具有可供选择的结合表面的基于III型纤连蛋白重复的蛋白质支架的制作方法

本申请是申请日为2012年9月27日，申请号为201280046708.x，发明名称为“具有可供选择的结合表面的基于iii型纤连蛋白重复的蛋白质支架”的发明专利的分案申请。本发明涉及具有可供选择的结合表面设计的基于iii型纤连蛋白(fn3)重复的蛋白质支架和支架文库。更具体地，本发明涉及具有由挑选的β-链和环形成的凹型结合位点的fn3支架和文库。
背景技术：
：当需要对靶分子的高亲和力和特异性时，单克隆抗体是最广泛使用类型的治疗蛋白。然而，具有可被工程改造以结合期望的靶分子的相对确定的三维结构的非抗体蛋白质，通常称为蛋白质支架，因为它们的小尺寸、缺乏二硫键、高稳定性和能够在原核宿主中表达，故它们可能具有优于传统抗体的优点。这些支架通常含有可接受特异性或随机序列变异的一个或多个区域，并且经常进行这种序列随机化以产生从中可选择期望产物的蛋白质的文库。可容易地应用新型的纯化方法；支架容易与药物/毒素缀合，有效地渗透进组织并且可被设计为多特异性结合物(binz和pluckthun，curropinbiotechnol，16，459-469，2005；skerra，jmolrecognit，13，167-187，2000)。一种此类蛋白质支架是在多种蛋白质中鉴定的iii型纤连蛋白(fn3)结构域，其具有其中6个环由7个β链连接的典型三级结构。三个环(具体地，fg、bc和de环)在结构上类似于抗体的互补决定区(cdr)。这些环已被随机化来产生fn3结构域支架的文库以成功地选择许多不同靶标的特异性结合物而同时保留重要的生物物理特性(getmanova等人，chembiol，13，549-556，2006；hackel等人，jmolbiol，381，1238-1252，2008；karatan等人，chembiol，11，835-844，2004；koide等人，jmolbiol，284，1141-1151，1998；koide等人，procnatlacadsciusa，104，6632-6637，2007；parker等人，proteinengdessel，-18，435-444，2005；xu等人，chemistry&biology，9，933-942，2002)。也通过使ab、ef和cd环随机化而产生fn3结构域的文库(美国专利公布2011/0038866；国际专利公布wo2011/05133；美国专利公布2011/0124527)。对于fn3文库的其它参考文献包括国际专利公布wo2002/32925、wo2003/104418、wo2009/023184和wo2010/060095。国际专利公布wo2012/016245描述了使用cd和fg环连同β-折叠的表面暴露残基的fn3结构域。有利的是获得用于治疗和诊断两种目的的改善的纤连蛋白结构域支架蛋白质。本公开提供此类改善的蛋白质。技术实现要素：本发明的一个实施例是制备iii型纤连蛋白模块(fn3)结构域的文库的方法，所述文库具有由cβ-链、cd环、fβ-链和fg环形成的多样化c-cd-f-fg可供选择的表面，所述方法包括：提供具有与seqidno:27的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列的参考fn3结构域多肽；通过使至少一个cβ-链残基和至少一个fβ-链残基突变来将多样性引入到参考fn3结构域多肽中以形成具有多样化c-cd-f-fg可供选择的表面的fn3结构域文库。本发明的另一个方面是由本文所述的本发明的方法制备的文库。本发明的又一个方面是获得包含iii型纤连蛋白模块(fn3)结构域的蛋白质支架的方法，所述蛋白质支架具有与靶分子特异性地结合的多样化c-cd-f-fg可供选择的表面，所述方法包括使权利要求11的文库与靶分子接触或用靶分子淘选权利要求11的文库，以及分离以预定亲和力与靶分子特异性地结合的蛋白质支架。附图说明图1示出fn3结构域和抗体vh结构域结构的条带图。标记出了在结构上与cdr类似的fn3结构域的环。图2示出结构图，其使得在以下之间进行比较：a)具有随机化环的常规fn3文库(图2a)；b)具有随机化c-cd-f-fg可供选择的表面的fn3文库(tcl14文库)(图2b)；c)具有随机化a-ab-b-bc-e表面的fn3文库(tcl15文库)(图2c)。这些文库设计中被随机化的位置在条带图中被描绘为实心黑色。图3示出tencon27支架(seqidno:27)和具有随机化c-cd-f-fg可供选择的表面的tcl14文库(seqidno:28)的序列比对。对环残基加框。在序列的上方指示特定环和β-链区域。图4示出tencon27支架(seqidno:27)和具有随机化a-ab-b-bc-e可供选择的表面的tcl15文库(seqidno:61)的序列比对。对环残基加框。在序列的上方指示特定环和β-链区域。图5示出对tencon27(seqidno:27)的文库设计的拓扑图，其具有随机化c-cd-f-fg可供选择的表面(tcn14文库)。将β-链描绘为箭头，其中在tencon27结构中以氢键彼此键合的链的残基在图中相邻放置。随机化残基的位置用灰色阴影的椭圆形描绘。图6示出对tencon27(seqidno:27)的文库设计的拓扑图，其具有随机化a-ab-b-bc-e可供选择的表面(tcl15文库)。将β-链描绘为箭头，其中在tencon结构中以氢键彼此键合的链的残基在图中相邻放置。随机化残基的位置用灰色阴影的椭圆形描绘。图7示出在tcl14文库中随机化位置处预期的和观察到的氨基酸分布。图8示出tencon27、tcl14和对fn10、tn3和fibcon的设计的文库的序列比对，所述fibcon具有随机化c-cd-f-fg可供选择的表面。残基编号基于tencon27序列。分别以seqidno:28、98、99和62示出文库的氨基酸序列。对环残基加框。在序列的上方指示特定环和β-链区域。具体实施方式如本文所用，术语“iii型纤连蛋白模块(fn3)结构域”或“fn3结构域”指在蛋白质中频繁出现的结构域，所述蛋白质包括纤连蛋白、腱生蛋白、细胞内细胞骨架蛋白、细胞因子受体和原核酶(bork和doolittle，procnatacadsciusa89，8990-8994，1992；meinke等人，jbacteriol175，1910-1918，1993；watanabe等人，jbiolchem265，15659-15665，1990)。示例性的fn3结构域(或模块)是存在于人腱生蛋白c中的15种不同的fn3结构域和存在于人纤连蛋白(fn)中的15种不同的fn3结构域。单独的fn3结构域通过结构域编号和蛋白质名称来表示，例如，腱生蛋白的第3fn3结构域(tn3)，或纤连蛋白的第10fn3结构域(fn10)。如本文所用，术语“参考fn3结构域”指野生型或非天然存在的fn3结构域，其被用作其中可进行取代的模板以产生特异性地结合靶分子的蛋白质支架。如本文所用，术语“可供选择的表面”指包含两个或多个β链和至少一个环的fn3结构域的一侧上的表面。示例性的可供选择的表面是由c和fβ-链以及cd和fg环中的氨基酸形成的c-cd-f-fg表面，和由a、b和eβ-链和bc环中的氨基酸形成的a-ab-b-bc-e表面。如本文所用，术语“取代”或“取代的”或“突变”或“突变的”指在多肽或多核苷酸序列中改变、缺失或插入一个或多个氨基酸或核苷酸以产生该序列的变体。如本文所用，术语“使随机化”或“随机化的”或“多样化的”或“使多样化”指在多核苷酸或多肽序列中进行至少一处取代、插入或缺失。如本文所用“变体”指不同于参考多肽或参考多核苷酸一处或多处修改，例如取代、插入或缺失的多肽或多核苷酸。如本文所用，术语“特异性地结合”或“特异性结合”指如通过表面等离子共振所测量，本发明的fn3结构域以至少为1x10-6m的亲和力(kd)结合靶分子，和/或以比其对非特异性抗原(例如bsa或酪蛋白)的亲和力大至少10倍的亲和力结合靶分子的能力。如本文所用，术语“靶分子”指具有被本发明的fn3结构域识别的抗原或表位的蛋白质、肽、碳水化合物、脂质等。该靶分子可为天然或非天然存在的。术语“文库”是指变体的集合。文库可由多肽或多核苷酸变体组成。如本文所用，术语“腱生蛋白c”指具有genbank登录号np_002151和seqidno:57示出的序列的人腱生蛋白c。腱生蛋白c具有15个串联的fn3结构域，所述串联的fn3结构域具有seqidno:1-15中分别示出的氨基酸序列。腱生蛋白c的第3fn3结构域(tn3)的氨基酸序列以seqidno:3示出。如本文所用，术语“稳定性”指在生理条件下分子保持折叠状态以便其保持至少一种其正常功能活性例如结合靶分子的能力。本发明提供特异性地结合靶分子并因而可广泛用于治疗和诊断应用的fn3结构域。本发明基于这样的发现：位于包含两条或多条β-链和至少一个环的fn3结构域一侧的可供选择的表面可被随机化以产生和选择以高亲和力特异性地结合靶分子的蛋白质支架。已通过使顶部或底部环、在结构上与抗体可变链中的cdr类似的区域多样化来产生基于fn3的结构域文库，从而提供弯曲的结合表面。在本发明中，高亲和力结合分子选自fn3结构域文库，所述fn3结构域文库展示通过使可供选择的表面随机化而产生的凹型相互作用表面；因而可能增加了针对其可选择高亲和力结合蛋白支架的表位和靶标的数目。本发明提供编码所述蛋白质结构域的多核苷酸或其互补核酸、载体、宿主细胞以及制备和使用它们的方法。本发明提供制备fn3结构域的文库的方法，以及通过本发明的方法制备的文库。iii型纤连蛋白结构域iii型纤连蛋白(fn3)结构域(或模块)是最初在纤连蛋白中鉴定的原型重复结构域并且现在已知存在于各种动物蛋白质家族，包括细胞表面受体、细胞外基质蛋白、酶和肌肉蛋白。fn3结构域在结构上具有非常类似于免疫球蛋白样结构域的拓扑结构，不同的是缺乏二硫键。如本领域所已知，天然存在的fn3结构域具有β-夹心结构，其具有七个β-链，称为a、b、c、d、e、f和g，由六个环连接，称为ab、bc、cd、de、ef和fg环(bork和doolittle，procnatlacadsciusa89，8990-8992，1992；美国专利6,673,901)。三个环，bc、de和fg环位于fn3结构域的顶部，并且三个环，ab、cd和ef环位于结构域的底部(图1)。表1示出几种含有蛋白质的fn3结构域，以及与每种蛋白质缔合的不同fn3结构域的数目。虽然fn3结构域构象高度保守，但不同结构域之间的相似性在氨基酸水平上非常低。fn3结构域可能是天然或非天然存在的。示例性的非天然存在的fn3结构域是共有fn3结构域，其基于存在于某种蛋白质中的挑选的fn3结构域的比对而设计并且在每个位置并入最保守(频繁)的氨基酸以产生非天然存在的fn3结构域。例如，非天然存在的fn3结构域基于来自人腱生蛋白c的15个fn3结构域的共有序列，或基于来自人纤连蛋白的15个fn3结构域的共有序列而设计。这些非天然存在的fn3结构域保持fn3结构域的典型的拓扑结构，并且可表现当与野生型fn3结构域相比时的改善性质，诸如改善稳定性。示例性的非天然存在的fn3结构域是seqidno:16和58分别示出，并且描述于美国专利公布2010/0216708和美国专利公布2010/0255056的tencon和fibcon结构域。表1：表2中示出对于fn3支架tencon27(seqidno:27)的限定每个环和每条β-链的氨基酸残基。腱生蛋白c第3fn3结构域(tn3)(seqidno:3)和fibcon(seqidno:58)中每个环和β-链的位置与tencon27的位置相同。可使用熟知的方法鉴定β-链残基，例如，通过分析由x射线衍射产生的三维结构、核磁共振或分子建模。在模型不可用的情况下，与其它已知fn3分子的序列比对的分析可用于预测链和环区域的边界。最后，计算机算法可用于预测来自蛋白质一级序列的β链的存在。