一种高催化效率木聚糖酶突变体及其构建方法与应用与流程

文档序号：19418900发布日期：2019-12-14 01:13阅读：415来源：国知局

本发明属于基因工程和遗传工程领域，具体涉及一种高催化效率木聚糖酶突变体及其构建方法与应用。

背景技术：

纤维素、半纤维素和木质素是构成植物细胞壁的主要成分，约占了世界上50％生物量(wongetal.,1988)。半纤维素主要存在于细胞壁的表面，纤维素包裹在半纤维素中，而半纤维素又与木质素共价连接形成网状结构。木聚糖是半纤维素的主要成分，是自然界中含量仅次于纤维素的可再生资源，几乎占地球可更新有机碳含量的三分之一。木聚糖的结构复杂，其主链是由吡喃木糖以β-d-1,4-木糖苷键连接起来，并带有多种取代基(collinsetal.,2005)。

木聚糖酶能够降解木聚糖主链的β-1,4-糖苷键，是木聚糖降解过程中最关键的酶类，其应用也非常广泛，主要涉及饲料工业(张红莲等,2002)、食品工业(江正强,2005)、造纸工业以及能源、纺织、医药等行业等。目前研究最多的两个家族是第10家族和第11家族的木聚糖酶，gh10家族木聚糖酶较gh11家族木聚糖酶普遍具有更好的抗逆性，但较低的催化效率限制了其在工业生产中的应用，在这两个家族中，已经有多个木聚糖酶做过晶体结构解析(http://www.rcsb.org/pdb/)，为木聚糖酶结构和功能的研究奠定了基础。

目前，人们结合蛋白序列信息、蛋白质晶体结构或同源模建、酶蛋白特定的功能信息等来指导实验设计，对已有的酶进行理性、半理性或随机定向进化，通过突变、区域重组、杂合酶构建、活性位点迭代饱组合突变技术(casting技术)等方法构建突变体库。结合超高通量的酶筛选技术，酶的分子改造技术已经进入到了基因片段到蛋白肽段自由设计的新阶段(bornscheueretal.,2012)。木聚糖酶的分子改良方面主要集中在热稳定性机理研究及改良。但在第10家族木聚糖酶其它性质的机制及改良方面的研究还很少，尤其在第10家族木聚糖酶高效催化机制及改良方面的研究罕见报道。高比活、高催化效率的木聚糖酶工程菌株的获得主要通过诱变、筛选和酶分子改良获得。诱变分为自然突变和人工诱变，自然突变成功的几率非常小，人工诱变的工作量较大且有益突变频率仍然较低，变异的方向和性质难以控制。筛选的盲目性较大，不容易获得目的菌株。酶分子改良目的性强，针对酶分子具体结构分析进行改造，从而达到提高比活力和催化效率的目的。

技术实现要素：

针对上述技术问题，本发明提供三种高催化效率木聚糖酶突变体及其构建方法与应用，该突变体是对木聚糖酶野生型的活性loop区域替换后得到的突变体。

一种高催化效率木聚糖酶突变体，以木聚糖酶野生型xyle的序列seqidno.7为基础，进行突变得木聚糖酶突变体xyle-m3、xyle-m6或xyle-m9；

当木聚糖酶突变体为xyle-m3时，其核苷酸序列如seqidno.1所示；

当木聚糖酶突变体为xyle-m6时，其核苷酸序列如seqidno.2所示；

当木聚糖酶突变体为xyle-m9时，其核苷酸序列如seqidno.3所示。

seqidno.1的核苷酸序列:

gcacctcacttgcccggcaacaaggacattgatctcaataagcttgctcagcgccggggcaagcactggtttggcactgcagccgatatccctggaactgctgagaccaccgatgctgcgtatctcaaagtactgaagcagaactttggcgagatcacacctgctaacgcaatgaagttcatgtacaccgagactgagcaaaacgtgttcaacttcaccgagggcgagcagttcctggaggtggccgagcgcttcggtagcaaggtccgctgccacaaccttgtctgggccagcgagcttcccacatgggttactaactggacagccaaggagctcactgctgtcatgaagaaccacatcttcaagaccgttcagcacttcggacgtcgctgttactcttgggatgtggtcaacgaggctctcaacggtgatggcacattctcctcaagtgtctggtatgacaccatcggcgaggaatacttctaccttgcattcaagtatgcccaggaggcattggcacagatcggtgccaatgatgtgaagctgtactacaacgactatggtatcgagaaccccggtaccaagtcgaccgccgttcttcagctcgtcagcaacctgcgtaagcgcggtattcgcattgacggtgttggtttggaatcacactttatcgtgggcgaaactccttctcttgccgatcaacttgccacgaagcaggcctacatcaaggccaacctggatgttgctgtcacggagcttgacgttcgcttctcgactgtgccatattacaccgctgccgctcagaagcagcaggctgaggactactatgtgagcgtcgccagttgcatgaatgctggtcctcgttgcattggtgtggttgtttgggactttgatgatgcttactcctgggtcccgagtgcttttgctggtcagggtggtgcctgtctcttcaacaatacacttgaggcgaagccggcgtactacgccgtcgccgatgctctcgagggaaagccttgcagtgtgtgctag

