一种肿瘤标志物及其应用的制作方法

1.本发明涉及肿瘤分子生物学领域，具体涉及一种肿瘤癌症标志物及其应用。


背景技术：

2.新辅助化学疗法是癌症患者的一种广泛应用的治疗选择，并且一些大型临床试验表明，新辅助化学疗法在改善预后以及在治疗开始之前确定响应性患者方面具有优势，因此可以制定更好的治疗方案。但是，相当一部分的癌症患者对新辅助化疗的响应不佳。迄今为止，只有某些临床特征(例如年龄和术前体重减轻)可用于患者选择，但功能非常有限。此外，还不清楚新辅助化学疗法如何改变癌症信号传导并影响肿瘤微环境。
3.胃癌(gc)是世界上最常见的癌症类型之一，也是癌症相关死亡的第二大常见原因(8.2％)。中国是gc患者最多的国家，根据中国国家中央癌症登记处的数据，新诊断的gc病例超过679,000例，每年约有498,000例与gc相关的死亡发生。这些患者大多数处于晚期，其5年生存率＜30％。尽管外科手术治疗是gc的主要治疗方法，但仍采用多式联运策略以提高患者生存率。在尝试进行根治性切除术之前，新辅助(或围手术期)化学疗法可以“缩小肿瘤的大小”。此外，对于有高风险发生远处转移的gc患者，新辅助化疗通过消除潜在的癌细胞并为术后辅助化疗提供敏感的治疗方案，从而帮助降低风险。与单独手术相比，这种方法的好处已通过多项临床试验证明。目前，新辅助化疗常规用于可切除晚期gc患者的治疗。
4.但是，仍然有相当一部分的gc癌症患者对新辅助化疗的响应不佳，还不清楚新辅助化学疗法如何改变癌症信号传导并影响肿瘤微环境。对这些问题的透彻理解对于制定优化的多模态治疗计划至关重要。因此，迫切需要表征可预测治疗响应的分子标志物。


技术实现要素：

5.在致力于探究新辅助化学疗法如何改变癌症信号传导并影响肿瘤微环境的研究中，发明人团队成功获得了可预测治疗响应的分子标志物。这一发现对于为癌症患者制定优化的多模态治疗计划至关重要。据此，
6.本发明提出如下的技术方案。
7.一方面，本发明提供c10orf71相关分子在制备预测肿瘤患者化疗响应性或化疗耐性的产品中的应用，所述c10orf71相关分子包括c10orf71染色体核酸片段、c10orf71外显子、c10orf71 mrna、c10orf71编码蛋白。
8.进一步，本发明所述c10orf71相关分子在制备预测肿瘤患者化疗响应性或化疗耐性的产品中的应用，其中根据c10orf71相关分子是否存在突变进行预测，与具有野生型c10orf71相关分子的受试者相比，具有突变型c10orf71相关分子的受试者对化疗的响应性更低、对化疗的耐受性更高。
9.更进一步，本发明所述c10orf71相关分子在制备预测肿瘤患者化疗响应性或化疗耐性的产品中的应用，其中所述化疗包括使用选自下组中一种或多种药物进行治疗：铂类、亚硝脲类、抗嘧啶类、长春碱类、紫杉醇类、喜树碱类、蒽环类、抗叶酸类的化疗药。
10.所述铂类包括但不限于顺铂、卡铂、奈达铂、奥沙利铂、洛铂等。
11.所述亚硝脲类包括但不限于卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、尼莫司汀等。
12.所述抗嘧啶类包括但不限于卡培他滨、吉西他滨、安西他滨、替加氟、氟尿苷、去氧氟尿苷、尤福定等。
13.所述长春碱类包括但不限于长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨等。
14.所述紫杉醇类包括但不限于紫杉醇、多西紫杉醇、长效紫杉醇等。
15.所述喜树碱类包括但不限于喜树碱、伊立替康、拓扑替康、卢比替康等。
16.所述蒽环类包括但不限于多柔比星、表柔比星、吡柔比星等。
17.所述抗叶酸类包括但不限于培美曲塞、洛拉曲塞、雷替曲塞等。
18.在一个具体实施例中，所述化疗包括使用选自下组中一种或多种药物进行治疗：氟尿嘧啶、卡培他滨、奥沙利铂。更具体的所述化疗为xelox或sox。