表2：fn3结构域tencon27(seqidno:27)a链1-12ab环13-16b链17-21bc环22-28c链29-37cd环38-43d链44-50de环51-54e链55-59ef环60-64f链65-74fg环75-81g链82-89fn3结构域上的可供选择的表面顶部(bc、de和fg)和底部(ab、cd和ef)环，例如fn3结构域中报道的结合表面被形成fn3结构的中心的β-链分隔(图1、2a)。位于具有与由环形成的表面不同的形状的fn3结构域两“侧”的可供选择的表面仅通过使fn3结构域结构旋转90度才可视(图2b、2c)。由两条反平行β-链，即c和fβ-链以及cd和fg环在fn3结构域的一侧形成稍微凹型的表面，并且在本文称为c-cd-f-fg表面。也可由a、b和eβ-链以及ab和bc环在c-cd-f-fg表面的相对侧形成可供选择的表面，在本文称为a-ab-b-bc-e表面。fn3结构域中的可供选择的表面由每个fn3结构域中氨基酸的非邻接伸展(non-contiguousstretch)编码。例如，如表2所示，tencon27c-cd-f-fg表面由seqidno:27的氨基酸残基29-43和65-81形成，并且tencon27a-ab-b-bc-e表面由seqidno:27的氨基酸残基1-28和55-59形成。基于使可供选择的表面随机化的蛋白质支架本发明的一个实施例是包含含有可供选择的表面的fn3结构域的分离的蛋白质支架，其中当与参考fn3结构域相比时，所述可供选择的表面在形成可供选择的表面的每条β-链和每个环中具有至少一种氨基酸取代。在另一个实施例中，本发明的蛋白质支架特异性地结合不被参考fn3结构域特异性地结合的靶分子。在另一个实施例中，参考fn3结构域包含seqidno:27的氨基酸序列。在另一个实施例中，本发明的蛋白质支架包含由cβ-链，cd环、fβ-链和fg环形成的c-cd-f-fg可供选择的表面。在另一个实施例中，形成c-cd-f-fg可供选择的表面的cβ-链、cd环、fβ-链或fg环包含如表4和5以及seqidno:45-48所示的氨基酸序列。在另一个实施例中，cβ-链包含在1、2、3或4个残基处具有取代的氨基酸序列dsfliqyqe(seqidno:33)，fβ-链包含在1、2、3、4或5个残基处具有取代的氨基酸序列teytvsiygv(seqidno:39)，cβ-链和cd环包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基处具有取代的氨基酸序列dsfliqyqesekvge(seqidno:42)，或fβ-链和fg环包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个残基处具有取代的氨基酸序列teytvsiygvkgghrsn(seqidno:43)。在另一个实施例中，cβ-链和fβ-链包含分别与seqidno:33至少67％相同和与seqidno:39至少70％相同的氨基酸序列，cβ-链和cd环包含与seqidno:42至少53％相同的氨基酸序列，或fβ-链和fg环包含与seqidno:43至少65％相同的氨基酸序列。在另一个实施例中，本发明的蛋白质支架包含fn3结构域，所述fn3结构域包含如seqidno:28所示的氨基酸序列。在另一个实施例中，本发明的蛋白质支架包含iii型纤连蛋白模块(fn3)结构域，所述fn3结构域包含：分别在残基1-12、13-16、17-21、22-28、44-50、51-54、55-59、60-64和82-89处具有与seqidno:27相同的氨基酸序列的aβ-链、ab环、bβ-链、bc环、dβ-链、de环、eβ-链、ef环和gβ-链；具有与seqidno:42至少53％相同的氨基酸序列的cβ-链和cd环；和具有与seqidno:43至少65％相同的氨基酸序列的fβ-链和fg环，其任选地在对应于seqidno:27的氨基酸残基11、14、17、37、46、73或86的氨基酸位置处具有至少一种取代，其中蛋白质支架特异性地结合不被参考fn3结构域特异性地结合的靶分子。在另一个实施例中，本发明的蛋白质支架包含fn3结构域，所述fn3结构域包含与seqidno:27所示的氨基酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在另一个实施例中，本发明的蛋白质支架包含由aβ-链、ab环、bβ-链、bc环和eβ-链形成的a-ab-b-bc-e可供选择的表面。在另一个实施例中，形成a-ab-b-bc-e可供选择的表面的aβ-链、ab环、bβ-链和bc环包含如表4和5以及seqidno:49和50所示的某些氨基酸序列。在另一个实施例中，aβ-链、ab环、bβ-链和bc环包含与seqidno:44至少59％相同的氨基酸序列，并且eβ-链包含与seqidno:37至少60％相同的氨基酸序列。在另一个实施例中，本发明的蛋白质支架包含fn3结构域，所述fn3结构域包含如seqidno:61所示的氨基酸序列。在另一个实施例中，本发明的分离的蛋白质支架包含fn3结构域，所述fn3结构域包含：分别在残基29-37、38-43、44-50、51-54、60-64、65-74、75-81和82-89处具有与seqidno:27相同的氨基酸序列的cβ-链、cd环、dβ-链、de环、ef环、fβ-链、fg环和gβ-链；具有与seqidno:44至少59％相同的氨基酸序列的aβ-链、ab环、bβ-链和bc环；和与seqidno:37至少60％相同的氨基酸序列的eβ-链，其任选地在对应于seqidno:27的氨基酸残基11、14、17、37、46、73或86的氨基酸位置处具有至少一种取代，其中所述蛋白质支架特异性地结合不被参考fn3结构域特异性地结合的靶分子。特异性地结合靶分子的fn3结构域可通过使形成可供选择的表面的残基的子组随机化来产生。例如，在有助于形成可供选择的表面的每条β-链和每个环中，至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个残基可被随机化。另外的残基可被随机化以增加文库的多样性。例如，形成所述可供选择的表面的每条β-链和每个环中20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的残基可被随机化。作为另外一种选择，特异性地结合靶分子的fn3结构域可通过使有助于形成所述可供选择的表面的β-链中残基的子组随机化而不使环的任何残基随机化来产生。例如，在有助于形成可供选择的表面的每条链中，至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个残基可被随机化。可通过使位于β-链中另外的残基随机化来增加文库多样性。例如，形成所述可供选择的表面的每条β-链中20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的残基可被随机化。β-链具有重复结构，其中每隔一个残基的侧链暴露于蛋白质的表面。通过检查三维结构或通过经由多序列比对与具有已知结构的fn3结构域的序列比较来确定表面暴露的侧链。可选择有助于形成可供选择的表面的β-链中的表面暴露残基的全部或子组进行随机化。例如，tencon27(seqidno:27)c-cd-f-fg可供选择的表面在cβ-链中具有4个表面暴露残基(s30、l32、q34和q36)并且在fβ-链中具有5个表面暴露残基(e66、t68、s70、y72和v74)，残基编号基于seqidno:27。这些残基的一个或多个可被随机化以产生文库。在可供选择的表面的接合处的残基，诸如s30、e66和v74可被随机化或可不被随机化。β-链的内埋残基的随机化由于结构的核心中疏水触点的丧失可导致支架不稳定。内埋残基可被随机化使得使用仅氨基酸的子组，例如仅疏水氨基酸。有助于形成可供选择的表面的环区域中一个子组的残基或所有残基可被随机化。例如，在有助于形成可供选择的表面的cd和/或fg环中0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个位置可被取代。环中的甘氨酸残基，诸如g42、g76和/或tencon27中的g77可提供灵活性并且可被随机化或可不被随机化。在β-链/环边界处的残基，诸如tencon27中的e43可被随机化或可不被随机化。β-链或环区域中的另外残基可被纳入随机化或从随机化排除。例如，基于例如fn3结构域的晶体结构的分析而鉴定的似乎对稳定性必需的残基可被随机化或可不被随机化。例如，tencon27中的s80与fn3结构域核心接触以可能使fg环稳定，并且k75部分地转向远离可供选择的表面。因此，这些残基都可从初始文库设计排除。在具有随机化c-cd-f-fg表面的示例性fn3结构域文库中，可被随机化的残基包括seqidno:27的位置30、32、34、36、38、39、40、41、42、43、66、68、70、72、74、75、76、77、78、79、80、或81处的残基。在具有随机化a-ab-b-bc-e表面的示例性fn3结构域文库中，可被随机化的残基包括位置6、8、10、11、12、13、14、15、16、18、20、22、23、24、25、26、27、55和57处的残基。有助于形成可供选择的表面的环处的多样性可通过环处残基的插入和/或缺失来实现。例如，fg和/或cd环可延伸1-22个氨基酸，或减少1-3个氨基酸。tencon27中的fg环的长度为7个氨基酸，而抗体重链中相应环的范围为4-28个残基。为提供最大的多样性，有助于形成可供选择的表面的环，例如fg环，可在序列以及长度方面被多样化以对应于4-28个残基的抗体cdr3长度范围。特异性地结合靶分子的所得fn3结构域可在位于可供选择的表面外部或可供选择的表面内的残基处被进一步修饰以用于以下目的，例如提高稳定性、降低免疫原性、增强结合亲和力、结合速率、解离速率、半衰期、溶解度或任何其它合适的特征。在实现这一目的的一种方式中，可通过使用亲本和工程改造序列的三维模型分析亲本序列和各种概念上的工程改造产物的过程任选地制备支架蛋白质。三维模型通常可用并且为本领域技术人员所熟悉。计算机程序可用，其说明并且显示所选择的候选序列的可能的三维构象结构并且可测量可能的免疫原性(例如，immunofilterprogramofxencor，inc.ofmonrovia，ca)。对这些显示的检测允许分析对候选序列的功能起作用的残基的可能作用，例如，影响支架蛋白质的稳定性或候选支架蛋白质结合其靶分子的能力的残基。按此方式，可由亲本和参考序列选择并组合残基以便实现期望的特性，诸如提高的支架稳定性。作为另外一种选择或除了以上程序，可如本领域所已知使用其它合适的工程改造方法。本发明的fn3结构域的期望的物理特性包括高热稳定性以及热折叠和解折叠的可逆性。多种方法已应用于增加蛋白质和酶的表观热稳定性，包括基于与高度相似的热稳定序列比较的合理设计、稳定二硫桥的设计、增加α-螺旋倾向的突变、对盐桥进行工程改造、蛋白质表面电荷的改变、定向进化和共有序列的构成(lehmann和wyss，curropinbiotechnol，12，371-375，2001)。高度的热稳定性可增加所表达蛋白质的产量、提高溶解度或活性、降低免疫原性并且使生产中对冷链的需要最小化。可通过进行取代并测定支架的期望特性来确定可被取代以改善本发明的fn3结构域的任何特性的残基。具有改善的特性的示例性的基于fn3结构域的支架为tencon支架(seqidno:16)或tencon27支架(seqidno:27)，其在一个或多个氨基酸残基位置11、14、17、37、46、73或86处被修饰。根据稳定性的丧失，即，蛋白质的“变性(denaturing/denaturation)”意指其中赋予蛋白质的功能特性的三维构象的一些或全部已伴随活性和/或溶解性的丧失而丧失的过程。在变性过程中被破坏的力包括分子内键，例如，静电力、疏水力、范德华力、氢键和二硫键。