seqidno.2的核苷酸序列:

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seqidno.2的核苷酸序列:

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seqidno.7的核苷酸序列：

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上述高催化效率木聚糖酶突变体，编码木聚糖酶突变体xyle-m3的氨基酸序列如seqidno.4；编码木聚糖酶突变体xyle-m6的氨基酸序列如seqidno.5；编码木聚糖酶突变体xyle-m9的氨基酸序列如seqidno.6所示。

seqidno.4的氨基酸序列:

aphlpgnkdidlnklaqrrgkhwfgtaadipgtaettdaaylkvlkqnfgeitpanamkfmyteteqnvfnftegeqflevaerfgskvrchnlvwaselptwvtnwtakeltavmknhifktvqhfgrrcyswdvvnealngdgtfsssvwydtigeeyfylafkyaqealaqigandvklyyndygienpgtkstavlqlvsnlrkrgiridgvgleshfivgetpsladqlatkqayikanldvavteldvrfstvpyytaaaqkqqaedyyvsvascmnagprcigvvvwdfddayswvpsafagqggaclfnntleakpayyavadalegkpcsvc

seqidno.5的氨基酸序列:

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seqidno.6的氨基酸序列:

aphlpgnkdidlnklaqrrgkhwfgtaadipgtaettdaaylkvlkqnfgeitpanamkfmyteteqnvfnftegeqflevaerfgskvrchnlvwasqvsdfvtsktwtakeltavmknhifktvqhfgrrcyswdvvnealngdgtfsssvwydtigeeyfylafkyaqealaqigandvklyyndygienpgtkstavlqlvsnlrkrgiridgvgleshfivgetpsladqlatkqayikanldvavteldvrfstvpyytaaaqkqqaedyyvsvascmnagprcigvvvwdfddayswvpsafagqggaclffqpdgpntpleakpayyavadalegkpcsvc

一种重组载体，含有核苷酸序列如seqidno.1、seqidno.2或seqidno.3所示的载体。

一种重组菌株，含有表核苷酸序列如seqidno.1、seqidno.2或seqidno.3所示的表达载体的菌株。

上述高催化效率木聚糖酶突变体的构建方法，包括以下步骤：

1)采用over-lappcr的方法扩增高催化效率木聚糖酶突变体序列片段；

2)将木聚糖酶突变体序列片段克隆到表达载体ppic9r的ecori和noti限制性酶切位点之间，得重组载体；

3)将突变体重组载体转化毕赤酵母gs115，诱导表达，获得突变株；

4)培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶表达；

5)回收并纯化所表达的高催化效率木聚糖酶突变体。

本发明提供的木聚糖酶突变体催化效率高，突变体xyle-m3，xyle-m6和xyle-m9的比活力比野生型的比活力分别提高2.1倍、1.9倍和1.9倍；催化效率比野生型的催化效率分别提高2.4倍、3.1倍和3.4倍；酶促反应最适温度均在70-75℃；最适ph值不变，均为4.5。

上述高催化效率木聚糖突变体在降解木质纤维素上的应用。

有益效果：

本发明提供一种性质优良的、适合于在木质纤维素降解中应用的木聚糖酶突变体。该木聚糖酶突变体的最适ph为4.5，与野生型相同，但是比活力比野生型分别提高2.1倍、1.9倍和1.9倍；催化效率比野生型分别提高2.4倍、3.1倍和3.4倍。最适ph值与秸秆降解的条件基本一致，且在低温范围内(50℃)都能保持稳定的活性，与纤维素酶的协同降解秸秆试验结果表明突变体性质优良。

相对于盲目筛菌或人工(自然)诱变等手段，酶分子改良缩短了酶学性质改造时间。这样一种在酸性ph环境和中低温范围内保持稳定并具有高酶活的木聚糖酶突变体应用于木质纤维素降解产还原糖具有广阔的应用前景。

