，为天麻的的开发和利用提供实验和理论依据，同时得到一种天然海洋来源的经济、安全的α-葡萄糖苷酶抑制剂。

为了实现上述目的，本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：

一种天麻素提取物作为α-葡萄糖苷酶酶抑制剂及其在特膳食品中的应用，以天麻素提取物作为活性成分之一或唯一的活性成分用于制备α-葡萄糖苷酶抑制剂。

一种天麻素提取物作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的用途，以天麻素提取物作为活性成分之一或唯一的活性成分用于降低餐后血糖水平。

所述天麻素提取物的制备工艺包括用绿色木霉对天麻药材进行固体发酵的步骤，包括以下步骤：

(1)将干天麻药材进行干热灭菌处理；

(2)将灭菌处理后的天麻药材粉粹后加水拌匀成湿料；

(3)加入综合马铃薯培养基、绿色木霉菌悬液，混匀；

(4)进行固体发酵4-8天，得发酵料；

(5)发酵料经干燥、碾碎后用乙醇进行提取，提取液经浓缩后即得天麻素提取物。

天麻素提取物的制备工艺，优选地：

(1)将干天麻药材置于灭菌锅中于90-125℃干蒸60-120min进行干热灭菌处理；

(2)将灭菌处理后的天麻药材粉粹成40-80目粗粉，喷洒药材重量2-2.5倍的水拌匀成湿料；

(3)加入综合马铃薯培养基、绿色木霉菌悬液，混匀；

(4)于20-30℃、80-95％相对湿度条件下进行固体发酵5-6天，得发酵料；

(5)发酵料经干燥、碾碎后用乙醇-水溶液或甲醇-水溶液回流提取3次，提取液经浓缩后即得天麻素提取物；所述乙醇-水溶液或甲醇-水溶液其中乙醇或甲醇的重量百分含量≥92％。

所述综合马铃薯培养基每1000ml的制备方法为：取去皮马铃薯150-250g，切成小块，加水1000ml煮沸15-25min，然后滤去马铃薯块，再加入葡萄糖10-30g、琼脂15-30g、kh2po42-5g、硫胺素5-10mg、mgso4·7h2o1-3g，溶化后补足水至1000ml，经121℃灭菌10-20min；

所述绿色木霉菌悬液每100ml的制备包括以下步骤：

(1)菌种的复苏及扩大培养：用无菌吸管吸取0.5ml液体培养基，滴入盛有绿色木霉冻干菌种的安瓿内，轻轻振荡，使冻干菌种溶解呈悬浮状，吸取100μl菌体悬浮液，移植于斜面培养基上，并在25-32℃相应的温度下培养、活化；

(2)将已活化的菌种接入100ml综合马铃薯培养基中，于25-32℃，转速为10⁵r/min的恒温振荡培养箱进行扩大培养2-4d，即得绿色木霉的菌悬液。

所述综合马铃薯培养基、绿色木霉菌悬液的加量比例为：每100g干天麻药材加综合马铃薯培养基100ml、绿色木霉菌悬液5ml；所述固体发酵在26-28℃、92-94％相对湿度条件下进行。所述的天麻素用于制备降血糖的液体制剂、粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、口服液等食品或保健之中

本发明的有益效果如下：

(1)本发明所述制备方法提取天麻素的方法限定各种临界条件能显著提高天麻素的提取率和天麻素提取物中的天麻素含量。

(2)本发明所述的α-葡萄糖苷酶抑制剂是天麻素属于2018年新添加的既是食品又是药品物品名单，天麻资源丰富，天麻素制备工艺简单，容易产业化。

(3)本发明所述的天麻素抑制α-葡萄糖苷酶活性的动力学和热力学实验数据，将为其应用于降糖食品、药品的开发领域提供可靠的理论依据，也将为天麻资源高值利用和研究安全、经济、海洋来源的α-葡萄糖苷酶抑制剂提供新途径。

(4)本发明所述的天麻素作为抑制剂可以较好的抑制α-葡萄糖苷酶的活性，抑制率最高可达90.3％，同比市售药物阿卡波糖的抑制率高出16.4％。

说明书附图

图1为天麻素提取物对α-葡萄糖苷酶酶活力的抑制作用；

图2为本发明天麻素提取物对α-葡萄糖苷酶抑制机理的测定；

图3为本发明天麻素提取物对α-葡萄糖苷酶抑制类型及抑制常数的测定。具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

