1,3,4-噁二唑-2-环丁基类化合物及其制备方法与流程

本发明属于医药化学领域，具体涉及具有1,3,4-噁二唑-2-环丁基类结构的化合物或其异构体、盐、溶剂合物、结晶，以及所述化合物的制备方法及其作为中间体用于制备治疗癌症或者感染类疾病的药物中的应用。

背景技术：

程序性死亡受体-1(programmedcelldeath-1，pd-1)及其配体pd-ll(b7·h1)属于cd28/b7超家族。pd-1主要表达在t细胞、b细胞、自然杀伤细胞(natualkillercell，nk细胞)的膜表面，pd-l1主要表达于成熟的cd4t细胞、cd8t细胞、b细胞、单核细胞、树突状细胞(dendriticcells，dcs)、巨噬细胞等造血细胞及一些非造血细胞，如内皮细胞、胰岛细胞、肥大细胞等的膜表面。其中pd-l1在多种肿瘤中高表达，如肺癌、胃癌、多发性骨髓、黑色素瘤和乳腺癌等。肿瘤细胞表面上的pd-l1的表达与t细胞表面的配体相互作用，可诱导t细胞的凋亡或降低t细胞的反应活性，从而抑制肿瘤免疫应答，使肿瘤细胞逃避免疫攻击。因此阻断pd1-pdl1信号通路的拮抗剂，可促进t细胞的激活、逆转肿瘤免疫微环境、增强内源性抗肿瘤免疫效应。靶向pd-1/pd-l1抑制剂在肿瘤免疫治疗领域有着广阔的应用前景。

目前抗pd-1/pd-l1抗体治疗在临床上已显示具有优势作用，然而生物大分子也具有一些缺点，例如免疫原性以及给药途径的限制。因此，仍需要开发具有更好药效的靶向pd-1/pd-l1抑制剂。本发明的发明人发现一类小分子药物能特异性地调控和/或调解pd-l1及其相关蛋白激酶的转导，从而用于治疗与pd-1/pd-l1相关的疾病。

技术实现要素：

本发明的发明人发现了一种pd-l1抑制剂，该抑制剂的化合物结构如下式a所示，其化学名称为(((1r,3s)-1-(5-((1s,2r)-1-氨基-2-羟丙基)-1,3,4-噁二唑-2-基)-3-(氰甲基)环丁基)氨基甲酰基)-l-丝氨酸(以下简称“式a化合物”)：

本发明的发明人研究发现，式a化合物对pd-l1具有好的抑制活性，非常有希望成为疗效更高、副作用更小的癌症或者感染类疾病治疗剂。

本发明的发明人发现一种制备式a化合物或其药学可接受的盐、异构体、溶剂合物、结晶或前药的方法，该方法反应条件温和，纯化容易，工艺稳定，易于操作，有利于工业化大生产。

本发明的一个目的是提供式i的化合物或其立体异构体、盐、溶剂合物、结晶，

其中：

r¹、r²、r³、r⁴各自独立地选自氢和氨基保护基；

r⁵选自氢和羟基保护基；或者

r⁴和r⁵与它们所连接的一起形成任选取代的杂环基。

本发明的另一个目的是提供制备本发明的式i的化合物或其立体异构体、盐、溶剂合物、结晶的方法。

本发明的还一个目的是提供使用本发明的式i的化合物或其立体异构体、盐、溶剂合物、结晶作为中间体制备式a的化合物或其药学可接受的盐、异构体、溶剂合物、结晶或前药的方法。

本发明的再一个目的是提供本发明的式i的化合物或其立体异构体、盐、溶剂合物、结晶作为中间体用于制备式a的化合物或其药学可接受的盐、异构体、溶剂合物、结晶或前药的应用。

针对上述目的，本发明提供以下技术方案：

第一方面，本发明提供式i的化合物或其立体异构体、盐、溶剂合物、结晶，

其中：

r¹、r²、r³、r⁴各自独立地选自氢和氨基保护基；

r⁵选自氢和羟基保护基；或者

r⁴和r⁵与它们所连接的一起形成任选取代的杂环基。

在一些优选的实施方案中，本发明的化合物为式i的化合物或其立体异构体、盐、溶剂合物、结晶，其中：

r¹、r²、r³、r⁴各自独立地选自氢、烷基三硅烷基、芳基三硅烷基、烷基、烷基酰基、芳基酰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、烷氧基、芳基氧基和烷基氨基酰基，所述烷基三硅烷基、芳基三硅烷基、烷基、烷基酰基、芳基酰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、烷氧基、芳基氧基和烷基氨基酰基任选被一个或多个选自卤素、羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、烷基和烷氧基的基团取代；

进一步优选地，r¹、r²、r³、r⁴各自独立地选自氢、c1-10烷基三硅烷基、c6-10芳基三硅烷基、c1-10烷基、c1-10烷基酰基、c6-10芳基酰基、c1-10烷基磺酰基、c6-10芳基磺酰基、c1-10烷氧基羰基、c6-10芳基氧基羰基c1-10烷氧基、c6-10芳基氧基和c1-10烷基氨基酰基，所述的c1-10烷基三硅烷基、c6-10芳基三硅烷基、c1-10烷基、c1-10烷基酰基、c6-10芳基酰基、c1-10烷基磺酰基、c6-10芳基磺酰基、c1-10烷氧基羰基、c6-10芳基氧基羰基c1-10烷氧基、c6-10芳基氧基和c1-10烷基氨基酰基任选被一个或多个选自卤素、羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、c1-6烷基和c1-6烷氧基的基团取代；