附图说明

图1在毕赤酵母中表达的重组高催化效率木聚糖酶野生型和突变体的sds-page分析，其中，m:低分子量蛋白质marker；a、c、e、g分别代表野生酶xyle以及突变体xyle-m3,xyle-m6和xyle-m9纯化的酶液；b、d、f、h分别代表以上酶经过endoh处理脱糖基后的蛋白；

图2为高催化效率木聚糖酶突变体与野生型的ph环境要求情况；

图3为高催化效率木聚糖酶突变体与野生型的温度环境要求情况；

图4为高催化效率木聚糖酶突变体与野生型在70℃下的热稳定性情况；

图5为高催化效率木聚糖酶突变体与野生型降解木聚糖的终产物分析。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步描述。

1、菌株及载体：表达宿主pichiapastorisgs115，表达质粒载体ppic9r从invitrogen公司购买；

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自fermentas公司，连接酶购自promaga公司，多聚半乳糖醛酸购自sigma公司。其它都为国产分析纯试剂(均从国药集团购买)；

3、培养基：

(1)lb培养基：0.5％酵母提取物，1％蛋白胨，1％nacl，ph7.0；

(2)ypd培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖；

(3)md固体培养基：2％葡萄糖，1.5％琼脂糖，1.34％ynb，0.00004％biotin；

(4)mm固体培养基：1.5％琼脂糖，1.34％ynb，0.00004％biotin，0.5％甲醇；

(5)bmgy培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％甘油(v/v)，1.34％ynb，0.00004％biotin；

(6)bmmy培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％ynb，0.00004％biotin，0.5％甲醇(v/v)。

实施例1高催化效率木聚糖酶突变体编码基因的克隆

以来源于bisporasp.mey-1的gh10家族高温木聚糖酶基因xyl10c为父本，以来源于penicilliumcanescens的gh10家族木聚糖酶基因xyle为母本，在木聚糖酶的活性loop区域处设计区域替换引物，采用over-lappcr的方法扩增高催化效率木聚糖酶突变体编码基因seqidno.1(xyle-m3，1023bp)，seqidno.2(xyle-m6，1029bp)和seqidno.3(xyle-m9，1047bp)，突变方法以及克隆方法参考文献(you，etal.,2016)。

所用引物序列如表1所示：

表1所用引物序列表

实施例2高催化效率木聚糖酶突变体的制备

将表达载体ppic9r进行双酶切(ecori+noti)，同时将编码高催化效率木聚糖酶突变体的基因双酶切(ecori+noti)，切好的编码成熟高催化效率木聚糖酶突变体的基因片段(去除信号肽片段)与表达载体ppic9r连接，获得含有高催化效率木聚糖酶突变体基因的重组质粒并转化毕赤酵母gs115，获得重组酵母菌株gs115/xyle-m3,gs115/xyle-m6和gs115/xyle-m9。

取含有重组质粒的gs115菌株，接种于300mlbmgy培养基的1l三角瓶中，置于30℃，220rpm摇床培养48h；后将培养液3000g离心5min，弃上清，沉淀用100ml含有0.5％甲醇的bmmy培养基重悬，并再次置于30℃，220rpm条件下诱导培养。每隔12h补加0.5ml甲醇，使菌液中的甲醇浓度保持在0.5％，同时取上清用于酶活性检测。

重组高催化效率木聚糖酶突变体最适ph均为4.5，与野生型的一致，但是比活力比野生型分别提高2.1倍、1.9倍和1.9倍；催化效率比野生型分别提高2.4倍、3.1倍和3.4倍。sds-page结果(图1)表明，重组木聚糖酶在毕赤酵母中得到了表达。所表达的木聚糖酶经过纯化之后，其蛋白质的含量达到总蛋白的98％以上。

实施例3重组高催化效率木聚糖酶突变体和野生型的活性分析

一、dns法：具体方法如下：在给定的ph、温度条件下，1ml的反应体系包括100μl适当的稀释酶液，900μl底物，反应10min，加入1.5mldns终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定od值。1个酶活单位(u)定义为在给定的条件下，每分钟分解木聚糖生成1μmol还原糖所需的酶量。

二、重组高催化效率木聚糖酶突变体和野生型的性质测定

1、重组高催化效率木聚糖酶突变体和野生型的最适ph测定方法如下:

