一种表达透明质酸酶的免疫细胞及其应用的制作方法

本发明涉及肿瘤的细胞免疫治疗领域，尤其涉及一种表达透明质酸酶的免疫细胞及其应用，具体为过表达透明质酸酶的免疫细胞及其在抗肿瘤治疗中的应用。

背景技术：

肿瘤免疫细胞治疗是一种新型的肿瘤治疗方法，该疗法通过将机体细胞在体外进行扩增、细胞因子处理或基因修饰等处理对免疫细胞进行改造使免疫细胞获得抗肿瘤能力后回输到患者体内以清除肿瘤。

目前能够用于治疗肿瘤的免疫细胞有多种类型，包括(1)t淋巴细胞(tlymphocytes)，(2)嵌合抗原受体t细胞(chimericantigenreceptortcella，car-t)，(3)t细胞受体修饰的t细胞(tcellreceptor，tcr-t)，(4)自然杀伤细胞(naturalkillerscells，nk)，(5)树突细胞(dendriticcells，dc)，(6)nk-t细胞(naturalkillerstcells，nkt)，(7)肿瘤浸润的t细胞(tumorinfiltratinglymphocytes，til)，(8)遗传性修饰的nk细胞(geneticmodifiednk)。

细胞治疗技术已经在血液肿瘤的治疗上取得了显著的效果，但是，在恶性实体瘤的治疗中效果不明显。为了解决这一难题，现阶段主要有四种策略：

(一)与其他药物联用。应对t细胞耗竭较为成功的策略之一是与免疫检查点抑制剂联合使用，从而增强细胞治疗的效果。针对pd-1(atezolizumab)、pd-1(pembrolizumab,nivolumab)和ctla-4(ipilimumab)的药物能与car-t细胞联合治疗，在许多患者中取得了成功。

(二)优化分子设计。在car-t和tcr-t中，设计不同的t细胞受体使之能够识别更多的、不同恶性实体瘤特异性的抗原靶点或者通过改造t细胞识别模式使得t细胞的反应强度可控能且同时识别两个或者多个特异性的抗原靶点。

(三)增强t细胞的肿瘤浸润。在实体肿瘤中，即使确定了实体瘤的靶抗原，car-t细胞也必须克服多种障碍才能到达肿瘤部位。趋化因子受体失配可以阻止淋巴细胞的迁移，因此在t细胞中表达cxcl11、il-7、ccl19等促t细胞迁移的趋化因子或细胞因子，能使t细胞能更好地浸润肿瘤，提高其杀伤效果。

(四)改善肿瘤微环境。在免疫细胞中表达il-12、il-7等细胞因子，以进一步增强免疫抗肿瘤活性，或者表达过氧化氢酶(catalase)，从而避免富含活性氧的肿瘤微环境对免疫细胞的损伤。也可以通过阻断vegfr的功能来使肿瘤血管正常化，增强细胞治疗的效果。

恶性实体瘤的细胞治疗所面临的主要障碍之一是致密的肿瘤外基质阻碍了免疫细胞浸润。由于恶性实体瘤会形成致密的细胞外基质(如透明质酸、胶原蛋、硫酸肝素多糖等)将免疫细胞阻隔在肿瘤间质中而不能到达肿瘤实质，使得免疫细胞的抗肿瘤功能无法充分发挥。

cn102307993a公开了一种延长的可溶性ph20多肽及其用途；但是此方法不能特异性地降解靶向部位的透明质酸。cn102655853a公开了一种透明质酸酶和免疫球蛋白的稳定的复合制剂及其使用方法，配制用来皮下给药的稳定的组合物，其中：所述稳定的组合物是液体复合制剂；所述组合物的ph为4-5，包括端值；并且所述组合物包含：浓度至少为10％w/v的免疫球蛋白(ig)；可溶性透明质酸酶，其浓度至少为50u/ml且以100单位透明质酸酶/克(u/g)ig-3000u/gig的比例存在；以及浓度为0.05m-0.25m的碱金属盐酸盐，由此所述复合制剂在最高32℃的温度下稳定至少6个月。

cn102573789a公开了一种皮下抗her2抗体配制剂，诸如例如曲妥单抗(hercepintm)、帕妥珠单抗或t-dm1，或此类抗体分子的混合物的高度浓缩的稳定的药物配制剂。特别地，涉及在合适量的抗her2抗体外包含作为组合配制剂或以共配制形式使用的有效量的至少一种透明质酸酶的配制剂。所述配制剂另外包含至少一种缓冲剂，诸如例如组氨酸缓冲液、稳定剂或两种或更多种稳定剂的混合物(例如，糖类，诸如例如二水合α,α-海藻糖或蔗糖，和任选地作为第二稳定剂的甲硫氨酸)、非离子型表面活性剂和有效量的至少一种透明质酸酶。还提供了用于制备此类配制剂的方法及其用途。