更进一步优选地，r¹、r²、r³、r⁴各自独立地选自氢、c1-3烷基三硅烷基、c6-8芳基三硅烷基、c1-3烷基、c1-3烷基酰基、c6-8芳基酰基、c1-3烷基磺酰基、c6-8芳基磺酰基、c1-3烷氧基羰基、c6-8芳基氧基羰基c1-3烷氧基、c6-8芳基氧基和c1-3烷基氨基酰基，所述的c1-3烷基三硅烷基、c6-8芳基三硅烷基、c1-3烷基、c1-3烷基酰基、c6-8芳基酰基、c1-3烷基磺酰基、c6-8芳基磺酰基、c1-3烷氧基羰基、c6-8芳基氧基羰基c1-3烷氧基、c6-8芳基氧基和c1-3烷基氨基酰基任选被一个或多个选自卤素、羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、c1-3烷基和c1-3烷氧基的基团取代。

在一些优选的实施方案中，本发明的化合物为式i的化合物或其立体异构体、盐、溶剂合物、结晶，其中r¹、r²、r³、r⁴各自独立地选自氢、三甲基硅基、三乙基硅基、三异丙基硅基、叔丁基二甲基硅基、叔丁基二苯基硅基、甲基、叔丁基、烯丙基、三苯甲基、苄基、甲氧基甲基、乙氧基乙基、2-四氢吡喃基(thp)、甲酰基、乙酰基、三氟乙酰基、苯甲酰基、甲磺酰基、乙磺酰基、苯甲磺酰基、甲氧羰基、乙氧羰基、苄氧羰基、2-联苯基-2-丙氧羰基、笏甲氧羰基、苯氧羰基、叔丁氧羰基(t-butyloxycarbonyl，boc)、甲氧基、乙氧基、苯氧基、三甲基硅基乙氧基、(3-羟基-1-甲氧基-1-氧代环丙烷-2-基)氨基甲酰基和(1,3-二羟基-1-氧代环丙烷-2-基)氨基甲酰基。

在一些优选的实施方案中，本发明的化合物为式i的化合物或其立体异构体、盐、溶剂合物、结晶，其中r¹、r²、r³、r⁴各自独立地选自氢、三甲基硅基、三甲基硅基乙氧基、苄氧羰基、叔丁氧羰基、2-联苯基-2-丙氧羰基、笏甲氧羰基、甲酰基、三氟乙酰基、三苯甲基、苄基、(3-羟基-1-甲氧基-1-氧代环丙烷-2-基)氨基甲酰基和(1,3-二羟基-1-氧代环丙烷-2-基)氨基甲酰基。

在一些优选的实施方案中，本发明的化合物为式i的化合物或其立体异构体、盐、溶剂合物、结晶，其中：

r⁵选自氢、(烷基)3硅烷基、(芳基)3硅烷基、烷基、烯基、烷基酰基、芳基磺酰基、烷氧基羰基和芳基氧基羰基；

进一步优选地，r⁵选自氢、(c1-10烷基)3硅烷基、(c6-10芳基)3硅烷基、c1-10烷基、c2-10烯基、c1-10烷基酰基、c6-10芳基磺酰基、c1-10烷氧基羰基和c6-10芳基氧基羰基；

更进一步优选地，r⁵选自三乙基硅基、三异丙基硅基、叔丁基二甲基硅基、叔丁基二苯基硅基、甲基、叔丁基、烯丙基、苄基、甲氧基甲基、乙氧基乙基、2-四氢吡喃基(thp)、甲酰基、乙酰基、苯甲酰基、苯基磺酰基、甲氧基羰基、乙氧基羰基和苯氧基羰基。

在一些优选的实施方案中，本发明的化合物为式i的化合物或其立体异构体、盐、溶剂合物、结晶，其中：

r⁴和r⁵与它们所连接的一起形成5元-10元杂环基，所述杂环基任选被一个或多个选自卤素、羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、c1-6烷基、c1-6烷氧基、氧代基团和氨基保护基的基团取代；

进一步优选地，r⁴和r⁵与它们所连接的一起形成5元-8元杂环基，所述杂环基任选被一个或多个选自卤素、羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、c1-3烷基、c1-3烷氧基、氧代基团和氨基保护基的基团取代；

更进一步优选地，r⁴和r⁵与它们所连接的一起形成5元-6元杂环基，所述杂环基任选被一个或多个选自卤素、羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、甲基、乙基、丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、氧代基团和氨基保护基的基团取代。

在一些优选的实施方案中，本发明的化合物为式i的化合物或其立体异构体、盐、溶剂合物、结晶，其中r⁴和r⁵与它们所连接的一起形成噁唑烷酮，所述噁唑烷酮任选被一个或多个选自卤素、羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、甲基、乙基、丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、氧代基团和氨基保护基的基团取代。