19.第二方面，本发明提供c10orf71相关分子检测试剂在制备预测肿瘤患者化疗响应性或化疗耐性的产品中的应用，所述c10orf71相关分子包括c10orf71染色体核酸片段、c10orf71外显子、c10orf71 mrna、c10orf71编码蛋白。
20.进一步，本发明所述c10orf71相关分子检测试剂在制备预测肿瘤患者化疗响应性或化疗耐性的产品中的应用，其中根据c10orf71相关分子是否存在突变进行预测，与具有野生型c10orf71相关分子的受试者相比，具有突变型c10orf71相关分子的受试者对化疗的响应性更低、对化疗的耐受性更高。
21.更进一步，本发明所述c10orf71相关分子检测试剂在制备预测肿瘤患者化疗响应性或化疗耐性的产品中的应用，其中所述化疗包括使用选自下组中一种或多种药物进行治疗：铂类、亚硝脲类、抗嘧啶类、长春碱类、紫杉醇类、喜树碱类、蒽环类、抗叶酸类的化疗药。
22.所述铂类包括但不限于顺铂、卡铂、奈达铂、奥沙利铂、洛铂等。
23.所述亚硝脲类包括但不限于卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、尼莫司汀等。
24.所述抗嘧啶类包括但不限于卡培他滨、吉西他滨、安西他滨、替加氟、氟尿苷、去氧氟尿苷、尤福定等。
25.所述长春碱类包括但不限于长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨等。
26.所述紫杉醇类包括但不限于紫杉醇、多西紫杉醇、长效紫杉醇等。
27.所述喜树碱类包括但不限于喜树碱、伊立替康、拓扑替康、卢比替康等。
28.所述蒽环类包括但不限于多柔比星、表柔比星、吡柔比星等。
29.所述抗叶酸类包括但不限于培美曲塞、洛拉曲塞、雷替曲塞等。
30.在一个具体实施例中，所述化疗包括使用选自下组中一种或多种药物进行治疗：氟尿嘧啶、卡培他滨、奥沙利铂；更具体的所述化疗为xelox或sox。
31.第三方面，本发明提供c10orf71相关分子在筛选肿瘤治疗药物中的应用，所述c10orf71相关分子包括c10orf71染色体核酸片段、c10orf71外显子、c10orf71 mrna、c10orf71编码蛋白。
32.进一步，如本发明所述c10orf71相关分子在筛选肿瘤治疗药物中的应用，其中使用突变型c10orf71相关分子、具有突变型c10orf71相关分子的肿瘤细胞系、和/或具有突变型c10orf71相关分子的动物模型来筛选对化疗耐性肿瘤有治疗作用的药物。
33.更进一步，如本发明所述c10orf71相关分子在筛选肿瘤治疗药物中的应用，其中
所述肿瘤治疗药物包括现有技术中用于治疗的所有药物，进一步使用选自下组中一种或多种药物进行治疗：氟尿嘧啶、卡培他滨、奥沙利铂；优选所述化疗为xelox或sox。第四方面，本发明提供c10orf71相关分子在制备细胞周期调节剂中的应用，所述c10orf71相关分子包括c10orf71染色体核酸片段、c10orf71外显子、c10orf71 mrna、c10orf71编码蛋白。
34.进一步，如本发明提供c10orf71相关分子在制备细胞周期调节剂中的应用，其中通过在c10orf71相关分子上引入突变来降低细胞周期活跃状态，或者通过消除c10orf71相关分子上的突变来提高细胞周期活跃状态。
35.第五方面，本发明提供一种c10orf71相关分子，所述c10orf71相关分子包括c10orf71染色体核酸片段、c10orf71外显子、c10orf71 mrna、c10orf71编码蛋白。
36.其中与野生型相比所述c10orf71相关分子相应的染色体dna上具有选自下组的一种或多种突变：第10染色体第50533324位的g
→
a突变、第50531231位的g
→