上述这些方法中，透明质酸酶是药物的辅料成分，目的是增加特定药物的组织浸润水平，透明质酸酶只能在注射药物的这一短暂的过程中发挥效果，且其发挥效果的部位只有能被注射器触及的区域。

cn107400664a公开了一种透明质酸酶的细胞表达及其在实体瘤细胞治疗中的应用。用car-t细胞或者其他细胞表达游离型或者跨膜融合蛋白型透明质酸酶，在保持car-t细胞或者其他细胞抗肿瘤活性的同时，其细胞表达的透明质酸酶可以降解细胞外基质(extracellularmatrix，ecm)中的透明质酸，降低透明质酸的粘度，增强ecm组织通透性，有利于car-t细胞或者其他细胞进入实体瘤和在实体瘤中的浸润，从而增强car-t细胞或者其他细胞治疗实体瘤的疗效。但是其存在着游离型和膜结合型两种透明质酸酶，其中游离型透明质酸酶缺少稳定序列，因此半衰期较短，根据已有的文献可知，透明质酸酶ph20的半衰期为3分钟；而膜结合型透明质酸酶不仅缺少稳定序列，设计中的跨膜区、铰链区以及胞内段使得重组的透明质酸酶基因较大降低了基因的转导效率，采用此方法直接将透明质酸酶与t细胞连接，在实际应用中根本无法发挥浸润作用。

因此，如何能够开发出一种特异性更强、对组织浸润效果更好的可降解细胞外基质的方法对于肿瘤的治疗具有重要的意义。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种表达透明质酸酶的免疫细胞及其应用，通过表达透明质酸酶达到降解肿瘤细胞外基质的作用，提升细胞外基质的通透性，从而提升免疫细胞的浸润效果。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种表达透明质酸酶的免疫细胞，所述免疫细胞包括融合基因，所述融合基因主要包括信号肽、透明质酸催化活性区域和稳定序列串联构成；其中，所述信号肽为分泌型蛋白的信号肽。

本发明通过在免疫细胞中表达可以降解细胞外基质的酶，即透明质酸酶，提高了细胞外基质的通透性，从而促进免疫细胞对肿瘤实质的浸润，并增强免疫细胞对实体肿瘤的抗肿瘤活性。本发明中免疫细胞可以将透明质酸酶表达分泌为蛋白质，将透明质酸酶分泌到细胞外以降解细胞外基质，由于在自然状态下，透明质酸酶的半衰期较短，因此将含有透明质酸酶催化活性区域与信号肽序列、稳定序列进行融合，不仅可以促进对特定组织的浸润，还可以延长透明质酸酶在机体内的半衰期。

在免疫细胞中过表达透明质酸酶，随后回输到人体内，由于免疫细胞能够持续地分泌透明质酸酶，且回输到体内的免疫细胞能够触及注射器难以接触的部位，因此本发明中的透明质酸酶效果更为持久，且作用范围更加广泛，还可以特异性地降解靶向部位或组织的透明质酸，提高特定部位或组织的细胞外基质通透性，从而提高免疫细胞以及药物对靶向部位或组织的浸润。

本发明中的透明质酸酶的表达元件相比于现有技术设计更加精简，仅保留透明质酸酶催化的核心序列，并且将其与稳定序列融合，因此本发明中的透明质酸酶的表达元件序列长度更短，有利于提高透明质酸酶过表达载体的转导效率，同时能延长透明质酸酶的半衰期。

优选地，所述免疫细胞为t细胞、b细胞、nk细胞、巨噬细胞、树突状细胞或经过基因修饰的免疫细胞，所述基因修饰的方式为过表达嵌合抗原受体和/或过表达t细胞受体的免疫细胞。