在一些优选的实施方案中，本发明提供式ia的化合物或其立体异构体、盐、溶剂合物、结晶，

其中r¹和r²具有以上式i中的定义；

r⁶选自氢和氨基保护基。

在一些优选的实施方案中，本发明的化合物为式i的化合物或其立体异构体、盐、溶剂合物、结晶，其中：

r⁶选自氢、烷基三硅烷基、芳基三硅烷基、烷基、烷基酰基、芳基酰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、烷氧基、芳基氧基和烷基氨基酰基，所述烷基三硅烷基、芳基三硅烷基、烷基、烷基酰基、芳基酰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、烷氧基、芳基氧基和烷基氨基酰基任选被一个或多个选自卤素、羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、烷基和烷氧基的基团取代；

进一步优选地，r⁶选自氢、c1-3烷基三硅烷基、c6-8芳基三硅烷基、c1-3烷基、c1-3烷基酰基、c6-8芳基酰基、c1-3烷基磺酰基、c6-8芳基磺酰基、c1-3烷氧基羰基、c6-8芳基氧基羰基c1-3烷氧基、c6-8芳基氧基和c1-3烷基氨基酰基，所述的c1-3烷基三硅烷基、c6-8芳基三硅烷基、c1-3烷基、c1-3烷基酰基、c6-8芳基酰基、c1-3烷基磺酰基、c6-8芳基磺酰基、c1-3烷氧基羰基、c6-8芳基氧基羰基c1-3烷氧基、c6-8芳基氧基和c1-3烷基氨基酰基任选被一个或多个选自卤素、羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、c1-3烷基和c1-3烷氧基的基团取代。

更进一步优选地，r⁶选自氢、三甲基硅基、三乙基硅基、三异丙基硅基、叔丁基二甲基硅基、叔丁基二苯基硅基、甲基、叔丁基、烯丙基、三苯甲基、苄基、甲氧基甲基、乙氧基乙基、2-四氢吡喃基(thp)、甲酰基、乙酰基、三氟乙酰基、苯甲酰基、甲磺酰基、乙磺酰基、苯甲磺酰基、甲氧羰基、乙氧羰基、苄氧羰基、2-联苯基-2-丙氧羰基、笏甲氧羰基、苯氧羰基、叔丁氧羰基(t-butyloxycarbonyl，boc)、甲氧基、乙氧基、苯氧基、三甲基硅基乙氧基、(3-羟基-1-甲氧基-1-氧代环丙烷-2-基)氨基甲酰基和(1,3-二羟基-1-氧代环丙烷-2-基)氨基甲酰基。

本发明提供以下化合物：

本发明还提供了式i的化合物或其立体异构体、盐、溶剂合物、结晶的制备方法，其中所述方法包括如下步骤：

a)式1的化合物和式2的化合物反应得到式3的中间体；

b)式3的中间体经反应得到式i的化合物；

其中，r¹、r²、r³、r⁴、r⁵具有以上式i中的定义，式1的化合物、式2的化合物可经商购获得或通过本领域技术人员的常规技术手段制得。

在一些优选的实施方案中，根据本发明的式i的化合物或其立体异构体、盐、溶剂合物、结晶的制备方法，其中所述式i的化合物为式ia的化合物。

在一些优选的实施方案中，本发明提供式c的化合物的制备方法，包括使式a的化合物和式b的化合物反应的步骤，

在一些优选的实施方案中，本发明提供式c的化合物的制备方法，其中反应溶剂选自二氯甲烷、n,n-二甲基甲酰胺、乙酸乙酯和四氢呋喃中的一种或多种；进一步优选地，所述反应溶剂选自二氯甲烷。在一些优选的实施方案中，本发明提供式c的化合物的制备方法，其中式a的化合物和式b的化合物反应时使用缩合剂，所述缩合剂选自1-丙基磷酸酐、2-(7-氧化苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)和氯甲酸异丁酯(ibcf)；进一步优选地，所述缩合剂选自1-丙基磷酸酐。在一些优选的实施方案中，本发明提供式c的化合物的制备方法，其中反应温度为-30℃-60℃，进一步优选为-20℃-40℃，更进一步优选为-10℃-25℃。

在一些优选的实施方案中，本发明提供式d的化合物的制备方法，包括使式c的化合物在脱水剂的作用下发生闭环的步骤，

在一些优选的实施方案中，本发明提供式d的化合物的制备方法，其中所述脱水剂选自亚硫酰氯、三氯氧磷、三甲基氯硅烷、三氟甲磺酰氯、多聚磷酸、4-甲基苯磺酰氯和碘/三苯基膦；进一步优选地，所述脱水剂选自4-甲基苯磺酰氯和碘/三苯基膦。在一些优选的实施方案中，本发明提供式d的化合物的制备方法，其中反应溶剂选自乙腈、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇、环己烷、二氯甲烷和二氧六环中的一种或多种；进一步优选地，所述反应溶剂选自乙腈和二氯甲烷。

在一些优选的实施方案中，本发明提供式e的化合物的制备方法，包括使式d的化合物脱除氨基保护基的步骤，

在一些优选的实施方案中，本发明提供式e的化合物的制备方法，其中反应溶剂选自乙腈、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇、环己烷、二氯甲烷和二氧六环中的一种或多种；进一步优选地，所述反应溶剂选自二氯甲烷、二氧六环和乙醇中的一种或多种。在一些优选的实施方案中，本发明提供式e的化合物的制备方法，其中氨基保护基的脱除剂选自三氟乙酸和盐酸；进一步优选地，所述氨基保护基的脱除剂为三氟乙酸。