蛋白质变性可由施加于蛋白质或包含蛋白质的溶液的力和由化学变性剂引起，所述力诸如机械力(例如压力或剪切力)，热、渗透应力、ph的变化、电场或磁场、电离辐射、紫外线辐射和脱水。蛋白质稳定性和蛋白质易变性的测量可视为蛋白质完整性的相同或不同方面。蛋白质对由热、由紫外线或电离辐射、环境同渗容摩和ph(如果在液体溶液中)的变化、由小孔径过滤施加的机械剪切力、紫外线辐射、电离辐射(诸如由γ辐射)、化学或热脱水或任何其它可造成蛋白质结构破坏的作用或力引起的变性敏感或“易变”。可使用标准方法确定分子的稳定性。例如，可通过使用标准方法测量热解链(“tm”)温度，即1/2的分子变为解折叠的以摄氏度(℃)表示的温度来确定分子的稳定性。通常，tm越高，分子越稳定。除了热之外，化学环境也改变蛋白质的稳定性以保持特定的三维结构。在一个实施例中，由tm的增加所测量，与工程改造之前的相同结构域相比，本发明的fn3结构域表现稳定性增加至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更多。可通过多种方法同样地测量化学变性。化学变性剂包括盐酸胍、硫氰酸胍、脲、丙酮、有机溶剂(dmf、苯、乙腈)、盐(硫酸铵、溴化锂、氯化锂、溴化钠、氯化钙、氯化钠)；还原剂(例如二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、二硝基硫苯和氢化物，诸如硼氢化钠)、非离子和离子型去污剂、酸(例如盐酸(hcl)、乙酸(ch3cooh)、卤代乙酸)、疏水分子(例如，磷脂)和靶向变性剂。变性程度的定量可依赖于功能性质的丧失，诸如结合靶分子的能力，或通过物理化学性质定量，诸如聚集的趋势、先前溶剂不可及残基的暴露或二硫键的破坏或形成。在一个实施例中，如通过使用盐酸胍作为化学变性剂所测量，与工程改造之前的相同支架相比，本发明的支架表现稳定性增加至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更多。使用熟知的方法，在用增加浓度的盐酸胍处理后，增加的稳定性可测量为降低的色氨酸荧光的函数。可使用任何fn3结构域作为模板以供根据本发明提供的方法取代来产生特异性地结合本发明的靶分子的fn3结构域。具有随机化可供选择的表面的示例性fn3结构域为腱生蛋白c的第3fn3结构域(tn3)(seqidno:3)、tencon(seqidno:16)、tencon27(seqidno:27)、fibcon(seqidno:58)，以及纤连蛋白的第10fn3结构域(fn10)(seqidno:97)。描绘tencon27中可供选择的表面的氨基酸位置示出在表2和图8中，并且在tencon、tn3和fibcon线性序列中相同描绘fn10中可供选择的表面的氨基酸位置示出在图8中。可通过检查三维结构(在可用的情况下)或通过经由熟知方法分析fn3结构域的序列比对来鉴定形成其它fn3结构域中供选择的表面的残基。本发明的fn3结构域可作为单体、二聚体或多聚体产生，例如作为增加化合价和因此靶分子结合的亲和力的手段，或产生同时结合两种或多种不同的靶分子双特异性或多特异性支架的手段。二聚体和多聚体可通过连接单特异性、双特异性或多特异性蛋白质支架来产生，例如，通过纳入氨基酸接头，例如含有聚甘氨酸、甘氨酸和丝氨酸或丙氨酸和脯氨酸的接头。使用天然存在的以及人工肽接头将多肽连接成新型连接的融合多肽在文献中为熟知的(hallewell等人，jbiolchem264，5260-5268，1989；alfthan等人，proteineng.8，725-731，1995；robinson&sauer，biochemistry35，109-116，1996；美国专利5,856,456)。本发明的fn3结构域可用作双特异性分子，其中结构域中第一可供选择的表面对第一靶分子具有特异性，而相同结构域中的第二可供选择的表面对第二靶分子具有特异性。示例性的双特异性蛋白质结构域为tencon27的变体，其结合c-cd-f-fg表面处的第一靶分子和a-ab-b-bc-e表面处的第二靶分子。本发明的fn3结构域可例如通过共价相互作用并入其它亚基。可将抗体恒定区的全部或一部分可连接至fn3结构域以赋予抗体样特性，特别是与fc区域相关的那些特性，例如，补体活性，半衰期等。例如，fc效应子功能诸如c1q结合、补体依赖性细胞毒性(cdc)、fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)、吞噬作用，细胞表面受体(例如，b细胞受体；bcr)的下调等可通过修饰促成这些活性的fc中的残基来提供和/或控制(对于综述，参见strohl，curropinbiotechnol.20，685-691，2009)。另外的部分可并入本发明的fn3结构域，诸如用于期望特性的毒素缀合物；白蛋白或白蛋白结合物；聚乙二醇(peg)分子，诸如peg5000或peg20,000；不同链长度的脂肪酸和脂肪酸酯，例如，月桂酸酯、肉豆蔻酸酯，硬脂酸酯、花生酸酯、二十二烷酸酯、油酸酯、花生四烯酸、辛二酸、十四烷二酸、十八烷二酸、二十二烷二酸等、聚赖氨酸、辛烷、糖类(葡聚糖、纤维素、寡糖或多糖)。这些部分可与蛋白质支架编码序列直接融合并且可通过标准的克隆和表达技术产生。作为另外一种选择，熟知的化学偶联方法可用于将这些部分连接至本发明重组制备的fn3结构域。可通过多种熟知的测定比较并入另外部分的fn3结构域的官能度。例如，由于并入fc结构域和/或fc结构域变体而导致的改变的fn3结构域特性可在fc受体结合测定中使用该受体的可溶形式来测定，该受体的可溶形式诸如fcγri、fcγrii、fcγriii或fcrn受体，或使用熟知的测量例如adcc或cdc的基于细胞的测定，或在体外模型中评估蛋白质支架药代动力学特性。fn3结构域蛋白质的产生和制备本发明的一个实施例为制备包含可供选择的表面的fn3结构域的文库的方法，其中与参考fn3结构域相比，所述可供选择的表面具有至少一种氨基酸取代，所述方法包括：提供编码参考fn3结构域的多核苷酸；通过使可供选择的表面随机化来产生参考fn3结构域的多核苷酸序列的文库；在体外翻译该文库或在宿主中表达该文库。本发明的另一个实施例为制备具有由cβ-链、cd环、fβ-链和fg环形成的多样化c-cd-f-fg可供选择的表面的fn3结构域的文库的方法，所述方法包括提供具有与seqidno:27的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列的参考fn3结构域多肽；通过使至少一个cβ-链残基和至少一个fβ-链残基突变来将多样性引入到所述参考fn3结构域多肽中以形成具有多样化c-cd-f-fg可供选择的表面的fn3结构域文库。在本发明制备文库的方法中，可使cβ-链中的1、2、3或4个残基突变，条件是s30未突变(残基编号根据seqidno:27)。在本发明制备文库的方法中，可使cβ-链残基l32、q34和q36突变(残基编号根据seqidno:27)。在本发明制备文库的方法中，可使fβ-链中的1、2、3或4个残基突变，条件是e66未突变(残基编号根据seqidno:27)。在本发明制备文库的方法中，可使f-β链残基t68、s70和y72突变(残基编号根据seqidno:27)。在本发明制备文库的方法中，可使cd环中的1、2、3或4个残基突变，条件是g42和e43未突变(残基编号根据seqidno:27)。在本发明制备文库的方法中，可使cd环中的残基s38、e39、k40和v41突变。在本发明制备文库的方法中，可使fg环中的1、2、3或4个残基突变，条件是残基k75、g76、g77和s80未突变(残基编号根据seqidno:27)。在本发明制备文库的方法中，可使fg环中的残基h78、r79和n81突变(残基编号根据seqidno:27)。在本发明制备文库的方法中，参考fn3结构域包含seqidno:27的氨基酸序列，其在氨基酸位置11、14、17、37、46、73或86处任选地包含至少一种取代。其它参考fn3结构域可用于本发明的方法，诸如tencon(seqidno:16)或seqidno:17-26和表3中示出的其变体。本发明的另一个实施例为由本发明的方法制备的文库。支架蛋白质，本发明的fn3结构域(或模块)的产生通常在核酸水平上实现。可例如使用标准pcr克隆方法，或根据美国专利6,521,427和美国专利6,670,127中描述的方法的化学基因合成来合成在一个或多个特异性残基处具有取代的密码子的本发明的fn3结构域的文库。可使用熟知的方法，例如匹配设计多样性的简并寡核苷酸或使用kunkel诱变使密码子随机化(kunkel等人，methodsenzymol.154，367-382，1987)。可使用随机或确定组的氨基酸在所选密码子处使文库随机化。例如，可使用nnk密码子(其编码所有20种天然存在的氨基酸)产生具有随机取代的文库中的变体。在其它多样化方案中，dvk密码子可用于编码氨基酸ala、trp、tyr、lys、thr、asn、lys、ser、arg、asp、glu、gly和cys。作为另外一种选择，nns密码子可用于产生所有20种氨基酸残基并同时降低终止密码子的频率。密码子命名根据熟知的iub密码。和任何其它蛋白质一样，本发明的fn3结构域倾向于多种物理和/或化学不稳定性，导致对下游加工的不利影响。例如，物理和化学不稳定性可导致聚集、降解、产物产量降低、效能的丧失、对免疫原性的可能性增加、分子异质性和活性的丧失。因此，在设计文库的过程中，可能的不稳定性诱导残基和识别序列的存在可被最小化。例如，在存储条件中，表面暴露的甲硫氨酸和色氨酸可被氧化，可能导致蛋白质支架效能的丧失。天冬酰胺的存在，除了促成熟知的n-糖基化识别位点(nxs/t)，当在甘氨酸前面时还可被去酰胺化，可能产生异质性(heterogeneicity)(robinson，procnatlacadsciusa，99，5283-5288，2002)。因此这些氨基酸中的一些或全部可从用于使所选位置随机化的混合物中删除或可以不删除。此外，可删除半胱氨酸和脯氨酸以最小化二硫桥形成和β折叠的破坏。可例如使用technology(http:_//www_sloning_com)来合成在待多样化的位置具有偏向氨基酸分布的fn3结构域。这种技术使用预先制备的双链三体的文库，其用作对于成千上万的基因合成工艺而言为足够的通用构建模块。该三体文库代表对构建任何期望的dna分子所必需的所有可能的序列组合。用某些位置处所选的核苷酸“简并性”合成寡核苷酸是本领域熟知的，例如trim方法(knappek等人，jmolbiol296，57-86，1999；garrard&henner，gene128，103-109，1993)。可使用可商购获得的核苷酸或核苷试剂和设备来合成具有某些密码子组的核苷酸的此类组。在示例性的多样化方案中，用nns密码子使cβ-链中的tencon27fn3结构域(seqidno:27)残基l32、q34和q36，cd环中的s38、e39、k40和v41，fβ-链中的t68、s70和y72以及fg环中的h78、r79和n81随机化。标准的克隆和表达技术用于将文库克隆进载体或合成文库的双链cdna盒以在体外表达或翻译文库。例如，顺式展示可用于将编码支架蛋白质的dna片段连接至编码repa的dna片段以产生在体外翻译后形成的蛋白质-dna复合物的集合，其中每种蛋白质与编码其的dna稳定地缔合(美国专利7,842,476；odegrip等人，procnatlacadsciusa101，2806-2810，2004)。可使用其它方法，例如核糖体展示(hanes和pluckthun，procnatlacadsciusa，94，4937-4942，1997)、mrna展示(roberts和szostak，procnatlacadsciusa，94，12297-12302，1997)或其它无细胞系统(美国专利5,643,768)。