一种用于ST细胞培养及相应病毒生产的低血清培养基的制作方法

本发明涉及生物制药疫苗生产领域，具体是一种用于st细胞培养及相应病毒生产的低血清培养基。

背景技术：

传统st细胞培养的培养方式为mem培养基添加10％小牛血清培养细胞，血清用量大，成本高。

由于st细胞在培养过程中对血清比较依赖，降低血清培养会出现细胞生长慢、细胞死亡等情况；市面上st低血清培养基在普通基础培养基基础上添加成分种类多，成分复杂。进行猪瘟病毒生产时，接毒后细胞贴壁不牢，难以稳定生产，且产毒效果差，未达到半成品质量要求；基于此，我们提出一种用于st细胞培养及相应病毒生产的低血清培养基。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种用于st细胞培养及相应病毒生产的低血清培养基，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种用于st细胞培养及相应病毒生产的低血清培养基，包括以下组成成分：氨基酸、维生素、无机盐类、辅助成分和蛋白质；所述氨基酸包括甘氨酸5-10mg/l、丙氨酸5-10mg/l、盐酸精氨110-150mg/l、一水天门冬酰10-15mg/l、天门冬氨10-15mg/l、二盐酸胱氨酸20-40mg/l、谷氨酸10-15mg/l、谷氨酰胺200-350mg/l、一水盐酸组氨酸25-50mg/l、异亮氨酸25-60mg/l、亮氨酸25-60mg/l、盐酸赖氨酸50-80mg/l、甲硫氨酸10-20mg/l、苯丙氨酸20-40mg/l、脯氨酸10-15mg/l、丝氨酸10-15mg/l、苏氨酸25-50mg/l、色氨酸5-15mg/l、酪氨酸二钠盐二水合物30-60mg/l、缬氨酸25-50mg/l、羟脯氨酸5-10mg/l；所述蛋白质包括人转铁蛋白5-10mg/l、重组胰岛素5-10mg/l、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)1500-3400mg/l。

作为本发明进一步的方案：所述维生素包括生物素0.05-0.2mg/l、氯化胆碱

2-5mg/l、d-泛酸钙2-5mg/l、叶酸2-5mg/l、烟酰胺2-5mg/l、吡哆素盐酸盐0.1-0.3mg/l、盐酸吡哆醛0.1-0.3mg/l、核黄素0.1-0.3mg/l、盐酸硫胺素1-5mg/l、b12维生素0.1-0.3mg/l、i-肌醇5-10mg/l、维生素a醋酸酯0.01-0.05mg/l、维生素d

0.01-0.1mg/l、维生素k0.005-0.01mg/l。

作为本发明再进一步的方案：所述无机盐类包括无水氯化钙150-200mg/l、无水硫酸镁50-120mg/l、氯化钾300-400mg/l、碳酸氢钠2500-3700mg/l、氯化钠5000-6000mg/l、一水磷酸二氢钠120-150mg/l、五水硫酸铜0.0005-0.001mg/l、七水合硫酸亚铁0.1-0.5mg/l、无水氯化镁10-30mg/l。

作为本发明再进一步的方案：所述辅助成分包括d-葡萄糖2000-5000mg/l、乙醇胺1-5mg/l、次黄嘌呤钠0.1-0.5mg/l、亚油酸0.1-0.5mg/l、酚红10-15mg/l、腐胺二盐酸2-6mg/l、丙酮酸钠90-120mg/l、还原型谷胱甘肽0.5-2.0mg/l、半乳糖100-300mg/l、腺嘌呤5-15mg/l、血清素5-15mg/l、水溶性胆固醇1-5mg/l、盐酸鸟嘌呤10-20mg/l、胸腺嘧啶0.1-0.5mg/l、尿嘧啶0.1-0.5mg/l、胸腺嘧啶核苷0.1-0.5mg/l。