本发明所述的细胞不仅限于上述所列举的细胞，能够用于治疗肿瘤的免疫细胞均可应用于本发明。

本发明通过将透明质酸酶的表达元件导入到jurkat细胞或t细胞中，所述t细胞为细胞毒性t细胞(cytotoxictcells,tc)，具有杀伤靶细胞的功能，经过基因修饰的car-t细胞可以识别并清除具有特定肿瘤抗原的肿瘤细胞，可预测到的相关结果是表达透明质酸酶的car-t细胞具有更好的肿瘤浸润能力并且能够降低肿瘤大小，延长荷瘤小鼠的生存时间。

本发明中，所述透明质酸酶的表达元件导入jurkat细胞后，jurkat细胞可以占到总细胞的90％以上，透明质酸酶分子的转到效率较高，并且显示出良好的降低透明质酸含量的作用；而且相比于野生型的jurkat细胞，过表达透明质酸酶活性区域的jurkat细胞在相同的时间内能够更快地通过被透明质酸包被的transwell基底膜，浸润能力更强。

本发明中，融合基因的可替换序列分别为信号肽序列和稳定序列，信号肽序列和稳定序列的替换不会对融合基因中的透明质酸酶的催化效果产生影响。

优选地，所述信号肽序列包括tpa信号肽、il-2信号肽、il-6信号肽、il-7信号肽、il-15信号肽、ifnγ、tgfβ1信号肽、tgfβ2信号肽、tgfβ3信号肽、gmcsf信号肽或透明质酸酶原始的信号肽序列中的任意一种或至少两种的组合，优选为tpa信号肽、il-2信号肽或tgfβ1信号肽序列中的任意一种或至少两种的组合，优选为tpa信号肽。

本发明中，所述信号肽序列均为分泌型蛋白的信号肽序列，只要能够实现挂膜或分泌的信号肽都可行，信号肽是引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短肽链，其长度一般为5-30个氨基酸。

本发明中，所述tpa信号肽的氨基酸序列如seqidno.1所示，具体如下：

seqidno.1所示的氨基酸序列：mdamkrglccvlllcgavfvsp.

优选地，所述透明质酸酶催化活性区域为ph-20/spam1。

在本发明中，透明质酸酶活性序列可以有很多种，只要是具有能够表达透明质酸酶的活性序列或者区域，均可以应用到本发明中，本发明优选ph-20/spam1透明质酸酶催化活性区域。

本发明中，所述ph-20/spam1透明质酸酶催化活性区域的氨基酸序列如seqidno.2所示，具体如下：

seqidno.2所示的氨基酸序列：nfrappvipnvpflwawnapsefclgkfdepldmslfsfigsprinatgqgvtifyvdrlgyypyidsitgvtvnggipqkislqdhldkakkditfympvdnlgmavidweewrptwarnwkpkdvyknrsielvqqqnvqlslteatekakqefekagkdflvetiklgkllrpnhlwgyylfpdcynhhykkpgyngscfnveikrnddlswlwnestalypsiylntqqspvaatlyvrnrvreairvskipdaksplpvfaytrivftdqvlkflsqdelvytfgetvalgasgiviwgtlsimrsmkscllldnymetilnpyiinvtlaakmcsqvlcqeqgvcirknwnssdylhlnpdnfaiqlekggkftvrgkptledleqfsekfycscystlsckekadvkdtdavdvciadgvcidaflkppmeteepqifynaspstlsatmfi.

优选地，所述稳定序列包括人igg1fc区序列、人igg2fc区序列、人igg3fc区序列或人igg4fc区序列中的任意一种或至少两种的组合，优选为人igg2fc区稳定序列。

在本发明中，稳定序列是利用回输到人体内的t细胞等免疫细胞进行表达的，与现有技术相比本发明中的稳定序列是在健康的原代细胞中表达的而不是在工程细胞系(如cho、bhk-21、hek293等)中表达，因此本发明中的稳定序列均为免疫球蛋白fc片段的序列，不仅能延长透明质酸酶的半衰期还能使其蛋白修饰更接近于健康人所产生的天然蛋白，降低了该稳定序列的免疫原性。

本发明中，所述人igg2fc区序列的氨基酸序列如seqidno.3所示，具体如下：

seqidno.3所示的氨基酸序列：appvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdisvewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhea.