蛋白质支架的文库可表达为展示在例如任何合适的噬菌体的表面上的融合蛋白。用于在噬菌体的表面上展示融合多肽的方法是熟知的(美国专利公布2011/0118144；国际专利公布wo2009/085462；美国专利6,969,108；美国专利6,172,197；美国专利5,223,409；美国专利6,582,915；美国专利6,472,147)。筛选筛选工程改造的蛋白质fn3结构域或fn3结构域变体的文库与靶分子的特异性结合可例如通过使用如实施例和odegrip等人，procnatlacadsciusa101，2806-2810，2004所述的顺式展示产生文库和通过本领域已知的任何方法测定文库与靶分子的特异性结合来实现。可使用的示例性熟知的方法为elisa、夹心免疫测定和竞争性和非竞争性测定(参见例如，ausubel等人，eds，1994，currentprotocolsinmolecularbiology，vol.1，johnwiley&sons，inc.，newyork)。本发明的fn3结构域可以宽泛的亲和力(kd)范围结合人或其它哺乳动物蛋白质。如通过表面等离子共振或kinexa方法所测定，如本领域技术人员所实践，通常本发明的fn3结构域可以kd等于或小于约10-7m、10-8m、10-9m、10-10m、10-11m、10-12m、10-13m、10-14m或10-15m结合靶蛋白。可使用任何合适的方法通过实验测定fn3结构域对抗原的亲和力。(参见例如，berzofsky等人，“antibody-antigeninteractions，”fundamentalimmunology，paul，w.e.编辑，ravenpress:newyork，ny(1984)；kuby，janisimmunology，w.h.freemanandcompany:newyork，ny(1992)；以及本文所述的方法)。如果在不同的条件(例如，同渗容摩、ph)下测量，特定fn3结构域-抗原相互作用的测量亲和力可变化。因此，亲和力和其它抗原-结合参数(例如，kd、kon、koff)的测量优选地用蛋白质支架和抗原的标准溶液，以及标准缓冲液，诸如本文所述的缓冲液进行。核酸分子和载体本发明将编码本发明的fn3结构域的核酸提供为分离的多核苷酸或表达载体的部分或线性dna序列的部分，包括用于体外转录/翻译的线性dna序列、与原核、真核或丝状噬菌体表达、组合物或其定向诱变剂的分泌和/或展示相容的载体。本文公开某些示例性的多核苷酸，然而，在给定的表达系统中给定遗传密码的简并性或密码子偏好，编码本发明的蛋白质支架和蛋白质支架的文库的多核苷酸也在本发明的范围内。本发明的多核苷酸可以通过化学合成(诸如在自动化多核苷酸合成仪上的固相多核苷酸合成)来生产，并装配成完整的单链或双链分子。作为另外一种选择，本发明的多核苷酸可以通过其它技术来生产，诸如pcr之后进行常规克隆。制备或获得具有给定的已知序列的多核苷酸的技术是本领域熟知的。本发明的多核苷酸可包含至少一个非编码序列，诸如启动子或增强子序列、内含子、聚腺苷酸化信号、促进repa结合的顺式序列等。多核苷酸序列还可包含编码另外的氨基酸的另外序列，其编码例如标记或标签序列，诸如组氨酸标签或ha标签以促进蛋白质的纯化或检测；信号序列；融合蛋白配偶体诸如repa、fc；或噬菌体外壳蛋白诸如pix或piii。示例性的多核苷酸包含用于tac启动子的序列、编码fn3结构域文库和repa的序列、顺式元件以及细菌复制起点(ori)。另一个示例性的多核苷酸包含pelb或ompa信号序列、piii或pix噬菌体外壳蛋白、fn3结构域和聚腺苷酸位点。编码tcl14文库和tencon27的示例性多核苷酸分别在seqidno:100和101中示出。本发明的另一实施例是包含至少一个本发明多核苷酸的载体。此类载体可以是质粒载体、病毒载体、用于杆状病毒表达的载体、基于转座子的载体或适于通过任何方式将本发明的多核苷酸引入给定生物体或遗传背景的任何其它载体。此类载体可以是包含可控制、调节、引起或允许由这种载体编码的多肽的表达的核酸序列元件的表达载体。此类元件可包含转录增强子结合位点、rna聚合酶起始位点、核糖体结合位点以及有利于被编码多肽在给定表达系统中的表达的其它位点。此类表达系统可以是本领域熟知的基于细胞的系统或无细胞系统。宿主细胞选择或宿主细胞工程改造如本领域所熟知，本发明的fn3结构域可任选地由细胞系、混合细胞系、无限增殖化细胞或无限增殖化细胞的克隆群产生。参见例如，ausubel等人编辑，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，inc.，ny，ny(1987-2001)；sambrook等人，molecularcloning:alaboratorymanual，第2版，coldspringharbor，ny(1989)；harlow和lane，antibodies，alaboratorymanual，coldspringharbor，ny(1989)；colligan等人编辑，currentprotocolsinimmunology，johnwiley&sons，inc.，ny(1994-2001)；colligan等人，currentprotocolsinproteinscience，johnwiley&sons，ny，ny，(1997-2001)。选择用于表达的宿主细胞可以是哺乳动物起源的或可选自cos-1、cos-7、hek293、bhk21、cho、bsc-1、hepg2、653、sp2/0、293、hela、骨髓瘤、淋巴瘤、酵母、昆虫或植物细胞、或其任何衍生物、无限增殖化细胞或转化的细胞。作为另外一种选择，宿主细胞可选自不能够使多肽糖基化的物种或生物体，例如原核细胞或生物体，诸如bl21、bl21(de3)、bl21-gold(de3)、xl1-blue、jm109、hms174、hms174(de3)以及任何天然或工程改造的大肠杆菌属(e.colispp)、克雷伯氏菌属(klebsiellaspp.)或假单胞菌属(pseudomonasspp)菌株。本发明fn3结构域的用途本文描述并且通过任何以上描述的方法产生的基于fn3结构域(模块)的分子的组合物可用于诊断、监测、调节、治疗、缓解、帮助预防人类疾病或细胞、组织、器官、液体或(一般来讲)宿主中的特定病理学的发生，或减少人类疾病或细胞、组织、器官、体液或(一般来讲)宿主中的特定病理学的症状。被工程改造以用于特定目的的fn3结构域可用于治疗免疫介导的或免疫缺陷疾病、代谢疾病、心血管病症或疾病；恶性疾病；神经病症或疾病；感染，诸如细菌、病毒或寄生虫感染；或其它已知或指定相关病状，包括肿胀、疼痛和组织坏死或纤维变性。这样的方法可包括向需要此种调节、治疗、缓解、预防或症状减少、效果或机制的细胞、组织、器官、动物或患者施用有效量的组合物或药物组合物，该组合物或药物组合物包含至少一种特异性地结合靶分子的fn3结构域。如本文描述或相关领域已知的，如使用已知方法进行和确定，该有效量可包括每单次(例如，推注)、多次或连续施用约0.001至500mg/kg的量，或每单次、多次或连续施用达到血清浓度为0.01-5000μg/ml血清浓度，或其中的任何有效范围或值。包含基于fn3结构域的蛋白质的药物组合物可使用本领域熟知的用于捕获、固定、分配或沉定的分离程序分离为经修饰的或未经修饰的、单体、二聚体或多聚单特异性、双特异性或多特异性的特异性地结合靶分子的fn3结构域，或将其纯化至商业适用所必需的程度。对于治疗用途，可将特异性地结合靶分子的fn3结构域制备为药物组合物，该药物组合物含有有效量的fn3结构域作为药学上可接受的载体中的活性成分。术语“载体”是指据以施用该活性化合物的稀释剂、辅助剂、赋形剂或媒介物。此类媒介物可以是液体，例如水和油，包括那些来源于石油、动物、植物的油或合成的油，诸如花生油、大豆油、矿物油和芝麻油等。例如，可以使用0.4％生理盐溶液和0.3％甘氨酸。这些溶液是无菌的，通常不含颗粒物质。它们可通过常规的熟知的灭菌技术(例如过滤)进行灭菌。组合物可按需含有药学上可接受的辅助物质以近似生理条件，如ph调节剂和缓冲剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂等。本发明的物质在这种药物组合物中的浓度可变动很大，即从小于约0.5％、通常为或至少约1％至高达15或20％(以重量计)，且将根据所选择的具体施用方式主要基于所需的剂量、流体体积、粘度等进行选择。包含其它人蛋白如人血清白蛋白在内的合适的媒介物和制剂描述在例如，remington:thescience和practiceofpharmacy，第21版，troy，d.b.编辑，lipincottwilliamsandwilkins，philadelphia，pa，2006，第5部分，pharmaceuticalmanufacturing，第691-1092页，特别参见第958-989页。用于特异性地结合靶分子的fn3结构域的治疗用途的施用方式可以是将药剂递送至宿主的任何合适的途径，诸如非肠道施用，例如，真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内或皮下、肺部；经粘膜(口腔、鼻内、阴道内、直肠)；使用在片剂、胶囊、溶液、粉末、凝胶、颗粒中的制剂；以及包含在注射器、植入装置、渗透泵、盒、微型泵中的制剂；或技术人员理解、本领域熟知的其它方式。可通过例如以下方式实现位点特异性施用：关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈内、胃内、肝内、心脏内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、血管内、膀胱内、病灶内、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内或经皮递送。虽然已用一般的术语描述了本发明，但是本发明的实施例还将在下列实例中公开，所述实例不应理解为对本权利要求的范围的限制。实例1：tencon支架tencon设计来自人腱生蛋白c的第三iii型纤连蛋白模块(fn3)结构域(seqidno:3)可用作可被工程改造以结合特异性靶分子的蛋白质支架。在其天然形式下这种结构域在pbs中的解链温度为54℃。为了制备具有类似结构和改善的物理特性(诸如改善的热稳定性)的蛋白质支架，基于来自人腱生蛋白c的15个fn3结构域(示出在seqidno:1-15)的比对设计了共有序列。所述15个选择的fn3结构域彼此具有13至80％的序列同一性，其中对之间的平均序列同一性为29％。通过在每个位置并入最保守(频繁)的氨基酸来设计指定为tencon(seqidno:16)的共有序列(参见美国专利公布2010/0216708)。在双序列比对中，tencon与来自腱生蛋白c的fn3结构域在34-59％的位置相同，其中平均序列同一性为43％。tencon表达和纯化将tencon的氨基酸序列回译(backtranslate)，产生seqidno：59所示的cdna序列。使用常规方法将cdna扩增并克隆进修饰的pet15载体。蛋白质在大肠杆菌中表达为可溶形式的c-末端his6-融合蛋白，并且使用标准ni-nta琼脂糖并使用在500mm咪唑中洗脱来进行纯化。将期望的组分合并并透析至pbs(ph7.4)中。作为第二纯化步骤，将蛋白质上样至在pbs中平衡的superdex-75hiload16/60柱(gehealthcare)。将含有tencon的组分合并并使用centriprepultracelym-3浓缩器(amicon)进行浓缩。sds-page分析显示tencon在6和14kda之间迁移，这与单体蛋白10.7kda的期望质量一致。获得每升培养物>50mg纯tencon蛋白的产量。