一种重组磷脂酶D及其在合成磷脂酰丝氨酸或其它磷脂中的应用的制作方法

本发明属于功能酶筛选技术领域，具体涉及一种重组磷脂酶d及其在合成磷脂酰丝氨酸、dha-磷脂酰丝氨酸或其它磷脂中的应用。

背景技术：

磷脂广泛存在于生物体组织结构中，是细胞膜的重要组成部分，由亲水性的磷酸基团头部和疏水性的脂肪酸链尾部构成。目前，已经确定了4个主要的基团：乙醇胺、肌醇、丝氨酸和胆碱。这些基团形成了最重要的磷脂，即磷脂酰乙醇胺(pe)、磷脂酰肌醇(pi)、磷脂酰丝氨酸(ps)和磷脂酰胆碱(pc)。pc是最主要的天然磷脂，然而并不能满足人类营养或者其它需求，从天然磷脂合成特定构型的磷脂具有重要的工业应用价值。

近年来研究表明，人体补充一定量的ps，有助于增强细胞膜的流动性，提高酶活，增强认知能力，延缓衰老。阿尔茨海默症(ad)是影响老年人生活质量的重要疾病之一，病因与大脑功能退化有关，改善受损的神经膜脂质组成，特别是增加神经细胞膜中ps的含量，是防治ad的有效方法之一。ps可以通过调节应激激素的含量，从而调节人体的活动，当体内应激激素含量降低时，ps可以刺激神经使其分泌激素；当应激激素含量升高时，可使机体产生抑制，缓解情绪紧张。另外，ps也能减少肌肉中氨基酸的流失，保护肌肉膜的功能。磷脂的脂肪酸侧链对于磷脂的活性也有重要影响，在过去的一段时间，磷虾油是人们能吃到的最具营养价值和健康的食品之一，在磷虾油中提取出的磷脂约占脂质的40％，winther等人研究发现，58％的pc在至少一个位置含有n-3pufas，而10％的pc在两个位置含有n-3pufas，含量最高的n-3pufas是epa和dha，同时含有少量的十八碳四烯酸和二十二碳五烯酸(dpa)。dha-磷脂酰丝氨酸(dha-ps)和dha-磷脂酰乙醇胺(dha-pe)比dha-磷脂酰胆碱(dha-pc)运输dha至大脑的效率更高。

后来研究发现，ps与pc以及pe等具有相似的结构，可以互相转化，因此酶法制备功能性磷脂的研究陆续开展。由于酶催化法在温和的条件下具有很高的选择性和良好的性能，因此生物催化合成功能性磷脂的方法很有意义，也更易获得化学催化不易得到的产物。

酶催化磷脂改性的反应主要有水解反应，酯交换反应，转磷脂酰反应等。磷脂酶d(pld)能催化磷脂酰基与其它羟基化合物发生碱基交换反应，制备新型磷脂，酶法改性后的磷脂在营养价值、乳化性能、味道和色泽方面均得到改善和提高，从而大大拓宽磷脂的应用范围和价值。

尽管pld展现出良好的催化潜能，但是作为一种细胞毒性蛋白，较低的产率限制了它们的工业化应用前景。包涵体的形成是限制pld工业化应用的另一个因素，包涵体蛋白若想形成正确折叠的可溶性蛋白，一般需要加入化学试剂如尿素和氯化胍等来进行复性，通常需要过夜孵育和摇动/搅拌，有的甚至还需要微波加热作为辅助手段，这对pld的生产或者应用是极为不利的。筛选高活力的pld仍然是磷脂酶法改性的关键。

技术实现要素：

本发明提供了一种重组磷脂酶d，是通过大肠杆菌表面展示技术高通量筛选技术和dna基因重组技术筛选获得新型的pld，并用该酶催化转酯反应来制备ps；从而克服了现有pld酶活力低，表达水平不高的缺陷。

本发明所提供的重组磷脂酶d，包含有：

1)氨基酸序列为seqidno:1的酶；

2)与1)中的序列具有90％以上同源性，由1)所衍生的酶；

优选的，所述的2)中的酶的同源性为95％以上；

更优选的，同源性为99％以上；

编码本发明的重组磷脂酶d的基因，其一种具体序列为seqidno:2

本发明另一个方面还提供一种重组表达载体，用于转化/转染到宿主细胞中来重组表达上述的重组磷脂酶d；

所述的重组表达载体，其一种实施例的具体记载为携带有编码重组磷脂酶d的基因的pet28a-pldr34；

本发明再一个方面还提供一种重组工程菌，是携带有上述的重组表达载体；

所述的重组工程菌在重组表达制备上述的重组磷脂酶d的应用。

本发明还提供所述的重组磷脂酶d在制备磷脂中的应用；

所述的磷脂，优选为磷脂酰丝氨酸(ps)和dha-磷脂酰丝氨酸(dha-ps)。

本发明提供的重组酶pldr34的转酯活力提高了3.24倍，转化率为80.3％，选择性为86.8％，是ps、dha-ps及其它稀有磷脂合成的理想催化剂。

附图说明

图1：本发明中pld重组过程琼脂糖凝胶电泳图；

图2：基于大肠杆菌表面展示的全细胞酶活力筛选图；

图3：筛选到的重组酶高密度发酵酶活测定图；

图4：高活力pldr34催化的转酯反应结果图；

图5：高活力pldr34催化合成dha-ps反应结果图。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。

