一种组织培养体系及其在动物脑组织培养中的应用的制作方法

本发明属组织培养于
技术领域：
，具体涉及一种组织培养体系以及该培养体系在动物脑组织培养中的应用。
背景技术：
：1970年和1972年，wolf和hauw等第一次发表小脑组织培养的研究。1971年，boyd报告了详细的组织培养技术，并在细胞培养玻片大量培养组织。1973年，ansevin和lipps改进此方法，可在组织培养板中培养组织。1981年至2001年和victorov研究组利用一种称为rollertube技术培养脑组织。1991年，stoppini等利用半透膜培养脑组织。但是现有技术中还没有关于脑神经发育及多种退行性神经疾病研究模型专用培养基的记载。技术实现要素：本发明的目的在于，提供一种新组织培养体系，为动物脑组织在体外长期培养，脑神经发育及多种退行性神经疾病研究模型提供一套支撑体系。为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：提供一种组织培养体系，包括以下体积百分比的组分：bme基础培养基23～26％，mem基础培养基0.8～1.2％，neurobasal基础培养基44～46％，马血清24～26％，b27无血清添加剂1～1.5％，葡萄糖糖液1.2～1.5％，谷氨酸0.8～1.2％和双抗0.8～1.2％。在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。进一步，本发明中的组织培养体系，包括以下体积百分比的组分：bme基础培养基25％，mem基础培养基1％，neurobasal基础培养基45％，马血清25％，b27无血清添加剂1％，葡萄糖糖液1％，谷氨酸1％和双抗1％。本发明中的组织培养基主要用于动物脑组织培养，进行动物脑组织培养时，具体操作如下：s1：用组织切片机将动物脑组织切割成厚度为100～450μm的切片；s2：将动物脑组织切片放入膜插件后，放入组织培养体系中培养；每两天更换一次组织培养体系；培养在37℃、5％co2条件下进行。本发明的有益效果是：采用本发明的培养体系，可使动物脑组织在体外长期培养，可以为癫痫、脑神经发育及多种退行性神经疾病研究模型制备提供新的途径。附图说明图1为动物脑组织用培养体系一体外培养28天后的神经轴突和髓鞘化免疫荧光图片；图2为动物脑组织用培养体系一体外培养15天后制备的神经轴突脱髓鞘模型免疫荧光的图片；图3为动物脑组织用培养体系一体外培养28天后的小胶质细胞免疫荧光图片；图4为动物脑组织用培养体系一体外培养15天后制备的神经轴突脱髓鞘模型中小胶质细胞免疫荧光的图片；图5为动物脑组织用培养体系四体外培养28天后的神经轴突和髓鞘化免疫荧光图片；图6为动物脑组织用培养体系四体外培养15天后的神经轴突和髓鞘化免疫荧光图片。具体实施方式下面结合实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。1.本发明中所用mem培养基的成分如表1所示：表1mem培养基成分表成分含量(mg/l)氯化钙200氯化钾400无水硫酸镁97.67氯化钠6800无水磷酸二氢钠121.74l-精氨酸盐酸盐126l-胱氨酸盐酸盐31.29l-谷氨酰胺292l-组氨酸盐酸盐42l-异亮氨酸52l-亮氨酸52l-赖氨酸盐酸盐72.5l-蛋氨酸15l-苯丙氨酸32l-苏氨酸48l-色氨酸10l-络氨酸36l-缬氨酸46d-葡萄糖1000酚红10d-泛酸钙1氯化胆碱1叶酸1i-肌醇2烟酰胺1盐酸吡哆醛1核黄素0.1盐酸硫胺1ph5.9±0.3渗透压250±5％2.本发明中所用bme培养基的成分如表2所示：表2bme培养基成分表3.本发明中所用bme培养基的成分如表3所示：表2bme培养基成分表4.本发明中所用双抗为含有青霉素(10000iu)和链霉素(10000μg/ml)在100倍的工作浓度的混合液；其配制方法如下：用20ml空针抽16ml三蒸水，溶160万单位/瓶的青霉素g钠一支，过滤除菌；用10ml空针抽10ml三蒸水，溶一支100万单位/瓶的硫酸链霉素一支，过滤除菌。双抗浓度：青霉素g钠，100～1000u/ml；硫酸链霉素，100～1000μg/ml(100万单位＝1g)。5.马血清、b27无血清添加剂、葡萄糖糖液和谷氨酸为商品化试剂。实施例一：配制培养体系取bme基础培养基、mem基础培养基、neurobasal基础培养基、马血清、b27无血清添加剂、葡萄糖糖液、谷氨酸和双抗，将它们按表4中的体积配比进行混合，得到不同的培养体系。表4不同培养体系的组成培养体系一培养体系二培养体系三培养体系四bme基础培养基25242624mem基础培养基11.20.849neurobasal基础培养基4545.843.2——马血清25242624b27无血清添加剂11.51——葡萄糖糖液11.511谷氨酸10.81.21双抗11.20.81实施例二：脑组织培养1.将新生动物大脑利用组织切片机均匀切割成厚度为100～450μm的切片；2.解剖显微镜下选取含有完整大脑结构的脑切片，放入组织培养插件，然后加入培养体系进行培养。培养分为以下三组：组一：用培养体系四培养脑组织；培养方式为：在此培养体系中持续培养28天。组二：用培养体系四培养脑组织；培养方式为：先将脑组织在培养体系中培养15天，然后加入溶血磷脂酰胆碱(50μg/ml)，继续培养17小时，然后更换培养体系继续培养12天。组三：用培养体系一培养脑组织；培养方式为：在此培养体系中持续培养28天。组四：用培养体系一培养脑组织；培养方式为：先将脑组织在培养体系中培养15天，然后加入溶血磷脂酰胆碱(50μg/ml)，继续培养17小时，然后更换培养体系继续培养12天。实施例三：培养结果分析髓鞘化的检测方法：免疫荧光化学鉴定：神经丝蛋白(neurofilament)和髓鞘碱蛋白(mbp)是轴突和髓鞘的标记物，抗neurofilament和mbp抗体购买于abcam和millipore，二抗抗体488绿色和546红色标记山羊抗兔购买于jackson。荧光化学鉴定结果如图1、2和5所示。小胶质细胞的检测方法：免疫荧光化学鉴定：iba1是小胶质细胞的标记物，抗iba1抗体购买于abcam，二抗抗体488绿色标记山羊抗兔购买于jackson。小胶质细胞检测结果如图3、4和6所示。如图1所示，动物脑组织在培养体系一中培养28天后经免疫荧光化学染色，轴突成线型结构；髓鞘成线段式围绕轴突。如图2所示，动物脑组织在培养体系一中培养并用溶血磷脂酰胆碱处理后，经免疫荧光化学染色，髓鞘包裹轴突数量减少，轴突表现为脱髓鞘。如图3至图4所示，动物脑组织在培养体系一中培养后经小胶质细胞免疫荧光化学染色，小胶质细胞胞体较小，分枝较多。如图5所示，动物脑组织在培养体系四中培养28天后经免疫荧光化学染色，轴突几乎未见；髓鞘未成线段式围绕轴突。如图6所示，动物脑组织在培养体系四中培养并用溶血磷脂酰胆碱处理后，经免疫荧光化学染色后，轴突未见，髓鞘未见。从上述结果可以得知，本发明所申请的培养体系可支持培养的脑组织髓鞘化及髓鞘再生，且小胶质细胞形态表现为支持髓鞘再生的细胞形态。虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。当前第1页1 2 3