作为优选技术方案，本发明所述免疫细胞包括融合基因，所述融合基因的氨基酸序列如seqidno.4-47所示，优选为融合基因的氨基酸序列包括tpa信号肽、ph-20/spam1透明质酸酶催化活性区域和人igg2fc区稳定序列，所述融合基因的氨基酸序列如seqidno.4所示，具体如下：

seqidno.4所示的氨基酸序列：

第二方面，本发明提供一种组合物，所述组合物包括如第一方面所述的免疫细胞。

第三方面，本发明提供如第一方面所述的免疫细胞或如第二方面所述的组合物在制备抗肿瘤治疗药物中的应用。

优选地，所述肿瘤为前列腺癌、胰腺癌、胃癌、食管癌、结直肠癌、鼻咽癌、舌癌、喉癌、甲状腺癌、膀胱癌、睾丸癌、头颈癌、骨肉瘤、皮肤癌、间皮瘤、软组织肉瘤、子宫肉瘤、子宫内膜瘤、子宫颈癌、肝癌、卵巢癌、肺癌、黑色素瘤或肾细胞癌中的任意一种或至少两种的组合，优选为前列腺癌。

本发明中，通过基因合成将信号肽序列、透明质酸酶催化活性区域和稳定序列依次串联连接，得到融合基因，然后将融合基因克隆到表达载体中，通过慢病毒包装后转入到t细胞中得到重组细胞。

相比于现有技术，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明通过将透明质酸酶催化活性区域表达到免疫细胞中，随后回输到人体内，回输到体内的免疫细胞能够触及注射器难以接触的部位，通过免疫细胞持续地分泌透明质酸酶，其效果更为持久，且作用范围更加广泛；

(2)本发明通过将透明质酸酶催化活性区域转进基因修饰后的免疫细胞，可以特异性地降解靶向部位或组织的透明质酸，提高特定部位或组织的细胞外基质通透性，从而提高免疫细胞以及药物对靶向部位或组织的浸润；

(3)本发明通过将透明质酸酶催化活性区域与稳定序列串联连接，延长了透明质酸酶在机体内的半衰期。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的表达透明质酸酶过的融合基因示意图；

图2a-图2c为本发明构建的具体的过表达透明质酸酶融合基因的示意图；

图3为本发明实施例4提供的ph20基因过表慢病毒转导jurkat细胞比例图；

图4为本发明实施例5提供的ph20基因过表慢病毒转导jurkat细胞酶活测定结果图；

图5为本发明实施例6提供的过表达ph20基因的jurkat细胞体外迁移能力测试结果图；

图6为本发明实施例7提供的过表达ph20基因的jurkat细胞体内组织浸润能力测试图；

图7为普通t细胞与过表达ph20透明质酸酶编码基因的t细胞转导效率结果对比图，其中，图7a为普通t细胞，图7b为过表达ph20透明质酸的t细胞；

图8为普通t细胞与过表达ph20透明质酸酶编码基因的t细胞肿瘤组织浸润能力结果对比图，其中，图8a为普通t细胞，图8b为过表达ph20透明质酸酶编码基因的t细胞；

图9为过表达不同透明质酸酶编码基因的t细胞、cart细胞浸润和肿瘤杀伤的数据对比，其中，图9a为28天后的结果图，图9b为36天后的结果图；

图10为过表达透明质酸酶编码基因和不过表达透明质酸酶编码基因的不同carscfv和不同胞内结构域组合之间的对比。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例中所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

jurkat细胞、du145细胞来源：广州赛库生物技术有限公司，货号：cc1902、cc1201。

实施例1

透明质酸酶过表达质粒的构建

如图1所示，透明质酸酶过表达基因包括信号肽、透明质酸酶催化活性序列和稳定序列，构建步骤包括：

(1)通过基因合成获得ph20过表达质粒所需各区域dna，包括：信号肽、ph20透明质酸酶催化活性区域和稳定序列，构建得到的融合基因如图2a-图2c所示，其中，信号肽包括tpa信号肽、il-2信号肽、il-7信号肽、ifnγ信号肽、ph20原始信号肽、gmcsf信号肽、il-6信号肽或il-15信号肽；稳定序列包括人igg1fc区序列、人igg2fc区序列、人igg3fc区序列或人igg4fc，构建得到的融合基因的氨基酸序列如seqidno.4-seqidno.47所示；