作为本发明再进一步的方案：包括以下组成成分：甘氨酸7.5mg/l、丙氨酸8.9mg/l、盐酸精氨酸126mg/l、一水天门冬酰胺13.2mg/l、天门冬氨酸13.3mg/l、二盐酸胱氨酸31.28mg/l、谷氨酸14.7mg/l、谷氨酰胺292mg/l、一水盐酸组氨酸42mg/l、异亮氨酸52mg/l、亮氨酸52mg/l、盐酸赖氨酸72.5mg/l、甲硫氨酸15mg/l、苯丙氨酸32mg/l、脯氨酸11.5mg/l、丝氨酸10.5mg/l、苏氨酸48mg/l、色氨酸10mg/l、酪氨酸二钠盐二水合物51.9mg/l、缬氨酸46mg/l、羟脯氨酸6.8mg/l、生物素0.15mg/l、氯化胆碱3.5mg/l、d-泛酸钙3.5mg/l、叶酸3.5mg/l、烟酰胺3.5mg/l、吡哆素盐酸盐0.2mg/l、盐酸吡哆醛0.1mg/l、核黄素0.25mg/l、盐酸硫胺素3.5mg/l、b12维生素0.2mg/l、i-肌醇6.3mg/l、维生素a醋酸酯0.05mg/l、维生素d0.07mg/l、维生素k0.008mg/l、无水氯化钙180mg/l、无水硫酸镁92mg/l、氯化钾380mg/l、碳酸氢钠2700mg/l、氯化钠5600mg/l、一水磷酸二氢钠130mg/l、五水硫酸铜0.001mg/l、七水合硫酸亚铁0.3mg/l、无水氯化镁25mg/l、d-葡萄糖4000mg/l、乙醇胺2.5mg/l、次黄嘌呤钠0.4mg/l、亚油酸0.2mg/l、酚红12mg/l、腐胺二盐酸5.5mg/l、丙酮酸钠105mg/l、还原型谷胱甘肽1.7mg/l、半乳糖200mg/l、腺嘌呤12.5mg/l、血清素5.5mg/l、水溶性胆固醇2.8mg/l、盐酸鸟嘌呤14.5mg/l、胸腺嘧啶0.2mg/l、尿嘧啶0.2mg/l、胸腺嘧啶核苷0.38mg/l、人转铁蛋白6.5mg/l、重组胰岛素10mg/l、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)2800mg/l。

作为本发明再进一步的方案：所述人转铁蛋白为饱和铁人转铁蛋白。

作为本发明再进一步的方案：所述重组胰岛素为全链重组胰岛素。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明制备的用于st细胞培养及相应病毒生产的低血清培养基中，使用甲骨文生物st低血清培养基iv系列添加3％猪瘟专用新生牛血清情况下能够替代传统细胞培养基对st细胞进行常规细胞培养，且细胞培养状态与数量均与传统培养方法无显著差异，保持细胞良好的生长状态；同时利用该培养体系可以较好地增殖猪瘟病毒，病毒滴度不小于50万倍rid。

附图说明

图1为mem培养f3代细胞显微镜观察结果。

图2为lsm培养f3代细胞显微镜观察结果。

图3为家兔校验中家兔反应为早期(61h)出现双定性热反应。

图4为家兔校验中家兔反应为早期(60h)出现双定性热反应。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

实施例1

一种用于st细胞培养及相应病毒生产的低血清培养基，包括以下组成成分：甘氨酸7.5mg/l、丙氨酸8.9mg/l、盐酸精氨酸126mg/l、一水天门冬酰胺13.2mg/l、天门冬氨酸13.3mg/l、二盐酸胱氨酸31.28mg/l、谷氨酸14.7mg/l、谷氨酰胺292mg/l、一水盐酸组氨酸42mg/l、异亮氨酸52mg/l、亮氨酸52mg/l、盐酸赖氨酸72.5mg/l、甲硫氨酸15mg/l、苯丙氨酸32mg/l、脯氨酸11.5mg/l、丝氨酸10.5mg/l、苏氨酸48mg/l、色氨酸10mg/l、酪氨酸二钠盐二水合物51.9mg/l、缬氨酸46mg/l、羟脯氨酸6.8mg/l、生物素0.15mg/l、氯化胆碱3.5mg/l、d-泛酸钙3.5mg/l、叶酸3.5mg/l、烟酰胺3.5mg/l、吡哆素盐酸盐0.2mg/l、盐酸吡哆醛0.1mg/l、核黄素0.25mg/l、盐酸硫胺素3.5mg/l、b12维生素0.2mg/l、i-肌醇6.3mg/l、维生素a醋酸酯0.05mg/l、维生素d0.07mg/l、维生素k0.008mg/l、无水氯化钙180mg/l、无水硫酸镁92mg/l、氯化钾380mg/l、碳酸氢钠2700mg/l、氯化钠5600mg/l、一水磷酸二氢钠130mg/l、五水硫酸铜0.001mg/l、七水合硫酸亚铁0.3mg/l、无水氯化镁25mg/l、d-葡萄糖4000mg/l、乙醇胺2.5mg/l、次黄嘌呤钠0.4mg/l、亚油酸0.2mg/l、酚红12mg/l、腐胺二盐酸5.5mg/l、丙酮酸钠105mg/l、还原型谷胱甘肽1.7mg/l、半乳糖200mg/l、腺嘌呤12.5mg/l、血清素5.5mg/l、水溶性胆固醇2.8mg/l、盐酸鸟嘌呤14.5mg/l、胸腺嘧啶0.2mg/l、尿嘧啶0.2mg/l、胸腺嘧啶核苷0.38mg/l、人转铁蛋白6.5mg/l、重组胰岛素10mg/l、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)2800mg/l。