tencon生物物理学表征通过圆二向色性光谱学(cd)和差示扫描量热法(dsc)表征tencon的结构和稳定性。cd测量于20℃下在pbs中和0.2mg/ml的浓度下在aviv光度计上进行。光谱显示最小值在218nm，表明如对于属于fn3家族的蛋白质所预期的β-折叠结构。通过在n-dscii热量计(appliedthermodynamics)中于pbs中将来自腱生蛋白c的第3fn3结构域(tn3)或tencon的0.5mg/ml溶液以1℃/分钟的速率从35℃加热至95℃来获得dsc数据。使用cpcalc(应用热力学)软件，从该数据分别计算tn3和tencon的解链温度为54℃和78℃。在这些温度下，两种结构的折叠和解折叠是可逆的。因此，当与tn3的热稳定性相比时，所产生的tencon支架显示提高的热稳定性。基于这种稳定性增加，tencon支架可能更能接受氨基酸取代并且更易于制造。在更稳定的支架的情况下，降低蛋白质稳定性的突变可能更耐受，并且因此具有增强的稳定性的支架可能从支架变体的文库中产生更具功能性、良好折叠的结合物。m13噬菌体上的tencon展示通过标准的pcr和限制酶切消化克隆，将编码tencon氨基酸序列的cdna(seqidno:59)亚克隆进噬粒表达载体ppep9(国际专利公布wo2008/079973)，产生载体ptencon-pix。在lac启动子(在没有iptg的情况下允许较低水平的表达，而在添加iptg后允许增加的表达)下，使用ompa信号序列，该载体将n-末端myc-标记的tencon表达为与噬菌体m13pix蛋白的n-末端的c-末端融合物。将短tsggggs接头(seqidno:60)插入到tencon和pix之间以防止这些蛋白质之间的空间相互作用。对于确认在m13噬菌体颗粒的表面上的展示，使xl1-blue大肠杆菌中的ptencon-pix的单菌落转化株在37℃下生长直到到达中间对数生长期(mid-logphase)并且用610pfu的vcsm13辅助噬菌体拯救。在用氨苄青霉素补充的2yt培养基中伸展16小时后之后1mmiptgs诱导，从拯救的培养物中收集上清液，在4000xg离心20分钟并在4℃储存用于分析。噬菌体颗粒与抗myc抗体(lifetechnologies，carlsbad，ca)的结合用于确认myc-tencon构建体在m13噬菌体表面上的展示。用抗-myc或抗-αv抗体(阴性对照)在2.5μg/ml的浓度下对maxisorp板进行包被过夜并且用superblockt20(thermoscientific，rockfordil)进行封闭。1小时后，用tbst洗涤板，并且将抗m13hrp抗体添加至每个孔，在1小时孵育后用tbst洗涤。加入rochebdelisapod底物，并且在tecan酶标仪上检测发光。实例2：tencon中的稳定突变经设计以将多样性同时引入fg和bc环的tencon文库fg7和bc6/fg7已描述在(美国专利公布2010/0255056；美国专利公布2010/0216708中)。变体的设计设计变体以提高tencon(seqidno:16)的折叠稳定性。进行多处点突变以产生seqidno:16的单个残基的取代，诸如n46v(tencon17；seqidno:17)、e14p(tencon18；seqidno:18)、e11n(tencon19；seqidno:19)、e37p(tencon20；seqidno:20)和g73y(tencon21；seqidno:21)，预期它们通过程序popmusicv2.0提高支架稳定性(dehouck等人，bioinformatics，25，2537-2543，2009)。先前已发现突变体e86i(tencon22；seqidno:22)使同源蛋白，来自人腱生蛋白c的第3rdfn3结构域稳定(wo2009/086116)。发现l17a突变(tencon26；seqidno:26)在丙氨酸扫描实验过程中显著地使tencon稳定，其中tencon的所有环残基独立得被丙氨酸替代(数据未显示)。在初始轮的稳定性测定后，产生了组合突变体n46v/e86i(tencon23；seqidno:23)、e14p/n46v/e86i(tencon24；seqidno:24)和l17a/n46v/e86i(tencon25；seqidno:25)以进一步增加稳定性。表达和纯化使用quikchange诱变试剂盒(stratagene)进行tencon编码序列的突变，并且使用标准方案使突变蛋白质表达为his6融合蛋白。在50mm磷酸钠(ph7.4)、500mmnacl和250mm咪唑中从ni-nta(novagen)柱洗脱蛋白质。洗脱后，将蛋白质透析至pbs(ph7.4)。热稳定性的表征通过毛细管差示扫描量热法(dsc)测量tencon和每种突变蛋白在pbs(ph7.4)(2-3mg/ml)中的热稳定性。使用装备有自动取样机的vp-dsc仪器(microcal，llc)测量这些样本的解链温度。以每分钟1℃的速率将样本从10℃加热至95℃或100℃。在每种样本扫描之间完成仅缓冲液扫描以计算对于整合的基线。在减去仅缓冲液信号后，将数据拟合为两状态解折叠模型。通过重复对每种样本的扫描而不从细胞移除来确定热变性的可逆性。通过比较第1次扫描与第2次扫描的曲线下面积来计算可逆性。在表3中将dsc实验的结果呈现为来自完整熔解曲线的值(tm(kcal))。与亲本tencon序列相比，单个突变体tencon17、tencon18、tencon19和tencon22具有提高的热稳定性。仅tencon21显著不稳定。组合突变体tencon23、tencon24和tencon25以及所有的稳定性具有显著更大的增强，表明设计的突变就提高热稳定性而言是相加的。由盐酸胍引起的变性如通过色氨酸荧光所测量，在用增加浓度的盐酸胍(gdmcl)处理后tencon和每种突变体保持折叠的能力用于评估稳定性。tencon仅含有一个色氨酸残基。色氨酸残基内埋在疏水核心并且因此在360nm的荧光发射是这种蛋白质的折叠状态的敏感度量。将含有50mm磷酸钠(ph7.0)、150mmnacl和各种浓度为0.48至6.63m的gdmc200μl溶液移取到黑色、非结合96-孔板(greiner)以便产生17点滴定。将含有tencon突变体的10μl溶液加入到整个板上的每个孔以使得最终蛋白质浓度为23μm并且通过轻轻上下吸取来混合。在室温下孵育24小时后，使用在280nm激发和在360nm发射的spectramaxm5酶标仪(moleculardevices，sunnyvale，ca)读取荧光。使用以下方程将荧光信号转变为解折叠分数(pace，methodsenzymol131:,266-280，1986):fu＝(yf-y)/(yf-yu)其中yf是折叠样本的荧光信号，并且yu是解折叠样本的荧光信号。通过拟合为以下方程确定解折叠过渡段的中点和过渡段的斜率(clarke等，1997)：其中f是给定变性剂浓度下的荧光，并且αn和αd是天然和变性状态的y-截距，并且βn和βd是对于天然和变性状态的基线的斜率，[d]是gdmcl的浓度，[d]50％是50％样本变性所在点的gdmcl浓度，m是过渡段的斜率，r是气体常数，并且t是温度。使用以下方程估计对于每种样本的折叠自由能(pace1986同上；clarke等人，jmolbiol270，771-778，1997)：δg＝m[d]50％通常难于准确地计算此类曲线的过渡段的斜率m。另外，这里描述的突变不预期改变tencon的折叠机制。因此，计算对于每种突变体的m值，并且取平均值(pace1986同上)以产生m＝3544cal/mol/m用于所有自由能计算。将这些计算的结果呈现在表3中。gdmcl解折叠实验的结果证明就热稳定性而言使tencon稳定的相同突变体也使针对gdmcl诱导的变性的蛋白质稳定。表3：尺寸排阻色谱法尺寸排阻色谱法(sec)用于评估tencon和每种tencon变体的聚集状态。将5μl的每种样本以0.3ml/min的流速与pbs流动相注入到superdex755/150柱(ge医疗集团(gehealthcare))。通过280nm处的吸光度监测来自柱的洗脱液。为了评估聚集状态，在前用球状分子量标准物(sigma)校准柱。所有测试的样本，除了tencon21外，在与单聚体样本一致的洗脱体积时洗脱出一个峰。tencon21洗脱出2个峰，表明聚集物的存在。实例3：具有可供选择的结合表面的tencon文库的产生tcl14文库的设计在特定的文库设计中选择待随机化的残基管理所创建的相互作用表面的总体形状。自其中bc、de和fg环被随机化的文库中选择以结合麦芽糖结合蛋白(mbp)的含有fn3结构域的支架蛋白质的x-射线晶体学分析显示具有主要弯曲界面，其适合mbp的活性位点。(koide等人，procnatlacadsciusa，104，6632-6637，2007)。相比之下，发现选择以与mbp结合的锚蛋白重复支架蛋白质具有非常平坦的相互作用表面并且结合mbp远离活性位点的外表面。(binz等人，natbiotechnol，22，575-58，2004)。这些结果表明支架分子的结合表面的形状(弯曲比对平坦)可决定什么靶蛋白或这些靶蛋白上的特异性表位能够被支架有效地结合。已公布的围绕工程改造含有fn3结构域的蛋白质支架以用于蛋白质结合的努力依赖于工程改造用于靶标结合的相邻的环(图1)，因此产生弯曲的结合表面。这种方法可能限制靶标和此类支架可及的表位的数量。tencon和其它fn3结构域含有位于分子相对面的两组cdr-样环，第一组由bc、de和fg环形成，而第二组由ab、cd和ef环形成。两组环由形成fn3结构的β-链分隔(图1、2a)。如果在图1中呈示的tencon结构的图像被旋转90度，则可供选择的表面可视(图2b)。该稍微凹型的表面由cd和fg环以及两条反平行的β-链(c和fβ-链)形成，并在本文被称为c-cd-f-fg表面(图2b)。通过使形成该表面的残基的子组随机化，该c-cd-f-fg表面可用作模板来设计蛋白质支架相互作用表面的文库。β-链具有重复结构，其中每隔一个残基的侧链暴露于蛋白质的表面。因此，可通过使β链中的一些或所有表面暴露残基随机化来制备文库。通过选择β-链中的合适残基，tencon支架的固有稳定性应被最低限度地损坏而同时提供用于与其它蛋白质相互作用的唯一支架表面。新文库，在本文称为tcl14(seqidno:28)被设计为tencon25支架(seqidno:25)，其具有另外的e11r取代(tencon27，seqidno:27)(图2b、3)。对于tencon27(seqidno:27)和tcl14(seqidno:28)环和链的位置以及它们的序列分别示出在表4和表5中。在表5中，“x”指示任何氨基酸。tencon27(seqidno:27)：lpapknlvvsrvtedsarlswtapdaafdsfliqyqesekvgeaivltvpgsersydltglkpgteytvsiygvkgghrsnplsaiftttcl14文库(seqidno:28)：lpapknlvvsrvtedsarlswtapdaafdsfxixyxexxxxgeaivltvpgsersydltglkpgteyxvxixgvkggxxsxplsaiftt；其中“x”为任何氨基酸。形成tencon27中的c-cd-f-fg表面的两条β链具有总共9个可被随机化的表面暴露残基；c-链：s30、l32、q34、q36；f-链：e66、t68、s70、y72和v74，而cd环具有6个潜在残基：s38、e39、k40、v41、g42和e43，而fg环具有7个潜在残基：k75、g76、g77、h78、r79、s80和n81(图5)。如果所有22个残基都被随机化，那么由于文库的较大理论尺寸，选择挑选的残基以纳入tcl14设计中。选择tencon27(seqidno:27)中的13个位置用于随机化：c-链中的l32、q34和q36；cd-环中的s38、e39、k40和v41；f-链中的t68、s70和y72；fg-环中的h78、r79和n81。