t突变、第50533112位的t
→
g突变、第50530612的t
→
c突变、第50531938位的a
→
g突变。
37.进一步，如本发明所述的c10orf71相关分子，其中所述c10orf71编码蛋白的氨基酸序列上具有选自下组的突变：d912n、r214m、l841r、c8r和i450v的突变。
38.第六方面，本发明提供所述c10orf71相关分子的检测试剂，其中通过所述检测试剂能够确定待测样本中是否存在上述突变。
39.所述突变包括其染色体dna上具有选自下组的一种或多种突变：第10染色体第50533324位的g
→
a突变、第50531231位的g
→
t突变、第50533112位的t
→
g突变、第50530612的t
→
c突变、第50531938位的a
→
g突变。
40.更进一步，上述突变导致c10orf71编码蛋白的氨基酸序列上具有选自下组的突变：d912n、r214m、l841r、c8r和i450v的突变。
41.更进一步，本发明所述c10orf71相关分子的检测试剂，其为核酸引物、探针、适体、抗体等。
42.第七方面，本发明提供c10orf71相关分子的突变在预测肿瘤患者化疗响应性或化疗耐性中的应用，其中c10orf71相关分子包括c10orf71染色体核酸片段、c10orf71外显子、c10orf71 mrna、c10orf71编码蛋白。
43.进一步，如本发明所述c10orf71相关分子的突变在预测肿瘤患者化疗响应性或化疗耐性中的应用，其中所述c10orf71相关分子的突变包括其染色体dna上具有选自下组的一种或多种突变：第10染色体第50533324位的g
→
a突变、第50531231位的g
→
t突变、第50533112位的t
→
g突变、第50530612的t
→
c突变、第50531938位的a
→
g突变。
44.更进一步，如本发明所述c10orf71相关分子的突变在预测肿瘤患者化疗响应性或化疗耐性中的应用，其中所述c10orf71编码蛋白的氨基酸序列上具有选自下组的突变：d912n、r214m、l841r、c8r和i450v的突变。
45.据此，本发明提出如下权利要求进行保护
46.1.c10orf71相关分子在制备预测肿瘤患者化疗响应性或化疗耐性的产品中的应用，所述c10orf71相关分子包括c10orf71染色体核酸片段、c10orf71外显子、c10orf71 mrna、c10orf71编码蛋白。
47.2.c10orf71相关分子检测试剂在制备预测肿瘤患者化疗响应性或化疗耐性的产品中的应用，所述c10orf71相关分子包括c10orf71染色体核酸片段、c10orf71外显子、
c10orf71 mrna、c10orf71编码蛋白。
48.3.如权利要求1-2任一所述的应用，其中根据c10orf71相关分子是否存在突变进行预测，与具有野生型c10orf71相关分子的受试者相比，具有突变型c10orf71相关分子的受试者对化疗的响应性更低、对化疗的耐受性更高。
49.4.如权利要求1-3任一所述的应用，其中，化疗包括使用选自下组中一种或多种药物进行治疗：铂类、亚硝脲类、抗嘧啶类、长春碱类、紫杉醇类、喜树碱类、蒽环类、抗叶酸类的化疗药。
50.5.如权利要求1-4任一所述的应用，其中，所述铂类包括但不限于顺铂、卡铂、奈达铂、奥沙利铂、洛铂等
51.6.如权利要求1-4任一所述的应用，其中所述亚硝脲类包括但不限于卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、尼莫司汀等。
52.7.如权利要求1-4任一所述的应用，其中所述抗嘧啶类包括但不限于卡培他滨、吉西他滨、安西他滨、替加氟、氟尿苷、去氧氟尿苷、尤福定等。