在一些优选的实施方案中，本发明提供式g的化合物的制备方法，包括使式e的化合物和式f的化合物反应的步骤，

在一些优选的实施方案中，本发明提供式g的化合物的制备方法，其中式e的化合物和式f的化合物反应时使用缩合剂，所述缩合剂选自三(三氯甲基)碳酸酯和n,n-羰基二咪唑；进一步优选，所述缩合剂为三(三氯甲基)碳酸酯。

在一些实施方案中，本发明提供式h的化合物的制备方法，包括使式g的化合物发生反应的步骤，

在一些实施方案中，本发明提供式i的化合物的制备方法，包括使式h的化合物与碱性试剂反应的步骤，

在一些优选的实施方案中，本发明提供式i的化合物的制备方法，其中所述的碱性试剂选自dbu、叔丁醇钾、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸钠、磷酸钾、氢氧化钠、碳酸铯；进一步优选地，所述的碱性试剂选自碳酸铯。

第三方面，本发明提供(((1r,3s)-1-(5-((1s,2r)-1-氨基-2-羟丙基)-1,3,4-噁二唑-2-基)-3-(氰甲基)环丁基)氨基甲酰基)-l-丝氨酸或其药学可接受的盐、异构体、溶剂合物、结晶或前药的制备方法，所述方法包括使用以上本发明的式i或式ia的化合物或其立体异构体作为中间体的步骤。

在一些实施方案中，本发明提供的式a的化合物或其药学可接受的盐、异构体、溶剂合物、结晶或前药的制备方法，包括使式i的化合物发生酯水解、脱除氨基保护基的步骤。

第四方面，本发明提供式i或式ia的化合物或其立体异构体在制备式a的化合物或其药学可接受的盐、异构体、溶剂合物、结晶或前药中的应用。

本发明的发明人发现，使用本发明的式i或式ia化合物或其异构体制备式a化合物或其药学可接受的盐、异构体、溶剂合物、结晶或前药的方法，反应条件温和，纯化容易，工艺稳定，易于操作，同时具有较高的收率和纯度，有利于工业化大生产。

术语说明

本发明的“氨基保护基”是指本领域已知的适当的用于氨基保护的基团，参见文献(“protectivegroupsinorganicsynthesis”，5thed.t.w.greene&p.g.m.wuts)中所述的氨基保护基团。例如，所述的氨基保护基可以是(c1-10烷基或芳基)三硅烷基，例如三甲基硅基、三乙基硅基、三异丙基硅基、叔丁基二甲基硅基、叔丁基二苯基硅基等；可以是c1-10烷基或取代烷基，例如甲基、叔丁基、烯丙基、三苯甲基、苄基、甲氧基甲基、乙氧基乙基、2-四氢吡喃基(thp)等；可以是(c1-10烷基或芳基)酰基，例如甲酰基、乙酰基、三氟乙酰基、苯甲酰基等；可以是(c1-6烷基或c6-10芳基)磺酰基，例如甲磺酰基、乙磺酰基、苯甲磺酰基等；可以是(c1-6烷氧基或c6-10芳基氧基)羰基，例如甲氧羰基、乙氧羰基、苄氧羰基、2-联苯基-2-丙氧羰基、笏甲氧羰基、苯氧羰基、叔丁氧羰基；也可以是c1-6烷氧基或c6-10芳基氧基，例如甲氧基、乙氧基、苯氧基、三甲基硅基乙氧基等。

本发明的“羟基基保护基”是指本领域已知的适当的用于羟基保护的基团，参见文献(“protectivegroupsinorganicsynthesis”，5thed.t.w.greene&p.g.m.wuts)中所述的羟基保护基团。作为示例，优选地，所述的羟基保护基可以是(c1-10烷基或芳基)3硅烷基，例如：三乙基硅基，三异丙基硅基，叔丁基二甲基硅基，叔丁基二苯基硅基等；可以是c1-10烷基或取代烷基，例如：甲基，叔丁基，烯丙基，苄基，甲氧基甲基，乙氧基乙基，2-四氢吡喃基(thp)等；可以是(c1-10烷基或芳香基)酰基，例如：甲酰基，乙酰基，苯甲酰基等；可以是(c1-6烷基或c6-10芳基)磺酰基；也可以是(c1-6烷氧基或c6-10芳基氧基)羰基。

本发明的“烷基”是指直链或支链的饱和烃基。合适的烷基为取代或未取代的c1-10烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、环丁基、正戊基、异戊基、环戊基、环己基、正己基等。

本发明的“烷氧基”是指-o-烷基。根据本发明，合适的烷氧基为c1-10烷氧基，如c1-8烷氧基、c1-7烷氧基、c1-6烷氧基、c1-5烷氧基、c1-4烷氧基、c1-3烷氧基，包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、异丁氧基、仲丁氧基等。