其中，seqidno.4所示的氨基酸序列如下：mdamkrglccvlllcgavfvsplnfrappvipnvpflwawnapsefclgkfdepldmslfsfigsprinatgqgvtifyvdrlgyypyidsitgvtvnggipqkislqdhldkakkditfympvdnlgmavidweewrptwarnwkpkdvyknrsielvqqqnvqlslteatekakqefekagkdflvetiklgkllrpnhlwgyylfpdcynhhykkpgyngscfnveikrnddlswlwnestalypsiylntqqspvaatlyvrnrvreairvskipdaksplpvfaytrivftdqvlkflsqdelvytfgetvalgasgiviwgtlsimrsmkscllldnymetilnpyiinvtlaakmcsqvlcqeqgvcirknwnssdylhlnpdnfaiqlekggkftvrgkptledleqfsekfycscystlsckekadvkdtdavdvciadgvcidaflkppmeteepqifynaspstlsatmfiappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdisvewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk.

(2)通过pcr、酶切、重组等步骤将所需要的上述合成的基因片段克隆到含有绿色荧光蛋白的表达载体中。

pcr：

用toyobo的kodonetmpcrmastermix对含有重组透明质酸酶基因的puc57载体(puc57-sph20)进行pcr扩增，pcr体系见下表：

pcr扩增的反应条件如下：

酶切：

用thermo的fdmssi(货号fd1344)和fdbcui(fd1253)处理含有绿色荧光蛋白的pwpxld载体，酶切体系见下表：

pwpxld载体酶切体系

酶切处理2h之后，取20ul的载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切取大小约为10000bp的片段再用magen的hipuregelpuremicrokit对其进行回收。

同源重组：采用vazymebiotech的clonexpress的同源重组试剂盒进行同源重组反应，体系见下表：

37℃孵育30min后迅速放在冰面上5min，随后加入trans1-t1感受态20ul静置30min后42℃热激90s后涂板。

后续的验证试验都采用tpa-ph20-igg2这个融合基因进行验证。

实施例2

ph20过表达载体慢病毒包装

(1)在10cm培养皿中培养293t细胞，培养基为：dmem高糖培养基+10％fbs(胎牛血清)+1％双抗(100×青霉素-链霉素混合溶液)；

(2)待培养皿中的293t细胞密度达80％时，更换培养基：dmem高糖培养基+1％fbs+1％双抗；

(3)更换培养基培养2小时后，开始步骤(4)；

(4)取500μl的opti-dmem至15ml离心管中，并且加入7.2μl浓度为10μg/μlpei(线性聚乙烯亚胺)，轻微混匀后，静置5min；

(5)取500μl的opti-dmem至15ml离心管中，取目的质粒9μg、pmd2.g辅助质粒3μg、pspax12μg，加入到离心管中，混匀；

(6)待步骤(4)完成后，将步骤(5)的溶液与之混合，颠倒混匀，静置20min；

(7)将步骤(6)中的溶液全部加到步骤(2)中的细胞中，孵育6h之后，更换新鲜的培养基12ml：dmem高糖培养基+1％fbs+1％双抗；

(8)分别在更换培养基后24h收集上清，更换新鲜的培养基12ml：dmem高糖培养基+1％fbs+1％双抗；

(9)24h后再次收集上清，更换新鲜的培养基12ml：dmem高糖培养基+1％fbs+1％双抗；

(10)24h后收集上清，并且丢弃细胞；

(11)培养基上清收集完毕后，将上清2500g离心0.5小时后取离心上清，用0.45μm过滤器过滤，得到慢病毒，备用。

实施例3

ph20基因过表达慢病毒转导t细胞

(1)t细胞激活：从脐带血中分选出pant之后，对细胞进行计数，将浓度调整至1×10⁶个/ml，随后向每毫升细胞悬液中加入10μl美天旎transacttcell试剂，激活48小时后更换新鲜培养基(培养基为：imdm培养基+5％fbs(胎牛血清)+1％双抗(100×青霉素-链霉素混合溶液)+il-2)；

(2)将4.8×10⁷个激活之后的t细胞300g离心5min，用3ml培养基重悬(培养基为：imdm培养基+5％fbs(胎牛血清)+1％双抗(100×青霉素-链霉素混合溶液))；