实施例1

一种天麻素提取物作为α-葡萄糖苷酶酶抑制剂的用途，以天麻素提取物作为活性成分之一或唯一的活性成分用于制备α-葡萄糖苷酶抑制剂。

一种天麻素提取物作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的用途，以天麻素提取物作为活性成分之一或唯一的活性成分用于降低餐后血糖水平。

所述天麻素提取物的制备工艺包括用绿色木霉对天麻药材进行固体发酵的步骤，包括以下步骤：

(1)将干天麻药材进行干热灭菌处理；

(2)将灭菌处理后的天麻药材粉粹后加水拌匀成湿料；

(3)加入综合马铃薯培养基、绿色木霉菌悬液，混匀；

(4)进行固体发酵4天，得发酵料；

(5)发酵料经干燥、碾碎后用乙醇进行提取，提取液经浓缩后即得天麻素提取物。

天麻素提取物的制备工艺，优选地：

(1)将干天麻药材置于灭菌锅中于90℃干蒸60min进行干热灭菌处理；

(2)将灭菌处理后的天麻药材粉粹成40目粗粉，喷洒药材重量2倍的水拌匀成湿料；

(3)加入综合马铃薯培养基、绿色木霉菌悬液，混匀；

(4)于20℃、80％相对湿度条件下进行固体发酵5天，得发酵料；

(5)发酵料经干燥、碾碎后用乙醇-水溶液或甲醇-水溶液回流提取3次，提取液经浓缩后即得天麻素提取物；所述乙醇-水溶液或甲醇-水溶液其中乙醇或甲醇的重量百分含量≥92％。

所述综合马铃薯培养基每1000ml的制备方法为：取去皮马铃薯150g，切成小块，加水1000ml煮沸15min，然后滤去马铃薯块，再加入葡萄糖10g、琼脂15g、kh2po42g、硫胺素5mg、mgso4·7h2o1g，溶化后补足水至1000ml，经121℃灭菌10min；

所述绿色木霉菌悬液每100ml的制备包括以下步骤：

(1)菌种的复苏及扩大培养：用无菌吸管吸取0.5ml液体培养基，滴入盛有绿色木霉冻干菌种的安瓿内，轻轻振荡，使冻干菌种溶解呈悬浮状，吸取100μl菌体悬浮液，移植于斜面培养基上，并在25-32℃相应的温度下培养、活化；

(2)将已活化的菌种接入100ml综合马铃薯培养基中，于25℃，转速为10⁵r/min的恒温振荡培养箱进行扩大培养2d，即得绿色木霉的菌悬液。

所述综合马铃薯培养基、绿色木霉菌悬液的加量比例为：每100g干天麻药材加综合马铃薯培养基100ml、绿色木霉菌悬液5ml；所述固体发酵在26℃、92％相对湿度条件下进行。实验重复三次，取其结果的平均值，得到天麻素提取率为0.72mg/g(以没食子酸当量计)。

实施例2

一种天麻素提取物作为α-葡萄糖苷酶酶抑制剂的用途，以天麻素提取物作为活性成分之一或唯一的活性成分用于制备α-葡萄糖苷酶抑制剂。

一种天麻素提取物作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的用途，以天麻素提取物作为活性成分之一或唯一的活性成分用于降低餐后血糖水平。