本发明的“异构体”是指分子中原子在空间上排列方式不同所产生的立体异构体，包括对映异构体和非对映异构体。

具体实施方式

下面代表性的实施例是为了更好地说明本发明，而非用于限制本发明的保护范围。以下实施例中使用的材料如无特殊说明均为商购获得。

实施例1：((1r,3s)-3-(氰甲基)-1-(5-((4s,5r)-5-甲基-2-氧代噁唑烷酮-4-基)-1,3,4-噁二唑-2-基)环丁基)氰基甲酸叔丁酯

步骤1：(4s,5r)-5-甲基-2-氧代噁唑烷酮-4-羧酸的制备

向l-苏氨酸(15.0g,125.92mmol)的氢氧化钠(1mol/l,450ml)溶液中缓慢滴加三(三氯甲基)碳酸酯(37.4g,125.92mmol)的1,4-二氧六环(300ml)溶液，滴完室温搅拌6小时，减压浓缩至干，加入热乙腈(450ml)搅拌，过滤，滤液浓缩至干，得标题化合物(18.1g,收率99.0％)。m/zcalcdforc5h7no4[m+h]⁺146.0,found146.1。

步骤2：2-((4s,5r)-5-甲基-2-氧代噁唑烷酮-4-羰基)肼-1-羧酸苄酯的制备

氮气保护下，-10℃下，向(4s,5r)-5-甲基-2-氧代噁唑烷酮-4-羧酸(10.0g,68.91mmol)的乙腈(250ml)溶液中依次滴加肼基甲酸苄酯(12.8g,25.8mmol)、三乙胺(52.3g,516.8mmol)和1-丙基磷酸酐(43.9g,137.8mmol)的乙酸乙酯溶液，滴完于-10℃下搅拌5小时，tlc监控反应终点。减压浓缩，加入水(250ml)，乙酸乙酯(250mlx4)萃取，有机相干燥浓缩，所得残留物经柱层析色谱纯化，得标题化合物(5.8g,收率28.7％)。m/zcalcdforc13h15n3o5[m+h]⁺294.1,found294.1。

步骤3：(4s,5r)-5-甲基-2-氧代噁唑烷酮-4-碳酰肼的制备

向2-((4s,5r)-5-甲基-2-氧代噁唑烷酮-4-羰基)肼-1-羧酸苄酯(5.8g,19.8mmol)的甲醇(50ml)溶液中加入10％钯碳(0.6g)，氢气置换，维持氢气氛围常压氢化，室温搅拌12小时，tlc监控反应终点，过滤，甲醇洗涤，有机相减压浓缩至干，得标题化合物(3.0g,收率95.3％)。m/zcalcdforc5h9n3o3[m+h]⁺160.06,found160.0。

步骤4：(1r,3r)-1-氨基-3-(羟甲基)环丁烷-1-羧酸甲酯的制备

氮气保护下，向(1r,3r)-1-氨基-3-(羟甲基)环丁烷-1-羧酸(500mg,3.44mmol)的甲醇(8ml)溶液中缓慢滴加二氯亚砜(491mg,4.13mmol)，滴完回流2小时，tlc监控反应终点，减压浓缩至干，得标题化合物(550mg,81.7％)。m/zcalcdforc7h13no3[m+h]⁺160.01,found160.0。

步骤5：(1r,3r)-1-((叔丁氧羰基)氨基)-3-(羟甲基)环丁烷-1-羧酸甲酯的制备

向(1r,3r)-1-氨基-3-(羟甲基)环丁烷-1-羧酸甲酯(550mg,2.81mmol)的甲醇(11ml)溶液中依次加入二碳酸二叔丁酯(1.2g,5.62mmol)、三乙胺(2.8g,28.11mmol)，50℃搅拌6小时，tlc监控反应终点，减压浓缩至干，所得残留物经柱层析色谱纯化，得标题化合物(510mg,收率70.1％)。m/zcalcdforc12h21no5[m-h]^-258.1,found258.1。

步骤6：(1r,3r)-1-((叔丁氧羰基)氨基)-3-((甲磺酰氧基)甲基)环丁烷-1-羧酸甲酯的制备

氮气保护下，-10℃下向(1r,3r)-1-((叔丁氧羰基)氨基)-3-(羟甲基)环丁烷-1-羧酸甲酯(510mg,1.97mmol)的二氯甲烷(10ml)溶液中，依次滴入甲磺酰氯(338mg,2.95mmol)、三乙胺(399mg,3.94mmol)，滴完室温搅拌1小时，减压浓缩，所得残留物经柱层析色谱纯化，得标题化合物(620mg,收率93.4％)。m/zcalcdforc13h23no7s[m-h]^-336.12,found336.1。

步骤7：(1r,3r)-1-((叔丁氧羰基)氨基)-3-(氰甲基)环丁烷-1-羧酸甲酯的制备

氮气保护下，向(1r,3r)-1-((叔丁氧羰基)氨基)-3-((甲磺酰氧基)甲基)环丁烷-1-羧酸甲酯(100mg,0.30mmol)的n,n-二甲基甲酰胺溶液中依次加入碳酸钾(82mg,0.60mmol)、四丁基氟化铵(15μl,1mol/linthf)、三甲基氰硅烷(45mg,0.45mmol)，80℃加热搅拌3小时，lc-ms监控反应终点，反应液倒入水中，二氯甲烷萃取，所得残留物经柱层析色谱纯化，得标题化合物(56mg,71％)。m/zcalcdforc13h20n2o4[m-h]^-267.14,found267.1。