53.8.如权利要求1-4任一所述的应用，其中所述长春碱类包括但不限于长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨等。
54.9.如权利要求1-4任一所述的应用，其中所述紫杉醇类包括但不限于紫杉醇、多西紫杉醇、长效紫杉醇等。
55.10.如权利要求1-4任一所述的应用，其中所述喜树碱类包括但不限于喜树碱、伊立替康、拓扑替康、卢比替康等。
56.11.如权利要求1-4任一所述的应用，其中所述蒽环类包括但不限于多柔比星、表柔比星、吡柔比星等。
57.12.如权利要求1-4任一所述的应用，其中所述抗叶酸类包括但不限于培美曲塞、洛拉曲塞、雷替曲塞等。
58.13.如权利要求1-4任一所述的应用，其中所述化疗包括使用选自下组中一种或多种药物进行治疗氟尿嘧啶、卡培他滨、奥沙利铂。
59.14.如权利要求1-4任一所述的应用，其中所述化疗为xelox或sox。
60.15.如权利要求1-14任一所述的应用，其中所述肿瘤包括乳头状瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺瘤或腺癌、囊腺瘤或囊腺癌、多形性腺瘤、乳头状瘤、移行上皮癌等。
61.16.如权利要求15所述的应用，其中所述乳头状瘤见于皮肤、鼻、鼻窦、喉等处；鳞癌见于宫颈、皮肤、食管、鼻咽、肺、喉、阴茎等处；基底细胞癌见于头面部皮肤；腺瘤见于皮肤、甲状腺、胃、肠；腺癌见于胃、肠、乳腺、甲状腺等；囊腺瘤或囊腺癌见于卵巢；多形性腺瘤见于涎腺；乳头状瘤和移行上皮癌见于膀胱、肾盂。
62.17.如权利要求15所述的应用，其中所述间叶组织肿瘤包括但不限于纤维瘤、纤维肉瘤、良性或恶性纤维组织细胞瘤、脂肪瘤、脂肪肉瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌瘤、横纹肌肉瘤、血管瘤、淋巴管瘤、血管肉瘤、淋巴管肉瘤、骨瘤、骨肉瘤、巨细胞瘤、恶性巨细胞瘤、软骨瘤、软骨肉瘤、滑膜瘤、滑膜肉瘤、间皮瘤、恶性间皮瘤。
63.18.如权利要求15所述的应用，其中所述纤维瘤、纤维肉瘤、良性或恶性纤维组织细胞瘤多见于四肢；脂肪瘤多见于皮下组织，脂肪肉瘤多见于下肢和腹膜后；平滑肌瘤和平滑肌肉瘤见于子宫和胃肠；横纹肌瘤和横纹肌肉瘤多见于头颈、生殖泌尿道及四肢；血管
瘤、血管肉瘤、淋巴肉瘤、淋巴管肉瘤多见于皮肤、皮下组织、舌、唇等；骨瘤、骨肉瘤、巨细胞瘤多见于骨组织；软骨瘤多见于手足短骨，软骨肉瘤多见于盆骨、肋骨、股骨、肱骨、及肩胛骨等；滑膜瘤多见于关节附近；间皮瘤多见于胸膜、腹膜等。
64.19.如权利要求15所述的应用，其中所述造血淋巴组织肿瘤包括但不限于恶性淋巴瘤、各种白血病、多发性骨髓瘤。
65.20.如权利要求15所述的应用，其中所述神经组织肿瘤包括但不限于神经纤维瘤、神经纤维肉瘤、神经鞘瘤、恶性神经鞘瘤、胶质细胞瘤、恶性胶质细胞瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、恶性脑膜瘤、节细胞神经瘤、神经母细胞瘤等。
66.21.如权利要求15所述的应用，其中所述皮肤和生殖系统肿瘤包括但不限于发生于皮肤和粘膜的黑色素瘤，发生于子宫的葡萄胎、绒毛膜上皮癌、恶性葡萄胎，发生于卵巢、睾丸、纵膈、骶尾的支持细胞和间质细胞瘤、恶性支持细胞和间质细胞瘤、颗粒细胞瘤、恶性颗粒细胞瘤、精原细胞瘤、无性细胞瘤、胚胎性癌、畸胎瘤、恶性畸胎瘤等。
67.22.如权利要求1-14任一所述的应用，其中所述肿瘤包括呼吸系统肿瘤、消化系统肿瘤、泌尿系统肿瘤、循环系统肿瘤、运动系统肿瘤、生殖系统肿瘤、其他肿瘤等。23.如权利要求22所述的应用，其中所述呼吸系统肿瘤包括但不限于肺癌、鼻咽癌、喉癌、腺癌等；
68.24.如权利要求22所述的应用，其中所述消化系统肿瘤包括但不限于胃癌、肝癌、食道癌、肠癌、胰腺癌、胆囊癌、腹膜癌、肛门癌、壶腹周围癌、口腔癌、盲肠癌、腮腺癌、印戒细胞癌、胰岛素癌等；