在c和f链中，s30和e66未被随机化，因为它们刚好位于cd和fg环外并且似乎并非为c-cd-f-fg表面的部分。对于cd环，g42和e43未被随机化，因为甘氨酸(提供灵活性)在环中可以是有价值的，并且e43位于表面的接合点。fg环具有k75、g76、g77，并且不包括s80。因为上述原因而不包括甘氨酸，而晶体结构的仔细检查揭示与核心主要接触的s80有助于形成稳定的fg环。k75转向远离c-cd-f-fg表面的表面并且对于随机化不是极好的候选者。虽然以上提及的残基在原始tcl14设计中未被随机化，但它们可被纳入随后的文库设计中以为重新选择或例如为挑选的tcl14靶标特异性命中上的亲和力突变文库提供另外的多样性。表4：与现有的基于fn3-支架的文库设计(koide，etal.jmolbiol，284，1141-1151，1998；koide等人，procnatlacadsciusa104，6632-6637，2007；dineen等人，bmccancer，8，352-361，2008；olson和roberts，proteinsci，16，476-484，2007；xu等人，chemistry&biology，9，933-942，2002；karatan等人，chembiol，11，835-844，2004；hackel等人，jmolbiol，401，84-96，2010；hackel等人，jmolbiol381，1238-1252，2008；koide等人，procnatlacadsciusa，104，6632-6637，2007；lipovsek等人，jmolbiol，368，1024-1041，2007；国际专利公布wo2009/133208；国际专利公布wo2009/058379；美国专利7,115,396)相反，所设计的tcl14文库表面与抗体可变结构域或cdr或先前描述的fn3文库的结构在结构上没有相似性。由于由该设计产生的大相互作用表面，可能不需要亲和力成熟步骤就可以快速分离高亲和力分子。因为该设计并不表5：使连续氨基酸的长伸展随机化，所以其可产生比先前描述的文库更可溶且更稳定的fn3结合分子。与先前文库相比，所描述的tcl14文库产生平坦或凹型的相互作用表面。因此，选自tcl14的fn3分子可能结合与从先前fn3文库设计发现的那些不同的抗原和表位。tcl14文库设计也可允许产生相同分子上的两个不同的结合表面以实现双特异性。tcl14文库的产生使用顺式展示系统表达以上所述的tcl14文库(odegrip等，procnatlacadsciusa101:2806-2810，2004)。在该系统中，将文库连接至编码repa编码序列的dna片段、cis和ori元件和tac启动子，并且所得的连接产物在体外转录/翻译。将所产生的tcl14-repa融合蛋白在cis中结合至借其编码融合蛋白的dna筛选文库的特异性地结合受关注蛋白质的支架分子，分离该分子并扩增结合的dna以鉴定结合的支架分子的编码序列。用简并引物和克隆的5'至repa基因，使用聚合酶链式反应(pcr)通过使tencon27(seqidno:27)中的位置l32、q34、q36(c-链)；s38、e39、k40、v41(cd-环)；t68、s70、y72(f-链)；h78、r79和n81(fg-环)随机化来产生tcl14文库以用于使用标准方案的顺式展示。使用引物c-cdn46v(seqidno.51)使c链和c:d环随机化，并且使用引物f-fg-sfe86i-r(seqidno.52)使f链和f:g环随机化。用引物r1recfor(seqidno:53)和digligrev(seqidno:54)扩增最终的连接物以产生用于体外转录/翻译的tcl14文库。表6示出所利用的引物的序列。密码子nns用于多样化(iub密码；n指示a、c、g或t；s指示c或g)。表6：tcl14文库的表征使用tcon6(seqidno:55)和tcon5e86i短(seqidno:56)引物将产生的tcl14文库pcr克隆进含有不依赖连接酶的克隆位点(pet154-lic)的修饰的pet15载体(emdbiosciences)。并且在使用标准方案进行转化和iptg诱导(1mm最终浓度，30℃持续16小时)后，蛋白质表达为c末端his6-标记的蛋白质。通过离心收获细胞并随后用补充有0.2mg/ml鸡蛋清溶解酵素(sigma-aldrich，st.louis，mo)的bugbusterht(emdchemicals，gibbstown，nj)溶解。通过离心使细菌溶解物澄清并将上清液转移至新的96深孔板。使用96孔ni-ntamultitrap板(gelifesciences，piscataway，nj)对蛋白质进行纯化。挑选克隆的随机选择和序列以评估文库中所得的分布。根据所期望的，文库中所观察到的多样性良好(图7)。为了计算全长文库克隆中观察到的多样性，在所有克隆中计数给定氨基酸在多样化文库区域中出现的次数并除以随机位置的总数(13个随机文库位置*69个全长克隆)并乘以100以产生频率％。预期的多样性基于具有以下氨基酸分布的nns简并密码子：phe＝1、leu＝3、ile＝1、met＝1、val＝2、ser＝3、pro＝2、thr＝2、ala＝2、cys＝1、arg＝3、gly＝2、tyr＝1、his＝1、gln＝1、asn＝1、lys＝1、asp＝1、glu＝1、trp＝1个密码子除以密码子的总数(32)乘以100以产生频率％。使纯化的蛋白质经历尺寸排阻色谱以确定单独文库成员的聚集倾向。使用agilent1200hplc通过将10μl纯化的蛋白质注入到superdex755/150柱来确定挑选的克隆的洗脱特征，其中吸光度读数在280nm。约80％的含有非半胱氨酸的克隆洗脱为单个单体峰，因此预示大多数单独的文库成员保持亲本分子的固有溶解性和结构。人们发现，在纯化后一些分子包含游离半胱氨酸的分子被氧化，因此洗脱为二聚合分子。使用差示扫描量热法(dsc)进一步表征具有如通过sec分析所确定的单分散特征。通过在vp-dsc毛细管细胞微热量计(microcal，llc，piscataway，nj)中以1℃/min的速率将每个克隆在pbs中的0.5mg/ml溶液从35℃加热至95℃来获得dsc数据。使用cpcalc(microcal，llc，piscataway，nj)软件计算每个克隆的解链温度，其中数据的汇总示于表7。所测试分子的平均解链温度为70±9℃。所获得的数据证明tcl14文库设计产生如下的支架分子，其保持显著量的亲本分子tencon25的热稳定性(93℃)并且其本身在本质上热稳定并且折叠良好。表7：特异性地结合受关注靶分子的tcl14文库分子的选择针对不同蛋白质类型的各种靶蛋白筛选tcl14文库以鉴定特异性地结合这些蛋白质和/或蛋白质结构域的支架分子，所述不同的蛋白质类型的靶蛋白由细胞表面受体细胞外结构域、细胞因子、激酶、磷酸酶、热休克蛋白和免疫球蛋白以及它们的片段。使用ez-linkno-weigh磺基-nhs-lc-生物素微量试管(thermofisher，rockford，il)使在hek293或大肠杆菌中表达的纯化可溶性蛋白质生物素酰化，然后深度透析至pbs。对于选择，使3μg的tcl14文库在大肠杆菌s30线性提取物(promega，madison，wi)中体外转录并翻译(ivtt)，并且表达的文库用cisblock(2％bsa(sigma-aldrich，st.louis，mo)、100μg/mlherringspermdna(promega，madison，wi)、1mg/ml肝素(sigma-aldrich，st.louis，mo)封闭。对于选择，每种生物素酰化的靶蛋白以浓度为400nm(第1轮)、200nm(第2和3轮)和100nm(第4和5轮)添加。结合的文库成员使用中和亲和素磁珠(thermofisher，rockford，il)(第1、3和5轮)或链霉抗生物素蛋白磁珠(promega，madison，wi)(第2和4轮)回收，并且未结合的文库成员通过用500μlpbst洗涤珠粒5-14次接着用500μlpbs洗涤2次来去除。5轮选择之后，dna输出通过pcr扩增，并且使用标准方案亚克隆至pet154-lic。进行另外的选择轮以便鉴定对于两种靶蛋白具有提高的亲和力的支架分子。简而言之，如上所述制备来自第5轮的输出并且使其经历另外重复轮的选择，除了以下变化：与生物素酰化靶蛋白的孵育从1小时减少至15分钟，并且珠粒捕获从20分钟减少至15分钟，生物素酰化的靶蛋白减少至25nm(第6和7轮)或2.5nm(第8和9轮)，并且在过量的非生物素酰化靶蛋白存在下进行另外1小时的洗涤。这些变化的目的是同时选择具有可能较快的结合速率和较慢的解离速率的结合物，产生大致较低的kd。如上所述，对第9轮输出进行pcr扩增、克隆和表达。结合受关注蛋白质和/或蛋白质结构域的支架分子的表征结合对来自第5轮淘选输出的188个单独克隆进行酶联免疫吸附测定(elisa)。maxisorp板(nunc，rochester，ny)用0.1μg抗-his抗体(qiagen，valencia，ca)包被过夜，用tris-缓冲盐水(ph7.4)和0.05％tween-20(tbst)洗涤，并且用startingblockt20(thermofisher，rockford，il)封闭。将含有1μg/mlhis6-标记的tcl14-repa融合物的澄清细菌溶解物或对照蛋白(人血清白蛋白)涂覆至包被板的孔上。将板孵育1小时，用tbst洗涤，并且使用moleculardevicesm5酶标仪用链霉抗生物素蛋白-hrp(jacksonimmunoresearch，westgrove，pa)和pod化学发光底物(roche，indianapolis，in)检测生物素酰化的蛋白。通过命中率来评估文库的性能。命中率定义为具有高于对照信号10倍发光信号的支架分子除以所筛选克隆的总数(188)的百分比(％)。如表8所示，tlc14文库产生对于8种不同的蛋白质命中率在8％至45％之间的支架分子。细胞因子2为小鼠il-17a。表8：靶标命中率(％)ser/thr激酶37受体ecd45免疫球蛋白22热休克蛋白18细胞因子6免疫球蛋白242细胞因子218磷酸酶8小鼠il-17a结合物的表征il-17a受体抑制进行抑制测定以确定针对小鼠il-17a(mil-17a)的第5和9轮淘选输出是否抑制mil-17a与mil-17a受体的结合。maxisorp板用0.2μg/mlmil-17a受体fc融合物(r&dsystems，minneapolis，mn)包被过夜，用磷酸盐缓冲盐水(pbs)(ph7.4)和0.05％tween-20(tbst)洗涤并且用pbs中的2％bsa、5％蔗糖封闭。将10ng/ml生物素酰化-mil17a(b-mil-17a)添加至在pbs中的1％bsa中按1:50稀释的澄清细菌溶解物中，并且将混合物孵育20分钟。将封闭的板洗涤，并且将细菌溶解物/b-mil-17a孵育物转移至板上。将板再孵育1小时，用pbst洗涤，并且生物素酰化蛋白用链霉抗生物素蛋白-hrp(jacksonimmunoresearch，westgrove，pa)和opd比色底物(sigma-aldrich，st.louis，mo)检测。使用m5酶标仪(moleculardevices，sunnyvale，ca)在490nm处读取吸光度，并且将数据转化为抑制％。将mil-17a:mil-17受体结合的抑制百分比定义为100-(样本/阴性对照×100)。使用上述方案在剂量响应抑制测定中对含有抑制mil-17a:mil-17受体相互作用的支架分子的挑选细菌溶解物进一步表征，除了以下不同：在测定中使用100μl的纯化的tcl14-his(ni-nta)融合蛋白，浓度为10μm至56pm。使用s形剂量响应拟合，从剂量响应曲线计算ic50值。