步骤8：(1r,3r)-1-((叔丁氧羰基)氨基)-3-(氰甲基)环丁烷-1-羧酸的制备

向(1r,3r)-1-((叔丁氧羰基)氨基)-3-(氰甲基)环丁烷-1-羧酸(5.0g,18.64mmol)的四氢呋喃/水(50ml,3:1)溶液中加入氢氧化锂(0.7g,27.95mmol)，室温搅拌5小时，减压浓缩至干，加入水(50ml)，二氯甲烷(20mlx2)萃取，水相用饱和柠檬酸调剂ph至3～4，乙酸乙酯(100mlx3)萃取，合并有机相，干燥，减压浓缩至干，得标题化合物(5.0g,收率94.8％)。m/zcalcdforc12h18n2o4[m-h]^-253.13,found253.1。

步骤9：((1r,3r)-3-(氰甲基)-1-(2-((4s,5r)-5-甲基-2-氧代噁唑烷酮-4-羰基)肼-1-羰基)环丁基)氨基甲酸叔丁酯的制备

氮气保护下，向(1r,3r)-1-((叔丁氧羰基)氨基)-3-(氰甲基)环丁烷-1-羧酸(3.8g，14.90mmol)的二氯甲烷(50ml)溶液中依次加入(4s,5r)-5-甲基-2-氧代噁唑烷酮-4-碳酰肼(2.9g,17.89mmol)和三乙胺(7.5g,74.50mmol)。控制温度低于-15℃以下缓慢滴入1-丙基磷酸酐(9.5g,29.8mmol)的乙酸乙酯溶液。滴完后-10℃下反应5小时，tlc监控反应终点。加入水(50ml)搅拌20分钟，柠檬酸饱和溶液调节ph至4～5，乙酸乙酯(100mlx5)萃取，有机相浓缩，所得残留物经柱层析色谱纯化，得标题化合物(5.5g,收率97.8％)。m/zcalcdforc17h25n5o6[m-h]^-394.18,found394.1。

步骤10：((1r,3s)-3-(氰甲基)-1-(5-((4s,5r)-5-甲基-2-氧代噁唑烷酮-4-基)-1,3,4-噁二唑-2-基)环丁基)氰基甲酸叔丁酯的制备

氮气保护下，向((1r,3r)-3-(氰甲基)-1-(2-((4s,5r)-5-甲基-2-氧代噁唑烷酮-4-羰基)肼-1-羰基)环丁基)氨基甲酸叔丁酯(2.4g,6.12mmol)的乙腈(100ml)溶液中加入4-甲基苯磺酰氯(2.3mmol,12.24mmol)，室温下缓慢滴入n,n-二异丙基乙胺(2.4g,18.4mmol)，滴完后升温至45℃反应5小时，tlc监控反应终点。反应结束后恢复至室温，乙酸乙酯(200mlx3)萃取，有机相减压浓缩，所得残留物经柱层析色谱纯化，得标题化合物(1.2g,收率52.0％)。m/zcalcdforc17h23n5o5[m-h]^-376.17,found376.2。

实施例2：2-((1s,3r)-3-氨基-3-(5-((4s,5r)-5-甲基-2-氧代噁唑烷酮-4-基)-1,3,4-噁二唑-2-基)环丁基)乙腈三氟乙酸盐

氮气保护下，向((1r,3s)-3-(氰甲基)-1-(5-((4s,5r)-5-甲基-2-氧代噁唑烷酮-4-基)-1,3,4-噁二唑-2-基)环丁基)氰基甲酸叔丁酯(1.5g,3.97mmol)的二氯甲烷(15ml)溶液中滴加三氟乙酸(4.5g,39.70mmol)，滴完室温搅拌2h，tlc监控反应终点。减压浓缩至干，所得残留物经柱层析色谱纯化，得标题化合物(1.2g,77.3％)。¹hnmr(d2o,400mhz)δ5.02～5.07(m,2h),3.03～3.13(m,1h),2.76～2.77(d,j＝4hz,2h),2.59～2.67(m,4h),1.59～1.61(d,j＝8hz,3h)；m/zcalcdforc12h15n5o3[m+h]⁺278.12,found278.2。

实施例3：2-((1s,3r)-3-氨基-3-(5-((4s,5r)-5-甲基-2-氧代噁唑烷酮-4-基)-1,3,4-噁二唑-2-基)环丁基)乙腈

制备方法类似于实施例2的制备方法，不同的是减少三氟乙酸的用量，制得标题化合物。

实施例4：(((1r,3s)-3-(氰甲基)-1-(5-((4s,5r)-5-甲基-2-氧代噁唑烷酮-4-基)-1,3,4-噁二唑-2-基)环丁基)氨基甲酰基)-l-丝氨酸甲酯

