4-羟基-苯甲基(2’-羟基-苯亚甲基)-酰肼的制备方法及其应用与流程

本发明涉及一种4-羟基-苯甲基(2’-羟基-苯亚甲基)-酰肼的制备方法及其应用，属于离子检测领域。

背景技术：

锌是人体中第二丰富的过渡金属元素，具有非常重要的生物学作用，与dna合成、基因表达、细胞凋亡、神经传递、信号转导及离子通道调节等过程密切相关。人体中的锌主要来源于日常的食物，而竹笋等中就含量丰富的锌元素。

目前，检测锌主要有原子吸收光谱法、电化学法、分光光度法、有机荧光探针法等方法。其中，有机荧光探针法具有灵敏度高、选择性好、反应时间快、能够进行实时区域离子测试，是一种检测zn²⁺的理想方法。因此，合成并寻找新的锌离子有机荧光增强型探针用于检测竹笋中锌的含量并进行细胞荧光成像具有非常重要的实用意义。

技术实现要素：

本发明提供一种4-羟基-苯甲基(2’-羟基-苯亚甲基)-酰肼的制备方法及其应用，可实现锌离子的定量检测，也可与锌离子结合实现s^2-的定量检测；还可与锌离子结合用于细胞荧光成像；制备方法简单，产品得率高、纯度高。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

4-羟基-苯甲基(2’-羟基-苯亚甲基)-酰肼的应用，用于荧光探针，4-羟基-苯甲基(2’-羟基-苯亚甲基)-酰肼的结构式为：

进一步，4-羟基-苯甲基(2’-羟基-苯亚甲基)-酰肼可用于锌离子的检测。发明人经研究发现，4-羟基-苯甲基(2’-羟基-苯亚甲基)-酰肼对锌离子具有高度选择性荧光增强性能，其他离子几乎不产生干扰，因此，4-羟基-苯甲基(2’-羟基-苯亚甲基)-酰肼作为专一性荧光探针分子可应用于竹笋等中锌离子检测。

用于锌离子检测时，在溶液或溶剂中，4-羟基-苯甲基(2’-羟基-苯亚甲基)-酰肼与锌离子形成络合物，溶液由无色变成浅绿色，在365nm紫外灯下荧光增强并发出蓝色荧光，所述溶液为缓冲溶液，溶剂为乙醇、甲苯、氯苯或丙酮。

发明人经研究发现，以4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)缓冲溶液(20mm,ph＝7.2,50％(v/v)ch3ch2oh)为溶剂，在(0.1～1.1)×10^-5m范围内，荧光强度与锌离子的浓度呈现线性关系，y＝840.01x+180.84,r²＝0.98914。也即，随着zn²⁺浓度的逐步增加，荧光强度逐渐增强。

发明人经研究还发现，4-羟基-苯甲基(2’-羟基-苯亚甲基)-酰肼与锌离子的组合用于荧光淬灭检测s^2-，其中，4-羟基-苯甲基(2’-羟基-苯亚甲基)-酰肼与锌离子摩尔比为1：(1±0.2)。

进一步，荧光强度与s^2-浓度满足线性关系：y＝-1685.3x+1062.8,r²＝0.9975。这样可实现s^2-的快速定量检测。

发明人经研究还发现，4-羟基-苯甲基(2’-羟基-苯亚甲基)-酰肼与锌离子的组合可用于细胞荧光成像，其中，4-羟基-苯甲基(2’-羟基-苯亚甲基)-酰肼与锌离子摩尔比为1：(0.5～2)。

4-羟基-苯甲基(2’-羟基-苯亚甲基)-酰肼的制备方法，水杨醛与4-羟基苯甲酰肼进行缩合反应，制得4-羟基-苯甲基(2’-羟基-苯亚甲基)-酰肼，反应方程式为：