其中，人转铁蛋白为饱和铁人转铁蛋白；重组胰岛素为全链重组胰岛素。

实施例2

一种用于st细胞培养及相应病毒生产的低血清培养基，包括以下组成成分：甘氨酸5mg/l、丙氨酸5mg/l、盐酸精氨酸110mg/l、一水天门冬酰胺10mg/l、天门冬氨酸10mg/l、二盐酸胱氨酸20mg/l、谷氨酸10mg/l、谷氨酰胺200mg/l、一水盐酸组氨酸25mg/l、异亮氨酸25mg/l、亮氨酸25mg/l、盐酸赖氨酸50mg/l、甲硫氨酸10mg/l、苯丙氨酸20mg/l、脯氨酸10mg/l、丝氨酸10mg/l、苏氨酸25mg/l、色氨酸10mg/l、酪氨酸二钠盐二水合物30mg/l、缬氨酸25mg/l、羟脯氨酸5mg/l、生物素0.05mg/l、氯化胆碱2mg/l、d-泛酸钙2mg/l、叶酸2mg/l、烟酰胺2mg/l、吡哆素盐酸盐0.1mg/l、盐酸吡哆醛0.1mg/l、核黄素0.1mg/l、盐酸硫胺素1mg/l、b12维生素0.1mg/l、i-肌醇5mg/l、维生素a醋酸酯0.01mg/l、维生素d0.01mg/l、维生素k0.005mg/l、无水氯化钙150mg/l、无水硫酸镁50mg/l、氯化钾300mg/l、碳酸氢钠2500mg/l、氯化钠5000mg/l、一水磷酸二氢钠120mg/l、五水硫酸铜0.0005mg/l、七水合硫酸亚铁0.1mg/l、无水氯化镁10mg/l、d-葡萄糖2000mg/l、乙醇胺1mg/l、次黄嘌呤钠0.1mg/l、亚油酸0.1mg/l、酚红10mg/l、腐胺二盐酸2mg/l、丙酮酸钠90mg/l、还原型谷胱甘肽0.5mg/l、半乳糖100mg/l、腺嘌呤5mg/l、血清素5mg/l、水溶性胆固醇1mg/l、盐酸鸟嘌呤10mg/l、胸腺嘧啶0.1mg/l、尿嘧啶0.1mg/l、胸腺嘧啶核苷0.1mg/l、人转铁蛋白5mg/l、重组胰岛素5mg/l、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)1500mg/l。