69.25.如权利要求22所述的应用，其中所述泌尿系统肿瘤包括但不限于肾癌、膀胱癌、前列腺癌、尿道癌、透明细胞癌；
70.26.如权利要求22所述的应用，其中所述循环系统肿瘤包括急性或慢性白血病、淋巴癌、血管瘤、动脉瘤、血管母细胞瘤等；
71.27.如权利要求22所述的应用，其中所述运动系统肿瘤包括骨癌、腱鞘癌、平滑肌瘤、神经鞘瘤等；
72.28.如权利要求22所述的应用，其中所述生殖系统肿瘤包括宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、畸胎瘤、绒毛膜癌、输卵管癌、阴道癌、阴茎癌等；
73.29.如权利要求22所述的应用，其中所述其他肿瘤包括脂肪瘤、乳腺癌、脑瘤、鳞癌、皮肤癌、甲状腺癌、唇癌、黑色素癌、舌癌、垂体瘤、错构瘤、粉瘤、胶质瘤、汗管瘤、间质瘤、颅肿瘤、肉瘤、软骨瘤、头颈癌、纤维癌、眼癌、胸腔癌、牙龈癌、基底细胞腺癌、浸润性导管癌、外耳道胆脂瘤、皮脂腺癌、听神经瘤、嗜铬细胞瘤、纵膈肿瘤等。
74.30.c10orr71相关分子在筛选肿瘤治疗药物中的应用，所述c10orf71相关分子包括c10orf71染色体核酸片段、c10orr71外显子、c10orf71 mrna、c10orf71编码蛋白。
75.31.如权利要求30所述的应用，其中使用突变型c10orf71相关分子、具有突变型c10orf71相关分子的肿瘤细胞系、和/或具有突变型c10orf71相关分子的动物模型来筛选对化疗耐性肿瘤有治疗作用的药物。
76.32.如权利要求30-31任一所述的应用，其中，化疗包括使用选自下组中一种或多种药物进行治疗：铂类、亚硝脲类、抗嘧啶类、长春碱类、紫杉醇类、喜树碱类、蒽环类、抗叶酸类的化疗药。
77.33.如权利要求30-31任一所述的应用，其中，所述铂类包括但不限于顺铂、卡铂、
奈达铂、奥沙利铂、洛铂等
78.34.如权利要求30-31任一所述的应用，其中所述亚硝脲类包括但不限于卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、尼莫司汀等。
79.35.如权利要求30-31任一所述的应用，其中所述抗嘧啶类包括但不限于卡培他滨、吉西他滨、安西他滨、替加氟、氟尿苷、去氧氟尿苷、尤福定等。
80.36.如权利要求30-31任一所述的应用，其中所述长春碱类包括但不限于长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨等。
81.37.如权利要求30-31任一所述的应用，其中所述紫杉醇类包括但不限于紫杉醇、多西紫杉醇、长效紫杉醇等。
82.38.如权利要求30-31任一所述的应用，其中所述喜树碱类包括但不限于喜树碱、伊立替康、拓扑替康、卢比替康等。
83.39.如权利要求30-31任一所述的应用，其中所述蒽环类包括但不限于多柔比星、表柔比星、吡柔比星等。
84.40.如权利要求30-31任一所述的应用，其中所述抗叶酸类包括但不限于培美曲塞、洛拉曲塞、雷替曲塞等。
85.41.如权利要求30-31任一所述的应用，其中所述化疗包括使用选自下组中一种或多种药物进行治疗氟尿嘧啶、卡培他滨、奥沙利铂。
86.42.如权利要求30-31任一所述的应用，其中所述化疗为xelox或sox。
87.43.如权利要求30-42任一所述的应用，其中所述肿瘤包括乳头状瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺瘤或腺癌、囊腺瘤或囊腺癌、多形性腺瘤、乳头状瘤、移行上皮癌等。
88.44.如权利要求43所述的应用，其中所述乳头状瘤见于皮肤、鼻、鼻窦、喉等处；鳞癌见于宫颈、皮肤、食管、鼻咽、肺、喉、阴茎等处；基底细胞癌见于头面部皮肤；腺瘤见于皮肤、甲状腺、胃、肠；腺癌见于胃、肠、乳腺、甲状腺等；囊腺瘤或囊腺癌见于卵巢；多形性腺瘤见于涎腺；乳头状瘤和移行上皮癌见于膀胱、肾盂。