如表9所述总结，mil-17a特异性抑制剂的ic50范围为约9至约428pm。表9：克隆idic50(pm)kon(1/ms)koff(1/s)kd(m)tp1kr9p61-a233.931370003.93e-052.87e-10tp1kr9p61-a755.75820003.46e-054.21e-10tp1kr9p61-e242.821470003.96e-052.70e-10tp1kr9p61-g48.831620005.02e-053.09e-10tp1kr9p62-a2261.14080002.17e-055.31e-11tp1kr9p62-c3117.12810001.05e-053.74e-11tp1kr9p62-c6109.15680001.20e-052.12e-11tp1kr9p62-d391.181100006.07e-055.54e-10tp1kr9p62-d42421050001.00e-059.52e-11tp1kr9p62-d8427.53810001.48e-053.89e-11tp1kr9p62-e364.161130005.26e-054.64e-10tp1kr9p62-h10301.84380002.11e-054.82e-10亲和力测量使用proteonxpr-36仪器(bio-rad)利用表面等离振子共振来测量结合mil-17a的挑选分子的亲和力。以不同的密度(100～300rus)在ph5.0和流速为30μl/min下经由胺偶联将纯化的分子直接固定在芯片上持续5分钟。测试以3倍浓度系列稀释的100nm时的mil-17a与芯片表面上不同分子的结合。取决于其解离速率，在流速为100μl/min下监测所有样本的所有浓度的解离相1-2小时。注入缓冲液样本以监测基线稳定性，并且不使表面再生以用于进一步使用。将对于选自tlc14文库的支架分子的不同表面中的每一个的所有浓度系列的应答数据在总体拟合为1:1样本langmuir结合模型以提取动力学(kon，koff)和亲和力(kd)常数的估计值。如表9所总结，特异性地结合mil-17a的支架分子的亲和力在亚毫微摩尔范围。挑选的mil-17a结合物的序列示出在seqidno:85-96，并且c和fβ-链以及cd和fg环的序列示出在表10。表10：实例4：在第二可供选择的表面随机化的tencon27文库如在图2c中可视的，在c-cd-f-fg表面的相对侧上的tencon27残基的第二可供选择的表面，在本文称为a-ab-b-bc-e表面，由aβ-链、ab环、bβ-链、bc环和eβ-链形成。a-ab-b-bc-e表面也呈稍微凹型，并且可用作模板以通过使形成该表面的残基的子组随机化来设计蛋白质支架相互作用表面的文库。β-链具有重复结构，其中每隔一个残基的侧链暴露于蛋白质的表面。因此，可通过使β-链中的一些或所有表面暴露残基随机化来制备文库。通过选择β-链中的合适残基，tencon27支架的固有稳定性应被最小损坏而同时提供用于与其它蛋白质相互作用的唯一支架表面。当与tcl14文库设计相比，使a-ab-b-bc-e表面随机化将在tencon27结构的相对侧产生结合表面。对具有随机化a-ab-b-bc-e表面的tencon27的文库设计示于seqidno:61(tcl15文库)和图6。tcl15文库(seqidno:61)：lpapkxlxvxxvxxxxaxlxwxapdaafdsfliqyqesekvgeaivltvpgserxyxltglkpgteytvsiygvkgghrsnplsaiftt；其中x为任何氨基酸。如以上对于tcl14文库所述，产生tcl15文库并选择特异性地结合靶分子的支架。实例5：其它fn3结构域：通过使可供选择的表面随机化产生文库由于fn3结构域之间的结构相似性，利用对于tencon27支架的实例中描述的可供选择的表面的文库设计可应用于各种蛋白质的其它fn3结构域。此类fn3结构域可能是天然存在的或合成的，并且例如是基于纤连蛋白结构域的共有序列的fibcon共有支架(seqidno:58)(美国专利公布2010/0255056)、人纤连蛋白的第10fn3结构域(fn10)(seqidno:97)、或来自人腱生蛋白的第3fn3结构域(tn3)(seqidno:3)，或表1列出的蛋白质中存在的任何fn3结构域。对于具有随机化的c-cd-f-fg可供选择的表面的fibcon,、fn10和tn3文库的文库设计分别示于图8和seqidno:62、98和99。使用其中描述的方案合成、表达设计的文库，并对其选择特异性结合物。具有随机化的c-cd-f-fg表面的基于fibcon的蛋白质支架文库(seqidno:62)：ldaptdlqvtnvtdtsitvswtppsatitgyxixyxpxxxxgepkeltvppsstsvtitgltpgveyxvxlxalkdnxxsxplvgtqtt；其中x为任何氨基酸。具有随机化的c-cd-f-fg表面的基于fn10的蛋白质支架文库(seqidno:98)：vsdvprdlevvaatptslliswdapavtvryyxixyxexxxxspvqeftvpgskstatisglkpgvdyxixvxavtgrgdspxxsxpisinyrt；其中x为任何氨基酸。具有随机化的c-cd-f-fg表面的基于tn3的蛋白质支架文库(seqidno:99)：dapsqievkdvtdttalitwfkplaeidgixlxyxixxxxgdrttidltedenqysignlkpdteyxvxlxsrrgdxxsxpaketftt；其中x为任何氨基酸。与如对于tencon27支架所描述的相似，组成其它fn3结构域的cd和/或fg环的一些或所有残基可被1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个随机化位置替代以产生不同长度的文库。将清楚的是本发明可不同于前述具体实施方式和实例中特别描述的其它方式实践。按照以上的教义，本发明的许多修改形式和变型是可能的，并且因此在所附权利要求的范围内。序列表<110>janssenbiotech,inc.<120>具有可供选择的结合表面的基于iii型纤连蛋白重复的蛋白质支架<130>cen5315wopct<140>待转让<141>2012-09-27<150>61/539670<151>2011-09-27<160>101<170>patentin版本3.5<210>1<211>87<212>prt<213>智人（homosapiens）<400>1serproprolysaspleuvalvalthrgluvalthrglugluthrval151015asnleualatrpaspasnglumetargvalthrglutyrleuvalval202530tyrthrprothrhisgluglyglyleuglumetglnpheargvalpro354045glyaspglnthrserthrileileglngluleugluproglyvalglu505560tyrpheileargvalphealaileleugluasnlyslysserilepro65707580valseralaargvalalathr85<210>2<211>95<212>prt<213>智人（homosapiens）<400>2thrtyrleuproalaprogluglyleulysphelysserilelysglu151015thrservalgluvalglutrpaspproleuaspilealaphegluthr202530trpgluileilepheargasnmetasnlysgluaspgluglygluile354045thrlysserleuargargprogluthrsertyrargglnthrglyleu505560alaproglyglnglutyrgluileserleuhisilevallysasnasn65707580thrargglyproglyleulysargvalthrthrthrargleuasp859095<210>3<211>88<212>prt<213>智人（homosapiens）<400>3aspalaproserglnilegluvallysaspvalthraspthrthrala151015leuilethrtrpphelysproleualagluileaspglyilegluleu202530thrtyrglyilelysaspvalproglyaspargthrthrileaspleu354045thrgluaspgluasnglntyrserileglyasnleulysproaspthr505560glutyrgluvalserleuileserargargglyaspmetserserasn65707580proalalysgluthrphethrthr85<210>4<211>100<212>prt<213>智人（homosapiens）<400>4thrglyleuaspalaproargasnleuargargvalserglnthrasp151015asnserilethrleuglutrpargasnglylysalaalaileaspser202530tyrargilelystyralaproileserglyglyasphisalagluval354045aspvalprolysserglnglnalathrthrlysthrthrleuthrgly505560leuargproglythrglutyrglyileglyvalseralavallysglu65707580asplysgluserasnproalathrileasnalaalathrgluleuasp859095thrprolysasp100<210>5<211>88<212>prt<213>智人（homosapiens）<400>5aspthrprolysaspleuglnvalsergluthralagluthrserleu151015thrleuleutrplysthrproleualalyspheaspargtyrargleu202530asntyrserleuprothrglyglntrpvalglyvalglnleuproarg354045asnthrthrsertyrvalleuargglyleugluproglyglnglutyr505560asnvalleuleuthralaglulysglyarghislysserlysproala65707580lysserlysproalaargvallys85<210>6<211>92<212>prt<213>智人（homosapiens）<400>6glnalaprogluleugluasnleuthrvalthrgluvalglytrpasp151015glyleuargleuasntrpthralaalaaspglnalatyrgluhisphe202530ileileglnvalglnglualaasnlysvalglualaalaargasnleu354045thrvalproglyserleuargalavalaspileproglyleulysala505560alathrprotyrthrvalseriletyrglyvalileglnglytyrarg65707580thrprovalleuseralaglualaserthrglyglu8590<210>7<211>91<212>prt<213>智人（homosapiens）<400>7gluthrproasnleuglygluvalvalvalalagluvalglytrpasp151015alaleulysleuasntrpthralaprogluglyalatyrglutyrphe202530pheileglnvalglnglualaaspthrvalglualaalaglnasnleu354