氮气保护下，在-20℃下，向四氢呋喃(5ml)溶液中依次缓慢滴入三光气(272mg,0.92mmol)、o-(叔丁基二甲硅基)-l-丝氨酸甲酯(143mg,0.61mmol)的四氢呋喃(5ml)溶液；滴完，室温搅拌2小时，tlc监控反应终点。减压浓缩至干，用四氢呋喃(5ml)溶解，加入三乙胺(263mg,2.60mmol)，将2-((1s,3r)-3-氨基-3-(5-((4s,5r)-5-甲基-2-氧代噁唑烷酮-4-基)-1,3,4-噁二唑-2-基)环丁基)乙腈三氟乙酸盐(200mg,0.51mmol)的四氢呋喃(5ml)溶液室温下滴入，滴完室温搅拌12h，减压浓缩，二氯甲烷(50ml)溶解，饱和柠檬酸溶液洗涤，有机相饱和食盐水洗涤，加入柱层析硅胶(2g)搅拌5h，过滤，有机相减压浓缩，所得残留物经柱层析色谱纯化，得标题化合物(120mg,收率55.8％)。m/zcalcdforc17h22n6o7[m+h]⁺423.15,found423.2。

实施例5：(4s,5r)-4-(5-((1r,3s)-3-(氰甲基)-1-(3-((s)-3-羟基-1-甲氧基-1-氧丙烷-2-基)脲)环丁基)-1,3,4-噁二唑-2-基)-5-甲基-2-氧代噁唑烷酮-3-羧酸叔丁酯

氮气保护下，向(((1r,3s)-3-(氰甲基)-1-(5-((4s,5r)-5-甲基-2-氧代噁唑烷酮-4-基)-1,3,4-噁二唑-2-基)环丁基)氨基甲酰基)-l-丝氨酸甲酯(100mg,0.24mmol)的乙腈(5ml)溶液中依次滴加二碳酸二叔丁酯(78mg,0.36mmol)的乙腈(2ml)溶液、4-二甲氨基吡啶(15mg,0.12mmol)的乙腈(2ml)溶液。滴完室温搅拌4h，tlc监控反应终点。减压浓缩，二氯甲烷溶解，水洗，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，所得残留物经柱层析色谱纯化，得标题化合物(75mg,59.9％)。m/zcalcdforc22h30n6o9[m-h]^-521.21,found521.2。

实施例6：(((1r,3s)-1-(5-((1s,2r)-1-((n-叔丁氧羰基)氨基)-2-羟丙基)-1,3,4-噁二唑-2-基)-3-(氰甲基)环丁基)氨基甲酰基)-l-丝氨酸甲酯

氮气保护下，向(4s,5r)-4-(5-((1r,3s)-3-(氰甲基)-1-(3-((s)-3-羟基-1-甲氧基-1-氧丙烷-2-基)脲)环丁基)-1,3,4-噁二唑-2-基)-5-甲基-2-氧代噁唑烷酮-3-羧酸叔丁酯(200mg,0.38mmol)的甲醇溶液中加入碳酸铯(124mg,0.38mmol)，室温搅拌4h，减压浓缩，所得残渣经柱层析色谱纯化，得标题化合物(150mg,79.6％)。m/zcalcdforc21h32n6o8[m-h]^-495.23,found495.2。

实施例7：(((1r,3s)-1-(5-((1s,2r)-1-氨基-2-羟丙基)-1,3,4-噁二唑-2-基)-3-(氰甲基)环丁基)氨基甲酰基)-l-丝氨酸的制备

氮气保护下，向(((1r,3s)-1-(5-((1s,2r)-1-((n-叔丁氧羰基)氨基)-2-羟丙基)-1,3,4-噁二唑-2-基)-3-(氰甲基)环丁基)氨基甲酰基)-l-丝氨酸甲酯(500mg,1.01mmol)的四氢呋喃/水(3:1,10ml)溶液中加入氢氧化锂(36mg,1.52mmol)，室温搅拌5h，tlc监控反应终点，减压浓缩至干，加入水(20ml)，二氯甲烷(10mlx2)萃取，水相用饱和柠檬酸溶液调ph至3～4，乙酸乙酯(20mlx3)萃取，有机相无水硫酸钠干燥，减压浓缩至干，依次加入二氯甲烷(5ml)、三氟乙酸/苯酚(5ml,95:5)，氮气保护下室温搅拌0.5h，hplc监控反应终点，室温减压浓缩，低温减压干燥30min，将反应液倒入20ml甲基叔丁基醚中，-15℃下搅拌1h，过滤，所得粗品用乙醇(5ml)溶解，氨水调节ph至5～6，析出白色固体，滴加异丙醇(5ml)，室温搅拌1h，过滤，干燥，得标题化合物(289mg,74.9％)。¹hnmr(d2o,400mhz)δ4.70～4.72(d,j＝8hz,1h),4.33～4.40(m,1h),4.10～4.12(t,j＝4hz,1h),3.63～3.69(m,2h),3.02～3.09(m,1h),2.58～2.78(m,6h),1.32～1.34(d,j＝8hz,3h)；m/zcalcdforc15h22n6o6[m+h]⁺383.16,found383.2。

根据以上方法制备的本发明的(((1r,3s)-1-(5-((1s,2r)-1-氨基-2-羟丙基)-1,3,4-噁二唑-2-基)-3-(氰甲基)环丁基)氨基甲酰基)-l-丝氨酸具有较高的收率、纯度和光学纯度，反应条件温和，纯化容易，工艺稳定，易于操作，能够满足工业规模的生产和应用。