89.45.如权利要求43所述的应用，其中所述间叶组织肿瘤包括但不限于纤维瘤、纤维肉瘤、良性或恶性纤维组织细胞瘤、脂肪瘤、脂肪肉瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌瘤、横纹肌肉瘤、血管瘤、淋巴管瘤、血管肉瘤、淋巴管肉瘤、骨瘤、骨肉瘤、巨细胞瘤、恶性巨细胞瘤、软骨瘤、软骨肉瘤、滑膜瘤、滑膜肉瘤、间皮瘤、恶性间皮瘤。
90.46.如权利要求43所述的应用，其中所述纤维瘤、纤维肉瘤、良性或恶性纤维组织细胞瘤多见于四肢；脂肪瘤多见于皮下组织，脂肪肉瘤多见于下肢和腹膜后；平滑肌瘤和平滑肌肉瘤见于子宫和胃肠；横纹肌瘤和横纹肌肉瘤多见于头颈、生殖泌尿道及四肢；血管瘤、血管肉瘤、淋巴肉瘤、淋巴管肉瘤多见于皮肤、皮下组织、舌、唇等；骨瘤、骨肉瘤、巨细胞瘤多见于骨组织；软骨瘤多见于手足短骨，软骨肉瘤多见于盆骨、肋骨、股骨、肱骨、及肩胛骨等；滑膜瘤多见于关节附近；间皮瘤多见于胸膜、腹膜等。
91.47.如权利要求43所述的应用，其中所述造血淋巴组织肿瘤包括但不限于恶性淋巴瘤、各种白血病、多发性骨髓瘤。
92.48.如权利要求43所述的应用，其中所述神经组织肿瘤包括但不限于神经纤维瘤、神经纤维肉瘤、神经鞘瘤、恶性神经鞘瘤、胶质细胞瘤、恶性胶质细胞瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、恶性脑膜瘤、节细胞神经瘤、神经母细胞瘤等。
93.49.如权利要求43所述的应用，其中所述皮肤和生殖系统肿瘤包括但不限于发生于皮肤和粘膜的黑色素瘤，发生于子宫的葡萄胎、绒毛膜上皮癌、恶性葡萄胎，发生于卵巢、睾丸、纵膈、骶尾的支持细胞和间质细胞瘤、恶性支持细胞和间质细胞瘤、颗粒细胞瘤、恶性颗粒细胞瘤、精原细胞瘤、无性细胞瘤、胚胎性癌、畸胎瘤、恶性畸胎瘤等。
94.50.如权利要求30-42任一所述的应用，其中所述肿瘤包括呼吸系统肿瘤、消化系统肿瘤、泌尿系统肿瘤、循环系统肿瘤、运动系统肿瘤、生殖系统肿瘤、其他肿瘤等。
95.51.如权利要求50所述的应用，其中所述呼吸系统肿瘤包括但不限于肺癌、鼻咽癌、喉癌、腺癌等；
96.52.如权利要求50所述的应用，其中所述消化系统肿瘤包括但不限于胃癌、肝癌、食道癌、肠癌、胰腺癌、胆囊癌、腹膜癌、肛门癌、壶腹周围癌、口腔癌、盲肠癌、腮腺癌、印戒细胞癌、胰岛素癌等；
97.53.如权利要求50所述的应用，其中所述泌尿系统肿瘤包括但不限于肾癌、膀胱癌、前列腺癌、尿道癌、透明细胞癌；
98.54.如权利要求50所述的应用，其中所述循环系统肿瘤包括急性或慢性白血病、淋巴癌、血管瘤、动脉瘤、血管母细胞瘤等；
99.55.如权利要求50所述的应用，其中所述运动系统肿瘤包括骨癌、腱鞘癌、平滑肌瘤、神经鞘瘤等；
100.56.如权利要求50所述的应用，其中所述生殖系统肿瘤包括宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、畸胎瘤、绒毛膜癌、输卵管癌、阴道癌、阴茎癌等。
101.57.如权利要求50所述的应用，其中所述其他肿瘤包括脂肪瘤、乳腺癌、脑瘤、鳞癌、皮肤癌、甲状腺癌、唇癌、黑色素癌、舌癌、垂体瘤、错构瘤、粉瘤、胶质瘤、汗管瘤、间质瘤、颅肿瘤、肉瘤、软骨瘤、头颈癌、纤维癌、眼癌、胸腔癌、牙龈癌、基底细胞腺癌、浸润性导管癌、外耳道胆脂瘤、皮脂腺癌、听神经瘤、嗜铬细胞瘤、纵膈肿瘤等。
102.58.c10orf71相关分子在制备细胞周期调节剂中的应用，所述c10orf71相关分子包括c10orf71染色体核酸片段、c10orf71外显子、c10orf71 mrna、c10orf71编码蛋白。