045thrvalproglyglyleuargserthraspleuproglyleulysala505560alathrhistyrthrilethrileargglyvalthrglnasppheser65707580thrthrproleuservalgluvalleuthrglu8590<210>8<211>91<212>prt<213>智人（homosapiens）<400>8gluvalproaspmetglyasnleuthrvalthrgluvalsertrpasp151015alaleuargleuasntrpthrthrproaspglythrtyraspglnphe202530thrileglnvalglnglualaaspglnvalgluglualahisasnleu354045thrvalproglyserleuargsermetgluileproglyleuargala505560glythrprotyrthrvalthrleuhisglygluvalargglyhisser65707580thrargproleualavalgluvalvalthrglu8590<210>9<211>95<212>prt<213>智人（homosapiens）<400>9aspleuproglnleuglyaspleualavalsergluvalglytrpasp151015glyleuargleuasntrpthralaalaaspasnalatyrgluhisphe202530valileglnvalglngluvalasnlysvalglualaalaglnasnleu354045thrleuproglyserleuargalavalaspileproglyleugluala505560alathrprotyrargvalseriletyrglyvalileargglytyrarg65707580thrprovalleuseralaglualaserthralalysgluproglu859095<210>10<211>91<212>prt<213>智人（homosapiens）<400>10lysgluprogluileglyasnleuasnvalseraspilethrproglu151015serpheasnleusertrpmetalathraspglyilephegluthrphe202530thrilegluileileaspserasnargleuleugluthrvalglutyr354045asnileserglyalagluargthralahisileserglyleupropro505560serthrasppheilevaltyrleuserglyleualaproserilearg65707580thrlysthrileseralathralathrthrglu8590<210>11<211>91<212>prt<213>智人（homosapiens）<400>11alaleuproleuleugluasnleuthrileseraspileasnprotyr151015glyphethrvalsertrpmetalasergluasnalapheaspserphe202530leuvalthrvalvalaspserglylysleuleuaspproglngluphe354045thrleuserglythrglnarglysleugluleuargglyleuilethr505560glyileglytyrgluvalmetvalserglyphethrglnglyhisgln65707580thrlysproleuargalagluilevalthrglu8590<210>12<211>92<212>prt<213>智人（homosapiens）<400>12alagluprogluvalaspasnleuleuvalseraspalathrproasp151015glypheargleusertrpthralaaspgluglyvalpheaspasnphe202530valleulysileargaspthrlyslysglnsergluproleugluile354045thrleuleualaprogluargthrargaspleuthrglyleuargglu505560alathrglutyrgluilegluleutyrglyileserlysglyargarg65707580serglnthrvalseralailealathrthralamet8590<210>13<211>89<212>prt<213>智人（homosapiens）<400>13glyserprolysgluvalilepheseraspilethrgluasnserala151015thrvalsertrpargalaprothralaglnvalgluserpheargile202530thrtyrvalproilethrglyglythrprosermetvalthrvalasp354045glythrlysthrglnthrargleuvallysleuileproglyvalglu505560tyrleuvalserileilealametlysglypheglugluserglupro65707580valserglyserphethrthralaleu85<210>14<211>88<212>prt<213>智人（homosapiens）<400>14aspglyproserglyleuvalthralaasnilethraspsergluala151015leualaargtrpglnproalailealathrvalaspsertyrvalile202530sertyrthrglyglulysvalprogluilethrargthrvalsergly354045asnthrvalglutyralaleuthraspleugluproalathrglutyr505560thrleuargilephealaglulysglyproglnlysserserthrile65707580thralalysphethrthraspleu85<210>15<211>89<212>prt<213>智人（homosapiens）<400>15aspserproargaspleuthralathrgluvalglnsergluthrala151015leuleuthrtrpargproproargalaservalthrglytyrleuleu202530valtyrgluservalaspglythrvallysgluvalilevalglypro354045aspthrthrsertyrserleualaaspleuserproserthrhistyr505560thralalysileglnalaleuasnglyproleuargserasnmetile65707580glnthrilephethrthrileglyleu85<210>16<211>89<212>prt<213>人工序列<220><223>基于腱生蛋白cfn3域的共有fn3序列<400>16leuproalaprolysasnleuvalvalsergluvalthrgluaspser151015leuargleusertrpthralaproaspalaalapheaspserpheleu202530ileglntyrglngluserglulysvalglyglualaileasnleuthr354045valproglysergluargsertyraspleuthrglyleulysprogly505560thrglutyrthrvalseriletyrglyvallysglyglyhisargser65707580asnproleuseralagluphethrthr85<210>17<211>89<212>prt<213>人工序列<220><223>基于具有另外突变改善稳定性的腱生蛋白cfn3域的共有fn3序列<400>17leuproalaprolysasnleuvalvalsergluvalthrgluaspser151015leuargleusertrpthralaproaspalaalapheaspserpheleu202530ileglntyrglngluserglulysvalglyglualailevalleuthr354045valproglysergluargsertyraspleuthrglyleulysprogly505560thrglutyrthrvalseriletyrglyvallysglyglyhisargser65707580asnproleuseralagluphethrthr85<210>18<211>89<212>prt<213>人工序列<220><223>基于具有另外突变改善稳定性的腱生蛋白cfn3域的共有fn3序列<400>18leuproalaprolysasnleuvalvalsergluvalthrproaspser151015leuargleusertrpthralaproaspalaalapheaspserpheleu202530ileglntyrglngluserglulysvalglyglualaileasnleuthr354045valproglysergluargsertyraspleuthrglyleulysprogly505560thrglutyrthrvalseriletyrglyvallysglyglyhisargser65707580asnproleuseralagluphethrthr85<210>19<211>89<212>prt<213>人工序列<220><223>基于具有另外突变改善稳定性的腱生蛋白cfn3域的共有fn3序列<400>19leuproalaprolysasnleuvalvalserasnvalthrgluaspser151015leuargleusertrpthralaproaspalaalapheaspserpheleu202530ileglntyrglngluserglulysvalglyglualaileasnleuthr354045valproglysergluargsertyraspleuthrglyleulysprogly505560thrglutyrthrvalseriletyrglyvallysglyglyhisargser65707580asnproleuseralagluphethrthr85<210>20<211>89<212>prt<213>人工序列<220><223>基于具有另外突变改善稳定性的腱生蛋白cfn3域的共有fn3序列<400>20leuproalaprolysasnleuvalvalsergluvalthrgluaspser151015leuargleusertrpthralaproaspalaalapheaspserpheleu202530ileglntyrglnproserglulysvalglyglualaileasnleuthr354045valproglysergluargsertyraspleuthrglyleulysprogly505560thrglutyrthrvalseriletyrglyvallysglyglyhisargser65707580asnproleuseralagluphethrthr85<210>21<211>89<212>prt<213>人工序列<220><223>基于具有另外突变改善稳定性的腱生蛋白cfn3域的共有fn3序列<400>21leuproalaprolysasnleuvalvalsergluvalthrgluaspser151015leuargle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