实验例1药物代谢实验

1实验材料

1.1化合物

使用本发明式a化合物((((1r,3s)-1-(5-((1s,2r)-1-氨基-2-羟丙基)-1,3,4-噁二唑-2-基)-3-(氰甲基)环丁基)氨基甲酰基)-l-丝氨酸)和wo2015/033301中实施例2的化合物(简称“化合物b”)进行该实验。口服药物用生理盐水溶解，制成0.5mg/ml澄清溶液，静脉药物用生理盐水溶解，制成0.1mg/ml澄清溶液。

1.2动物

雄性balb/c小鼠，每组各3只，体重18-22g，上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供。

受试小鼠实验前给予2～4天的环境适应期，给药前禁食8-12h，给药2h后给水，4h后给食。

1.3试剂

甲醇(色谱纯)：spectrum公司生产；

乙腈(色谱纯)：spectrum公司生产；

其余试剂均为市售分析纯。

1.4仪器

美国ab公司api4500型三重四级杆液质联用仪，配有电喷雾离子源(esi)，lc-30ad双泵；sil-30ac自动进样器；cto-30ac柱温箱；dgu-20a3r脱气机；analystqsa01.01色谱工作站；milli-q超纯水器(milliporeinc)；qilinbeiervortex-5振荡器；hitachicf16rⅹⅱ台式高速冷冻离心机。

2实验方法

1)小鼠禁食但可自由饮水12小时后，采取0时刻空白血浆；

2)取步骤1)中的小鼠，灌胃(intragastricadministration,ig)给予待测化合物10mg/kg；静脉(iv)给予待测化合物1mg/kg；

3)于灌胃后5min，15min，30min，1h，2h，4h，8h，10h，24h，从眼底静脉丛连续取血置于分布有肝素的ep管中，8000rpm/min离心5min后取上层血浆，-20℃冻存，待lc-ms/ms分析；

4)根据步骤3)所得的血药浓度-时间数据，采用winnonlin软件求算药代动力学参数；

3实验结果：

药代动力学实验数据如表1中所示，结果表明口服给予小鼠式a化合物，具有非常好的半衰期、曲线下面积以及生物利用度，成药性好，具有良好的临床应用前景。

表1本发明化合物的药代动力学数据

实验例2体内药效实验

1、实验材料

1.1化合物

使用本发明的式a化合物进行该实验。阴性对照组给予生理盐水。采用口服给药，测试化合物用生理盐水溶解，制成2mg/ml澄清溶液。

1.2动物

雌性balb/c小鼠，每组各3只，体重18-22g，上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供。受试小鼠实验前给予2～4天的环境适应期，给药前禁食8-12h，给药2h后给水，4h后给食。

1.3阳性对照

化合物b，根据wo2015/033301实施例2公开的方法制备。

2、实验方法

接种细胞后待肿瘤生长至平均体积为50mm³后，将动物随机分组，每组6只，各测试组口服给药20mg/kg，一天一次，连续给药14天。考察实验动物体重的变化及肿瘤生长是否被抑制或延缓。每周三次用游标卡尺测量肿瘤直径。

肿瘤体积的计算公式为：v＝0.5a×b²，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。

相对肿瘤增殖率t/c(％)的计算公式为：t/c＝trtv/crtvx100％(trtv：治疗组rtv；crtv：溶剂对照组rtv)。根据测量结果计算出相对肿瘤体积(relativetumorvolume，rtv)，rtv＝vt/v0，其中v0为实验开始时的肿瘤体积，vt每一次测量时的肿瘤体积。

肿瘤生长抑制率tgi(％)的计算公式为：tgi＝[1-(某处理组给药结束时平均瘤体积-该处理组开始给药时平均瘤体积)/(溶剂对照组治疗结束时平均瘤体积-溶剂对照组开始治疗时平均瘤体积)]x100％。

3、实验结论

3.1体重变化情况

本发明的化合物对小鼠结肠癌ct26细胞皮下同系移植瘤在balb/c小鼠模型的体重无影响，表2给出了本发明的式a化合物以及对照药化合物b给药后对体重的影响，表明对照组及给药组动物体重在给药期间逐渐增加，具有较好的耐受性。

表2本发明的化合物给药后对小鼠体重的影响

3.2抗肿瘤药效评价指标

药效评价指标如表3所示，给药后第14天时溶剂对照组荷瘤鼠的平均瘤体积达到1524mm³，使用本发明的式a化合物在第14天时的t/c值为39.0％，tgi值为63.7％，表示其对ct26结肠癌细胞移植瘤具有显著的抑制作用。化合物b组在第14天时的t/c值为63.9％，tgi值为37.8％，抑瘤率明显低于本发明的化合物。

表3抗肿瘤药效评价指标

注：a:均值±sem；b:肿瘤生长抑制，由t/c和tgi表示；c:p值根据肿瘤体积计算

尽管以上已经对本发明作了详细描述，但是本领域技术人员理解，在不偏离本发明的精神和范围的前提下可以对本发明进行各种修改和改变。本发明的权利范围并不限于上文所作的详细描述，而应归属于权利要求书。