为了提高产品得率，优选，4-羟基-苯甲基(2’-羟基-苯亚甲基)-酰肼的制备方法，包括如下步骤：

(1)将4-羟基苯甲酰肼、水杨醛和无水乙醇，回流反应0.5-7h，其中，4-羟基苯甲酰肼与水杨醛的摩尔比为1：(1～1.3)，无水乙醇的用量为每毫摩尔4-羟基苯甲酰肼1～20ml；

(2)将步骤(1)所得物料减压浓缩，得淡黄色粗产物；

(3)将步骤(2)所得物料提纯，得4-羟基-苯甲基(2’-羟基-苯亚甲基)-酰肼。

为了提高产品纯度，步骤(3)的提纯为利用无水乙醇重结晶，所得4-羟基-苯甲基(2’-羟基-苯亚甲基)-酰肼晶体纯度大于98.0％，得率高于90％。

本发明未提及的技术均参照现有技术。

本发明4-羟基-苯甲基(2’-羟基-苯亚甲基)-酰肼，是一种荧光增强型锌离子荧光探针，可用于定量检测竹笋等中的锌离子，也可与锌离子结合实现s^2-的定量检测；还可与锌离子结合用于细胞荧光成像；制备方法简单，产品得率高、纯度高。

附图说明

图1为4-羟基-苯甲基(2’-羟基-苯亚甲基)-酰肼与不同离子作用的荧光增强选择性实验结果图；

图2为4-羟基-苯甲基(2’-羟基-苯亚甲基)-酰肼作为荧光探针时荧光强度与锌离子浓度的线性关系；

图3为4-羟基-苯甲基(2’-羟基-苯亚甲基)-酰肼锌离子荧光探针用作荧光淬灭探针时荧光强度与s^2-浓度的线性关系；

图4为4-羟基-苯甲基(2’-羟基-苯亚甲基)-酰肼+zn²⁺对ln229细胞荧光成像图；

图5为酶体红色荧光探针(lysotrackerred)对ln229细胞荧光成像图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1

4-羟基-苯甲基(2’-羟基-苯亚甲基)-酰肼的制备：

在配有温度计、搅拌器和冷凝器的100ml三口烧瓶中，依次加入1.52g(10mmol)4-羟基苯甲酰肼、1.22g(10mmol)水杨醛和120ml无水乙醇，加热至回流温度反应1.5h；反应物浓缩至30ml，然后冷却至室温，析出淡黄色晶体，再用25ml无水乙醇进行重结晶，得到淡黄色晶体4-羟基-苯甲基(2’-羟基-苯亚甲基)-酰肼，得率为91.2％，纯度为98.7％，产物表征结果：ft-ir(kbr)v(cm^-1):3317,3159,1641,1605,1585,1541,1485,1446,1352,1280,1235,1174,1155,875,841,747,730；¹hnmr(dmso-d6,600mhz):6.90-6.94(m,4h),7.27-7.29(t,1h),7.49-7.50(d,1h),7.85-7.87(d,2h),8.62(s,1h),10.19(s,1h),11.46(s,1h),11.95(s,1h)；¹³cnmr(dmso-d6,150mhz),δ(ppm):115.68,116.94,119.21,119.80,123.73,130.20,130.28,131.66,148.24,158.01,161.49,163.04；hrms(m/z):[m+h]⁺c14h12n2o3+h⁺计算结果为257.0920，检测结果为257.0927；hrms(m/z):[m+na]⁺c14h12n2o3+na⁺计算结果为279.0746，检测结果为279.0746。

实施例2

化合物4-羟基-苯甲基(2’-羟基-苯亚甲基)-酰肼荧光探针对锌离子的选择性：

将4-羟基-苯甲基(2’-羟基-苯亚甲基)-酰肼化合物(1×10^-5m)和其他离子(15种，1×10^-5m)溶于4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)缓冲溶液(20mm,ph＝7.2,50％(v/v)ch3ch2oh)中，配制成溶液。在激发波长为380nm的条件下测得不同离子存在下的荧光强度变化，如图1所示，结果表明，4-羟基-苯甲基(2’-羟基-苯亚甲基)-酰肼对zn²⁺具有很强的荧光增强作用，说明该化合物对zn²⁺具有较好的选择性。