实施例1：重组pld的筛选与制备

1、pcr扩增磷脂酶d片段

首先通过pcr方法扩增申请人已获得的两种pld蛋白，分别为s.griseofuscusstrainpldsg/g213s和s.roseus，pldsr，大小约为1500～1600bp左右，其中pldsg/g213s的氨基酸序列为seqidno:3，编码基因的序列为seqidno:4；s.roseus，pldsr的氨基酸序列为seqidno:5，编码基因的序列为seqidno:6。然后将pcr产物回收，用微量核酸测定仪测定两个片段的浓度。再取两种扩增好的等量的pcr产物溶液混合后用酶dnsaei切成片段，将酶切产物于琼脂糖凝胶电泳检测(图1a)。按照材料与方法所述，0.3μldnaseⅰ(稀释到1u/μl，现用现稀释)15℃酶切2min效果最好，片段大小在100～200bp之间，符合预期要求。切胶回收片段大小在100～200bp之间的核酸片段。

2、无引物pcr扩增磷脂酶d片段

取酶切之后回收的产物作为模板，互为引物进行无引物pcr。将pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，从电泳图可以看出，无引物pcr成功扩增出了条带，在500～3000bp之间有亮度出现，切胶回收1500～2000bp左右的亮带，并将产物命名为pld-1(图1b)。

3、有引物pcr扩增磷脂酶d片段

以pld-1为模板，分别以引物①at-sg-f和at-sg-r，②at-sg-f和at-sr-r，③at-sr-f和at-sg-r，④at-sr-f和at-sr-r为引物扩增得到全长突变文库。将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，并切胶回收目的产物，分别命名为pld1-1，pld1-2，pld2-1，pld2-2(图1c)。

4个重组片段与已经构建成功的大肠杆菌表面展示载体pat-pld采用无缝拼接的方式进行连接。连接产物首先转化至dh5α感受态细胞，用无菌水清洗长出的所有菌落，转入lb试管，提取混合质粒并转化至大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，涂布于含有卡那霉素的pld筛选平板，并将长出的克隆重新划线，为下一步的筛选做准备。

4、高活力菌株的筛选

取上一轮固体平板上生长状况良好的150个克隆接种到5ml试管中，在od600值约为0.6左右时加入0.1mmiptg诱导4h，5000r/min冷冻离心10min后取全细胞菌体测定水解活力，结果如图2。其中8个突变体12、34、35、61、62、64、72和88与对照组相比，酶活性有显著提高。

以pld的水解活力作为筛选标准，然后将第一轮筛选的阳性克隆在高密度培养基zyp-5052中培养，用于第二轮筛选。最后，通过酶活性比较(图3)，重组酶recom-35的酶活提高了1.15倍，reom-12、recom-34和recom-88的酶活分别提高了0.15～0.86倍不等。

对上一轮筛选到的重组酶进行测序分析，其中本发明保护的recom-34(重组酶pldr34)，其开放阅读框全长1617bp(seqidno:2)，由538个氨基酸组成(seqidno:1)。recom-34融合了pldsgn端105个氨基酸，第105-500个氨基酸与pldsr一致，其中recom-34与pldsg的序列一致性为83.27％，与pldsr的序列一致性为88.10％。将序列提交到ncbi数据库，进行序列信息分析，和数据库中的streptomycessp.wm6372的pld的相似度最高，一致性为89.40％，，该酶与已经报道的几种链霉菌的进化距离较远，是一种新型的酶。

实施例2：重组plds酶合成ps和dha-ps

为了验证本发明的重组plds酶与亲本酶合成ps的能力，采用双相反应体系以磷脂酰胆碱pc和l-丝氨酸为底物合成ps。以亲本酶pldsr和pldsg/g213s作为对照，reom-12、recom-34和recom-35作为实验组，将同样重量的酶粉、1ml-丝氨酸和50mmcacl2溶于1mlhac-naac缓冲液(20mm，ph6.0)中，有机相中含有pc(溶于无水乙醚，20mg/ml)。优化酶促反应时间，反应6h后，离心取有机相，进行薄层色谱法和hplc检测反应结果。

结果如图4的a中所示，其中从左到右的第1道为底物磷脂酰胆碱pc，第2道和第3道为亲本酶pldsg/g213s和pldsr，第4-6道分别为重组酶reom-12、recom-34和recom-35。结果表明，在相同反应条件下，对照组pldsg/g213s的磷脂组分分别为31.3％的磷脂酸(pa)，43.9％的pc和24.8％的ps，转酯酶活为0.05u/mg(μmol/h/mg),亲本酶pldsr不能催化转酯反应。重组酶recom-34催化的转酯反应，ps含量占总磷脂的80.3％，仅产生了12.2％的水解副产物pa和7.4％的底物残留。虽然重组酶recom-35的反应速度最快，且在总磷脂成分中未检测出pc，但产生了27％的副产物pa，转化率达到73％。因此本发明优先选用重组酶recom-34用于ps的合成。与亲本酶pldsg/g213s相比，重组酶recom-34无论从反应速度还是反应效率方面来说，酶学性能得到了很大的提升。

将重组酶recom-34用于dha-ps的合成，结果如图5所示，第2道为反应结果，表明本发明的重组酶recom-34能够用于dha-ps的合成。

以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

序列表

<110>中国海洋大学

<120>一种重组磷脂酶d及其在合成磷脂酰丝氨酸或其它磷脂中的应用

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