(3)将3mlt细胞悬液接种在6孔板中，每孔1ml；

(4)将包装好的ph20基因过表达慢病毒载体加入到6孔板中，每孔9ml；

(5)取10μlpolybreen加入到每个孔中；

(6)培养8h后更换新鲜培养基1ml与9ml病毒(培养基配方为：imdm培养基+10％fbs(胎牛血清)+1％双抗(100×青霉素-链霉素混合溶液))；

(7)每孔加入10μlpolybreen；

(8)5h后撤去病毒，更换新鲜的培养基4ml(培养基配方为：imdm培养基+10％fbs(胎牛血清)+1％双抗(100×青霉素-链霉素混合溶液))；

(9)48小时后取200μl细胞悬液进行流式检测，确认感染效率。

实施例4

ph20基因过表慢病毒转导jurkat细胞

(1)取1×10⁶个jurkat细胞300g离心5min，用1ml培养基重悬(培养基为：1640培养基+10％fbs(胎牛血清)+1％双抗(100×青霉素-链霉素混合溶液))；

(2)将1mljurkat细胞悬液接种在6孔板中；

(3)将包装好的ph20过表达慢病毒载体加入到6孔板中，每孔9ml；

(4)取10μlpolybrene加入到每个孔中；

(5)培养12h后更换新鲜培养基1ml与9ml病毒(培养基配方为：1640培养基+10％fbs(胎牛血清)+1％双抗(100×青霉素-链霉素混合溶液))；

(6)每孔加入10μlpolybrene；

(7)6h后撤去病毒，更换新鲜的培养基5ml(培养基配方为：1640培养基+10％fbs(胎牛血清)+1％双抗(100×青霉素-链霉素混合溶液))；

(8)48小时后取200μl细胞悬液进行流式检测，确认感染效率，结果见图3。

由图3可知，转导了ph20过表达慢病毒的jurkat细胞占了总细胞比例的91.96％，说明该透明质酸酶分子的转导效率很高。

实施例5

ph20酶活测定

配制培养基：准确称取0.59g无水乙酸钠和0.3g牛血清白蛋白，加入270ml无菌水中。充分搅拌溶解后，加入1.36ml冰醋酸，用5mhcl调节溶液ph至3.75，用无菌水定容至300ml，用0.22μm滤器过滤后备用。其中无水乙酸钠的浓度为24mm，冰醋酸的浓度为79mm，牛血清白蛋白(bsa)的浓度为0.1％。

(1)实验前取3×10⁶个过表达ph20的jurkat细胞进行流式检测，确定过表达透明质酸的细胞比例。

(2)将5×10⁵个过表达ph20的jurkat细胞以及野生型的jurkat细胞分别接种于24孔板中，并且加入1900μl含10％fbs(胎牛血清)的1640培养基，每种细胞三个复孔，此外再添加三个不加细胞只加培养基的复孔，作为阴性对照；

(4)培养12h后每个孔取150μl培养液；

(5)13000rpm离心1min；

(6)小心地将100μl培养液加入到96孔板中；

(7)小心地加入200μl酸化bsa避免产生气泡；

(8)使用酶标仪检测600nm(a600)处的吸光值，结果见图4。

由图4可知，与野生型jurkat细胞相比，过表达了ph20的jurkat细胞能显著降低培养基中大分子量透明质酸(ha)的含量。

实施例6

过表达ph20的jurkat细胞体外迁移能力测试

(1)transwell小室制备

①包被基底膜：

用100μl浓度为500μg/mlha包被孔径为0.8μm的transwell小室底部膜的上室面，37℃风干。

②水化基底膜：

吸出培养板中残余液体，每孔加入100μl无血清培养液，37℃，20min。

(2)向transwell的下室加入900μl含10％fbs的1640培养基；

(3)将jurkat细胞离心后用无血清培养基重悬，对jurkat细胞进行计数，取1.5×10⁴个细胞悬液加入transwell上室(上室的培养基体积保持在100-200μl)

(4)6小时后观察统计下室细胞数量，并且拍照，结果见图5。

其中wt-jurkat代表野生型的jurkat细胞，ph20-jurkat代表过表达ph20的jurkat细胞，由图5可知，与野生型jurkat细胞相比，过表达ph20的jurkat细胞在相同的时间内能更快地通过透明质酸包被的transwell基底膜，说明过表达ph20的jurkat细胞浸润能力更强。

实施例7

过表达ph20的jurkat细胞体内组织浸润能力测试

(1)构建肿瘤皮下模型，将5×10⁵个du145细胞皮下注射到8周龄的雄性nsi小鼠右下肢；

(2)3周后，将1×10⁶个表达ph20以及gfp-luciferase(gl)的jurkat细胞通过眼静脉注射注射到小鼠体内。对照组注射1×10⁶个仅表达gl的jurkat细胞；