实施例3

4-羟基-苯甲基(2’-羟基-苯亚甲基)-酰肼荧光探针用于竹笋中锌的检测：

4-羟基-苯甲基(2’-羟基-苯亚甲基)-酰肼+锌离子的荧光强度与锌离子浓度的线性关系如图2所示。将4-羟基-苯甲基(2’-羟基-苯亚甲基)-酰肼hepes缓冲体系(1×10^-5m)中分别加入不同浓度的zn²⁺(0.1-1.1×10^-5m)，得到在380nm的激发光下的荧光强度变化，荧光强度与zn²⁺浓度表现出线性关系，y＝840.01x+180.84，r²＝0.9891，检测限(lod)＝1.13×10^-6mm。

菜市场购买鲜竹笋含水量为90.5％；鲜竹笋进行去皮、切片，45℃干燥24h除去水分，经粉碎得到竹笋粉，将含有100.0g竹笋粉坩埚放入马弗炉中进行燃烧4h，冷却后加入20ml20％(质量浓度)盐酸，搅拌12h后过滤得到滤液，滤饼用hepes缓冲溶液洗涤2次，过滤、合并滤液，用hepes缓冲溶液定容至1000ml，得到锌离子测量液。将4-羟基-苯甲基(2’-羟基-苯亚甲基)-酰肼hepes缓冲溶液(1×10^-4m)和所得锌离子测量液各1ml分别加入到10ml容量瓶中，用hepes缓冲溶液定容摇匀，测量该滤液3次的荧光强度分别为776.41，771.37，773.05，并采用方程y＝840.01x+180.84检测zn²⁺浓度分别为0.709×10^-5m、0.703×10^-5m、0.705×10^-5m，计算出100.0g竹笋粉锌的含量，同时与icp-ms的检测结果比较，结果见表1，二者测量结果高度一致。结果表明，4-羟基-苯甲基(2’-羟基-苯亚甲基)-酰肼荧光探针可用于竹笋中锌含量的检测。

表1竹笋中锌含量的检测

实施例4

4-羟基-苯甲基(2’-羟基-苯亚甲基)-酰肼+锌离子荧光探针用于检测s^2-浓度：

4-羟基-苯甲基(2’-羟基-苯亚甲基)-酰肼+锌离子荧光探针的荧光强度与s^2-浓度的线性关系如图3所示。将4-羟基-苯甲基(2’-羟基-苯亚甲基)-酰肼(1×10^-5m)+锌离子(1×10^-5m)荧光hepes缓冲体系中加入不同浓度的s^2-(0.1-0.6×10^-5m)，获得在380nm的激发光下的荧光强度变化，荧光强度与s^2-浓度具有良好的线性关系，y＝-1685.3x+1062.8,r²＝0.9975,检测限(lod)＝1.66×10^-7mm。

实施例5

人胶质瘤细胞(ln229)在含10％胎牛血清的dmem培养基中常规培养，培养24h后进行贴壁培养5h，用磷酸盐缓冲液(pbs，ph7.4)对细胞进行三次洗涤。在培养皿中分别加入含zn²⁺(1×10^-5m)的1.00mldmem培养液，37℃培养1h。完成后再用含1×10^-5m4-羟基-苯甲基(2’-羟基-苯亚甲基)-酰肼的1.00mldmem培养液在37℃孵育3h，用pbs缓冲液清洗细胞3次后，用激光共聚焦扫描显微镜记录细胞图像，如图4所示。同时，ln229细胞在相同条件下用溶酶体红色荧光探针(lysotrackerred，1×10^-5m)进行培养，用激光共聚焦扫描显微镜记录细胞图像，如图5所示。结果表明，4-羟基-苯甲基(2’-羟基-苯亚甲基)-酰肼+锌离子荧光探针可用于ln229细胞荧光成像，成像结果与lysotrackerred相同。