其中，人转铁蛋白为饱和铁人转铁蛋白；重组胰岛素为全链重组胰岛素。

实施例3

一种用于st细胞培养及相应病毒生产的低血清培养基，包括以下组成成分：甘氨酸10mg/l、丙氨酸10mg/l、盐酸精氨酸150mg/l、一水天门冬酰胺15mg/l、天门冬氨酸15mg/l、二盐酸胱氨酸40mg/l、谷氨酸15mg/l、谷氨酰胺350mg/l、一水盐酸组氨酸50mg/l、异亮氨酸60mg/l、亮氨酸60mg/l、盐酸赖氨酸80mg/l、甲硫氨酸20mg/l、苯丙氨酸40mg/l、脯氨酸15mg/l、丝氨酸15mg/l、苏氨酸50mg/l、色氨酸15mg/l、酪氨酸二钠盐二水合物60mg/l、缬氨酸50mg/l、羟脯氨酸10mg/l、生物素0.2mg/l、氯化胆碱5mg/l、d-泛酸钙5mg/l、叶酸5mg/l、烟酰胺5mg/l、吡哆素盐酸盐0.3mg/l、盐酸吡哆醛0.3mg/l、核黄素0.3mg/l、盐酸硫胺素5mg/l、b12维生素0.3mg/l、i-肌醇10mg/l、维生素a醋酸酯0.05mg/l、维生素d0.1mg/l、维生素k0.001mg/l、无水氯化钙200mg/l、无水硫酸镁120mg/l、氯化钾400mg/l、碳酸氢钠3700mg/l、氯化钠6000mg/l、一水磷酸二氢钠150mg/l、五水硫酸铜0.001mg/l、七水合硫酸亚铁0.5mg/l、无水氯化镁30mg/l、d-葡萄糖5000mg/l、乙醇胺5mg/l、次黄嘌呤钠0.5mg/l、亚油酸0.5mg/l、酚红15mg/l、腐胺二盐酸6mg/l、丙酮酸钠120mg/l、还原型谷胱甘肽2mg/l、半乳糖300mg/l、腺嘌呤15mg/l、血清素15mg/l、水溶性胆固醇5mg/l、盐酸鸟嘌呤20mg/l、胸腺嘧啶0.5mg/l、尿嘧啶0.5mg/l、胸腺嘧啶核苷0.5mg/l、人转铁蛋白10mg/l、重组胰岛素10mg/l、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)3400mg/l。

其中，人转铁蛋白为饱和铁人转铁蛋白；重组胰岛素为全链重组胰岛素。

实施例4

一种用于st细胞培养及相应病毒生产的低血清培养基，包括以下组成成分：甘氨酸5mg/l、丙氨酸5mg/l、盐酸精氨酸110mg/l、一水天门冬酰胺10mg/l、天门冬氨酸10mg/l、二盐酸胱氨酸20mg/l、谷氨酸10mg/l、谷氨酰胺200mg/l、一水盐酸组氨酸25mg/l、异亮氨酸25mg/l、亮氨酸25mg/l、盐酸赖氨酸50mg/l、甲硫氨酸10mg/l、苯丙氨酸20mg/l、脯氨酸10mg/l、丝氨酸10mg/l、苏氨酸25mg/l、色氨酸10mg/l、酪氨酸二钠盐二水合物30mg/l、缬氨酸25mg/l、羟脯氨酸5mg/l、生物素0.05mg/l、氯化胆碱2mg/l、d-泛酸钙2mg/l、叶酸2mg/l、烟酰胺2mg/l、吡哆素盐酸盐0.1mg/l、盐酸吡哆醛0.1mg/l、核黄素0.1mg/l、盐酸硫胺素1mg/l、b12维生素0.1mg/l、i-肌醇5mg/l、维生素a醋酸酯0.01mg/l、维生素d0.01mg/l、维生素k0.005mg/l、无水氯化钙180mg/l、无水硫酸镁92mg/l、氯化钾380mg/l、碳酸氢钠2700mg/l、氯化钠5600mg/l、一水磷酸二氢钠130mg/l、五水硫酸铜0.001mg/l、七水合硫酸亚铁0.3mg/l、无水氯化镁25mg/l、d-葡萄糖4000mg/l、乙醇胺2.5mg/l、次黄嘌呤钠0.4mg/l、亚油酸0.2mg/l、酚红12mg/l、腐胺二盐酸5.5mg/l、丙酮酸钠105mg/l、还原型谷胱甘肽1.7mg/l、半乳糖200mg/l、腺嘌呤12.5mg/l、血清素5.5mg/l、水溶性胆固醇2.8mg/l、盐酸鸟嘌呤14.5mg/l、胸腺嘧啶0.2mg/l、尿嘧啶0.2mg/l、胸腺嘧啶核苷0.38mg/l、人转铁蛋白6.5mg/l、重组胰岛素10mg/l、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)2800mg/l。