所述天麻素提取物的制备工艺包括用绿色木霉对天麻药材进行固体发酵的步骤，包括以下步骤：

(1)将干天麻药材进行干热灭菌处理；

(2)将灭菌处理后的天麻药材粉粹后加水拌匀成湿料；

(3)加入综合马铃薯培养基、绿色木霉菌悬液，混匀；

(4)进行固体发酵6天，得发酵料；

(5)发酵料经干燥、碾碎后用乙醇进行提取，提取液经浓缩后即得天麻素提取物。

天麻素提取物的制备工艺，优选地：

(1)将干天麻药材置于灭菌锅中于100℃干蒸80min进行干热灭菌处理；

(2)将灭菌处理后的天麻药材粉粹成60目粗粉，喷洒药材重量2.5倍的水拌匀成湿料；

(3)加入综合马铃薯培养基、绿色木霉菌悬液，混匀；

(4)于30℃、95％相对湿度条件下进行固体发酵6天，得发酵料；

(5)发酵料经干燥、碾碎后用乙醇-水溶液或甲醇-水溶液回流提取3次，提取液经浓缩后即得天麻素提取物；所述乙醇-水溶液或甲醇-水溶液其中乙醇或甲醇的重量百分含量≥92％。

所述综合马铃薯培养基每1000ml的制备方法为：取去皮马铃薯150g，切成小块，加水1000ml煮沸15min，然后滤去马铃薯块，再加入葡萄糖20g、琼脂20g、kh2po43g、硫胺素7mg、mgso4·7h2o2g，溶化后补足水至1000ml，经121℃灭菌15min；

所述绿色木霉菌悬液每100ml的制备包括以下步骤：

(1)菌种的复苏及扩大培养：用无菌吸管吸取0.5ml液体培养基，滴入盛有绿色木霉冻干菌种的安瓿内，轻轻振荡，使冻干菌种溶解呈悬浮状，吸取100μl菌体悬浮液，移植于斜面培养基上，并在25-32℃相应的温度下培养、活化；

(2)将已活化的菌种接入100ml综合马铃薯培养基中，于30℃，转速为10⁵r/min的恒温振荡培养箱进行扩大培养2-4d，即得绿色木霉的菌悬液。

所述综合马铃薯培养基、绿色木霉菌悬液的加量比例为：每100g干天麻药材加综合马铃薯培养基100ml、绿色木霉菌悬液5ml；所述固体发酵在27℃、93％相对湿度条件下进行；实验重复三次，取其结果的平均值，得到天麻素提取率为0.69mg/g(以没食子酸当量计)。

实施例3

一种天麻素提取物作为α-葡萄糖苷酶酶抑制剂的用途，以天麻素提取物作为活性成分之一或唯一的活性成分用于制备α-葡萄糖苷酶抑制剂。

一种天麻素提取物作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的用途，以天麻素提取物作为活性成分之一或唯一的活性成分用于降低餐后血糖水平。

所述天麻素提取物的制备工艺包括用绿色木霉对天麻药材进行固体发酵的步骤，包括以下步骤：

(1)将干天麻药材进行干热灭菌处理；

(2)将灭菌处理后的天麻药材粉粹后加水拌匀成湿料；

(3)加入综合马铃薯培养基、绿色木霉菌悬液，混匀；

(4)进行固体发酵8天，得发酵料；

(5)发酵料经干燥、碾碎后用乙醇进行提取，提取液经浓缩后即得天麻素提取物。

天麻素提取物的制备工艺，优选地：

(1)将干天麻药材置于灭菌锅中于125℃干蒸120min进行干热灭菌处理；

(2)将灭菌处理后的天麻药材粉粹成80目粗粉，喷洒药材重量2.5倍的水拌匀成湿料；

(3)加入综合马铃薯培养基、绿色木霉菌悬液，混匀；

(4)于30℃、95％相对湿度条件下进行固体发酵6天，得发酵料；

(5)发酵料经干燥、碾碎后用乙醇-水溶液或甲醇-水溶液回流提取3次，提取液经浓缩后即得天麻素提取物；所述乙醇-水溶液或甲醇-水溶液其中乙醇或甲醇的重量百分含量≥92％。

所述综合马铃薯培养基每1000ml的制备方法为：取去皮马铃薯250g，切成小块，加水1000ml煮沸25min，然后滤去马铃薯块，再加入葡萄糖30g、琼脂30g、kh2po45g、硫胺素10mg、mgso4·7h2o3g，溶化后补足水至1000ml，经121℃灭菌20min；

所述绿色木霉菌悬液每100ml的制备包括以下步骤：

(1)菌种的复苏及扩大培养：用无菌吸管吸取0.5ml液体培养基，滴入盛有绿色木霉冻干菌种的安瓿内，轻轻振荡，使冻干菌种溶解呈悬浮状，吸取100μl菌体悬浮液，移植于斜面培养基上，并在32℃相应的温度下培养、活化；