(3)1周后对小鼠每只小鼠注射荧光素酶底物200μl，3min后进行活体成像，采集数据，结果见图6。

由图6可知，与表达gfp-luciferase(荧光素酶)(gl)基因的jurkat细胞相比，过表达ph20的jurkat细胞能更加广泛地浸润到小鼠的组织中。

实施例8

ph20过表慢病毒转导t细胞

(1)取1×107个t细胞300g离心5min，用1ml培养基重悬(培养基为：imdm培养基+5％fbs(胎牛血清)+1％双抗(100×青霉素-链霉素混合溶液))+3万单位il-2；

(2)将1mlt细胞悬液接种在6孔板中；

(3)将包装好的ph20过表达慢病毒载体加入到6孔板中，每孔9ml；

(4)取10μlpolybrene加入到每个孔中；

(5)培养12h后更换新鲜培养基1ml与9ml病毒(培养基配方为：imdm培养基+5％fbs(胎牛血清)+1％双抗(100×青霉素-链霉素混合溶液)+3万单位il-2)；

(6)每孔加入10μlpolybrene；

(7)6h后撤去病毒，更换新鲜的培养基10ml(培养基配方为：imdm培养基+5％fbs(胎牛血清)+1％双抗(100×青霉素-链霉素混合溶液)+3万单位il-2)；

(8)48小时后取200μl细胞悬液进行流式检测，确认感染效率，结果见图7。

由图7可知，转导了ph20过表达慢病毒的t细胞占了总细胞比例的44.7％，说明该透明质酸酶分子在t细胞上有较高的转导效率。

实施例9

过表达ph20的t细胞体内组织浸润能力测试

(1)构建肿瘤皮下模型，将5×10⁵个du145细胞皮下注射到8周龄的雄性nsi小鼠右下肢；

(2)3周后，将8×10⁶个表达ph20的t细胞通过尾静脉注射到小鼠体内，对照组注射8×10⁶个野生型t细胞；

(3)28天后用游标卡尺测量肿瘤的长和宽，计算肿瘤体积，结果见图8a；

(4)36天后解剖小鼠，取出肿瘤，称量肿瘤重量，结果见图8b；

(5)取出肿瘤称量肿瘤重量之后使用4％多聚甲醛固定液将肿瘤组织固定24小时，随后进行切片，孵育cd3抗体，制片结束后在显微镜下对切片进行观察，结果见图9。

由图9免疫组化结果可知，染色(黑白图中的黑点)表示t细胞，黑点比nc-t对照组多，说明t细胞浸润水平更好。

实施例10

比浊法测定与不同信号肽、稳定序列组合的ph20酶活性

(1)实验前将5×10⁵表达透明质酸酶的细胞接种于24孔板中，并且加入1900ul含10％fbs的1640培养基；

实验组：tpa-ph20-igg2-jurkat细胞、ph20-igg2-jurkat细胞、tpa-ph20-jurkat细胞、ph20-jurkat细胞，每组各3个复孔

对照组：1640培养基、野生型jurkat细胞，每组各3个复孔

(2)每个孔加入100ul浓度为2mg/ml的透明质酸

(3)孵育12h后每个孔取300ul培养液

(4)13000rpm离心1min；

(5)小心地将100ul培养液加入到96孔板中；

(6)小心地加入200ulph为3.75的0.1％牛血清白蛋白溶液；

(7)使用分光光度计检测600nm(a600)处的吸光值.

结果见图10，透明质酸能与牛血清白蛋白在低ph条件下形成沉淀而使得溶液变浑浊。由图10结果可知，tpa-ph20-igg2这一组合在600nm处的吸光值最低，说明浑浊程度最低，透明质酸酶的活性最高。

综上所述，本发明通过在免疫细胞中表达透明质酸酶，从而达到降解细胞外基质的作用，提升细胞外基质的通透性，从而提升免疫细胞的浸润效果，从而增强免疫细胞对实体肿瘤的清除能力。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的透明质酸酶的表达元件、重组细胞及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

sequencelisting

<110>深圳市体内生物医药科技有限公司

<120>一种表达透明质酸酶的免疫细胞及其应用

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