将实施例2纯化的重组高催化效率木聚糖酶突变体和野生型在不同的ph下进行酶促反应以测定其最适ph。底物木聚糖用不同ph的0.1mol/l柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中40℃下进行木聚糖酶活力测定。结果如图2表明，重组高催化效率木聚糖酶突变体和野生型的最适反应ph一致，其中突变体xyle-m3在酸性环境(ph3.0-4.0)的相对酶活较野生酶明显提高，最终不仅提高了酶的催化活力，而且提高了酶在酸性环境中的活力；

2、重组高催化效率木聚糖酶突变体和野生型的最适温度测定方法如下：

重组高催化效率木聚糖酶突变体和野生型的最适温度的测定为在0.1mol/l柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(ph4.5)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。酶反应最适温度测定结果如2(b)表明,重组高催化效率木聚糖酶突变体与野生型(75℃)的最适温度在70-75℃之间，其中xyle-m6和xyle-m9在较低温度下的相对酶活较野生酶明显提高。

3、重组高催化效率木聚糖酶突变体和野生型在70℃的热稳定性测定如下：

检测方法参考文献(luo，etal.,2009),突变型xyle-m3、xyle-m6的热稳定性均优于野生型，70℃下处理30min后，突变体xyle-m3(77％)和xyle-m6(60％)的剩余酶活分别是野生型(21％)的3.7倍和2.9倍(如图3)。

4、重组高催化效率木聚糖酶突变体和野生型的动力学参数测定方法如下:

检测方法参照文献(luo，etal.,2009)，测定反应的一级反应时间。确定测定km及vmax的反应时间为5min。用不同浓度的木聚糖(1.25，1.0，0.8，0.4，0.2，0.15和0.1％)为底物，在最适条件(温度、ph)下测定酶活性，计算出相应的反应速度，利用grafit7软件计算km值及vmax。

以木聚糖为底物时，重组高催化效率木聚糖酶野生型和突变体xyle-m3、xyle-m6、xyle-m9在最适条件下的km值、vmax值分别是0.75mg/ml、0.61mg/ml、0.42mg/ml、0.46mg/ml、4.61mg/ml和680u/min/mg、1390u/min/mg、1160u/min/mg、1390u/min/mg(表2)。

表2高催化效率木聚糖酶突变体与野生型的比活及动力学参数比较表

5、重组高催化效率木聚糖酶突变体和野生型的终产物分析方法如下:

各取重组高催化效率木聚糖酶突变体和野生型(1,000u，过量)于一定量的底物(木聚糖，ph4.5的缓冲液)中，在各自的最适反应温度下反应24h时取样进行高效阴离子交换色谱(hpaec)分析。结果表明高催化效率木聚糖酶突变体和野生型对木聚糖的最终降解产物为木单糖到木六糖之间，其中产量最多的为木二糖，其次为木单糖(图4)。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>江苏科技大学

<120>一种高催化效率木聚糖酶突变体及其构建方法与应用

<160>15

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1026

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gcacctcacttgcccggcaacaaggacattgatctcaataagcttgctcagcgccggggc60

aagcactggtttggcactgcagccgatatccctggaactgctgagaccaccgatgctgcg120

tatctcaaagtactgaagcagaactttggcgagatcacacctgctaacgcaatgaagttc180

atgtacaccgagactgagcaaaacgtgttcaacttcaccgagggcgagcagttcctggag240

gtggccgagcgcttcggtagcaaggtccgctgccacaaccttgtctgggccagcgagctt300

cccacatgggttactaactggacagccaaggagctcactgctgtcatgaagaaccacatc360

ttcaagaccgttcagcacttcggacgtcgctgttactcttgggatgtggtcaacgaggct420

ctcaacggtgatggcacattctcctcaagtgtctggtatgacaccatcggcgaggaatac480

ttctaccttgcattcaagtatgcccaggaggcattggcacagatcggtgccaatgatgtg540

aagctgtactacaacgactatggtatcgagaaccccggtaccaagtcgaccgccgttctt600

cagctcgtcagcaacctgcgtaagcgcggtattcgcattgacggtgttggtttggaatca660

cactttatcgtgggcgaaactccttctcttgccgatcaacttgccacgaagcaggcctac720

atcaaggccaacctggatgttgctgtcacggagcttgacgttcgcttctcgactgtgcca780

tattacaccgctgccgctcagaagcagcaggctgaggactactatgtgagcgtcgccagt840

tgcatgaatgctggtcctcgttgcattggtgtggttgtttgggactttgatgatgcttac900

tcctgggtcccgagtgcttttgctggtcagggtggtgcctgtctcttcaacaatacactt960

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