(2)将已活化的菌种接入100ml综合马铃薯培养基中，于32℃，转速为10⁵r/min的恒温振荡培养箱进行扩大培养4d，即得绿色木霉的菌悬液。

所述综合马铃薯培养基、绿色木霉菌悬液的加量比例为：每100g干天麻药材加综合马铃薯培养基100ml、绿色木霉菌悬液5ml；所述固体发酵在28℃、94％相对湿度条件下进行；实验重复三次，取其结果的平均值，得到天麻素提取率为0.72mg/g(以没食子酸当量计)。

为了验证天麻素抑制α-葡萄糖苷酶活性作用，以市售药物阿卡波糖做阳性参照，测试以pnpg作为模型底物，测试不同浓度的天麻素对α-葡萄糖苷酶活性抑制，具体如实施例11。进一步揭示天麻素对α-葡萄糖苷酶的抑制作用机制，分别利用酶促反应动力学和小分子与蛋白相互作用的热力学荧光方法进行实验考证，具体为试验例1～3。试验例1

将本发明提取得到的天麻素与阿卡波糖进行α-葡萄糖苷酶活性抑制测定，测定结果如图1所示，天麻素浓度0.0025mg/ml到0.0175mg/ml范围内，α-葡萄糖苷酶的相对活性随着天麻素浓度增大而减小，呈剂量依赖性，当天麻素浓度处于最高点0.0225mg/ml时，α-葡萄糖苷酶的相对活性降至9.3％，相比阳性对照物阿卡波糖0.0225mg/ml时，α-葡萄糖苷酶的相对活性降至26.1％，此实验范围内天麻素和阿卡波糖对α-葡糖糖苷酶的半数抑制浓度ic50分别为0.0065mg/ml、0.012mg/ml，单从此抑酶实验数据方面可以说明天麻素在抑制α-葡萄糖苷酶活性方面强于上市药物阿卡波糖，是一种潜力非常大的天然源的α-葡萄糖甘酶抑制剂。

试验例2天麻素对α-葡萄糖苷酶的抑制作用机理，固定底物pnpg的浓度，改变体系中酶量和天麻样品浓度，测定酶量与酶活力的关系。由图2可知，不同浓度的天麻素与不同浓度的α-葡萄糖苷酶抑制作用速率呈线性关系，并交于原点，且随天麻素浓度的增大，抑制速率逐渐降低，说明天麻素对α-葡萄糖苷酶的抑制作用是可逆的。

试验例3

以不同浓度pnpg(0.5、1.0、2.0、和4.0×10-5mol/l)为底物，在α-葡萄糖苷酶浓度不改变的条件下，加入不同浓度的天麻素溶液，于波长405nm下测定单位时间内的吸光值变化，得到α-葡萄糖苷酶的酶促反应速率(v)，以1/v对1/[s]作图，得到在不添加或添加浓度不同天麻素的lineweaver-burk双倒数图，判断二者之间的抑制类型，由图3可知，随着km值的增大而vmax值逐渐减小，两个值同时发生改变，且所有直线都在第二象限相交，说明天麻素不仅可以与游离酶结合，也可以与酶-底物复合物结合，天麻素对α-葡萄糖苷酶的抑制类型属于混合型，其抑制常数ki为0.0036mg/ml，kis为0.075mg/ml。

分析结论：

天麻素在抑制α-葡萄糖苷酶活性方面略强于市售药物阿卡波糖，是一种潜力非常大的天然源的α-葡萄糖甘酶抑制剂，天麻素对α-葡萄糖苷酶的活性抑制属于可逆混合型抑制，抑制常数ki<kis，说明天麻素与与α-葡萄糖苷酶的结合的能力比底物pnpg的能力强，亦可以从此方面证明是天麻素是一个比较好的α-葡萄糖苷酶抑制剂，插图部分的斜率与截距的数据表现出良好的线性关系表明天麻素在α-葡萄糖苷酶上只有一个或者一类结合位点。

以上所述，仅为本发明较佳实施例，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。