其中，人转铁蛋白为饱和铁人转铁蛋白；重组胰岛素为全链重组胰岛素。

实施例5

一种用于st细胞培养及相应病毒生产的低血清培养基，包括以下组成成分：甘氨酸7.5mg/l、丙氨酸8.9mg/l、盐酸精氨酸126mg/l、一水天门冬酰胺13.2mg/l、天门冬氨酸13.3mg/l、二盐酸胱氨酸31.28mg/l、谷氨酸14.7mg/l、谷氨酰胺292mg/l、一水盐酸组氨酸42mg/l、异亮氨酸52mg/l、亮氨酸52mg/l、盐酸赖氨酸72.5mg/l、甲硫氨酸15mg/l、苯丙氨酸32mg/l、脯氨酸11.5mg/l、丝氨酸10.5mg/l、苏氨酸48mg/l、色氨酸10mg/l、酪氨酸二钠盐二水合物51.9mg/l、缬氨酸46mg/l、羟脯氨酸6.8mg/l、生物素0.15mg/l、氯化胆碱3.5mg/l、d-泛酸钙3.5mg/l、叶酸3.5mg/l、烟酰胺3.5mg/l、吡哆素盐酸盐0.2mg/l、盐酸吡哆醛0.1mg/l、核黄素0.25mg/l、盐酸硫胺素3.5mg/l、b12维生素0.2mg/l、i-肌醇6.3mg/l、维生素a醋酸酯0.05mg/l、维生素d0.07mg/l、维生素k0.008mg/l、无水氯化钙180mg/l、无水硫酸镁92mg/l、氯化钾380mg/l、碳酸氢钠2700mg/l、氯化钠5600mg/l、一水磷酸二氢钠130mg/l、五水硫酸铜0.001mg/l、七水合硫酸亚铁0.3mg/l、无水氯化镁25mg/l、d-葡萄糖5000mg/l、乙醇胺5mg/l、次黄嘌呤钠0.5mg/l、亚油酸0.5mg/l、酚红15mg/l、腐胺二盐酸6mg/l、丙酮酸钠120mg/l、还原型谷胱甘肽2mg/l、半乳糖300mg/l、腺嘌呤15mg/l、血清素15mg/l、水溶性胆固醇5mg/l、盐酸鸟嘌呤20mg/l、胸腺嘧啶0.5mg/l、尿嘧啶0.5mg/l、胸腺嘧啶核苷0.5mg/l、人转铁蛋白10mg/l、重组胰岛素10mg/l、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)3400mg/l。

其中，人转铁蛋白为饱和铁人转铁蛋白；重组胰岛素为全链重组胰岛素。

采用实施例1-5配方配制的培养基与对照组进行细胞培养测试：

实验组细胞状态良好，与阳性对照没有较大差别。而阴性对照组细胞数较少，有较多的死亡细胞。

st细胞低血清培养体系增殖猪瘟病毒实验

实验步骤如下：

1)取常规条件培养良好的单层st细胞，每克氏瓶接种约2.0×107cells，共计接种2瓶；

2)对照组添加mem+8％bs生长液约120ml。实验组添加lsm+3％bs生长液约120ml；

3)37℃静止密闭培养72h后，以3.1方式连续传代3代；

4)分别对对照组、实验组的f3代细胞评价生长状态，并进行细胞计数。3.5将f3代生长良好的单层细胞，接入符合要求的猪瘟种毒，接毒量3％，每收次按规定时间收获病毒，共计五收次。收获后病毒将1-5收次混合，用家兔检测50万倍稀释后的rid。

实验结果

显微镜下观察可见实验组与对照组细胞生长形态均一，无聚团、单细胞巨化生长，细胞变圆界线清晰，细胞生长状态良好，二者无显著差异(图中颜色差异为显微镜光线差异)(图1、图2)

利用血球计数板将f3代实验st细胞进行计数，结果如下(表1)：

表1.

计数结果显示，实验组与对照组细胞数量无显著差异。

1-5收次混合后利用家兔进行校检结果显示：利用lsm培养的st细胞可以较好地增殖猪瘟病毒，且家兔反应为早期(60h、61h)出现双定性热反应，病毒滴度不小于50万倍rid。本次实验未按规定将每收次分别测定rid，也未进一步做100万倍rid检测，旨在验证总体产毒情况，推断部分单收次可能超过100万倍rid(图3、图4)。

本发明制备的用于st细胞培养及相应病毒生产的低血清培养基中，使用甲骨文生物st低血清培养基iv系列添加3％猪瘟专用新生牛血清情况下能够替代传统细胞培养基对st细胞进行常规细胞培养，且细胞培养状态与数量均与传统培养方法无显著差异，保持细胞良好的生长状态；同时利用该培养体系可以较好地增殖猪瘟病毒，病毒滴度不小于50万倍rid。

上面对本发明的较佳实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。