103.59.如权利要求58所述的应用，其特征在于通过在c10orf71相关分子上引入突变来降低细胞周期活跃状态，或者通过消除c10orf71相关分子上的突变来提高细胞周期活跃状态。
104.60.如权利要求58-59任一项所述的应用，其中所述c10orf71相关分子上的突变染色体dna上具有选自下组的一种或多种突变：第10染色体第50533324位的g
→
a突变、第50531231位的g
→
t突变、第50533112位的t
→
g突变、第50530612的t
→
c突变、第50531938位的a
→
g突变。
105.61.如权利要求58-60任一项所述的应用，其中c10orf71相关分子上的突变导致所述c10orf71编码蛋白的氨基酸序列上具有选自下组的突变：d912n、r214m、l841r、c8r和i450v的突变。
106.62.一种c10orf71相关分子，所述c10orf71相关分子包括c10orf71染色体核酸片段、c10orf71外显子、c10orf71 mrna、c10orf71编码蛋白，其特征在于，所述c10orf71相关分子相应的染色体dna上具有选自下组的一种或多种突变：第10染色体第50533324位的g
→
a突变、第50531231位的g
→
t突变、第50533112位的t
→
g突变、第50530612的t
→
c突变、第
50531938位的a
→
g突变。
107.63.如权利要求62所述的c10orf71相关分子，其特征在于所述c10orf71编码蛋白的氨基酸序列上具有选自下组的突变：d912n、r214m、l841r、c8r和i450v的突变。
108.64.如权利要求62或63所述c10orf71相关分子的检测试剂，其特征在于通过所述检测试剂能够确定待测样本中是否存在上述突变。
109.65.如权要求64所述c10orf71相关分子的检测试剂，其为抗体、适体、引物、探针等。
110.66.如权利要求64-65所述c10orf71相关分子的检测试剂，所述抗体为鼠源抗体、卵黄抗体、人抗体、人源化抗体、兔源抗体、嵌合抗体、重链抗体、单链抗体、单域抗体、以及抗体的抗原结合片段。
111.67.如权利要求64-65所述c10orf71相关分子的检测试剂，所述抗体通过修饰携带酶标记、光学标记、荧光标记、同位素标记、量子点标记等。
112.68.如权利要求64-65所述c10orf71相关分子的检测试剂，所述适体为天然或修饰的dna、rna、pna等。
113.69.如权利要求64-65所述c10orf71相关分子的检测试剂，所述适体为单链或双链。
114.70.c10orf71相关分子的突变在预测肿瘤患者化疗响应性或化疗耐性中的应用，其中c10orf71相关分子包括c10orf71染色体核酸片段、c10orf71外显子、c10orf71 mrna、c10orf71编码蛋白。
115.71.如权利要求70所述应用，其中所述c10orf71相关分子的突变包括其染色体dna上具有选自下组的一种或多种突变：第10染色体第50533324位的g
→
a突变、第50531231位的g
→
t突变、第50533112位的t
→
g突变、第50530612的t
→
c突变、第50531938位的a
→
g突变。
116.72.如权利要求70或71所述的应用，其特征在于所述c10orf71编码蛋白的氨基酸序列上具有选自下组的突变：d912n、r214m、l841r、c8r和i450v的突变。
117.73.如权利要求70-72任一所述的应用，其中，化疗包括使用选自下组中一种或多种药物进行治疗：铂类、亚硝脲类、抗嘧啶类、长春碱类、紫杉醇类、喜树碱类、蒽环类、抗叶酸类的化疗药。
118.74.如权利要求70-72任一所述的应用，其中，所述铂类包括但不限于顺铂、卡铂、奈达铂、奥沙利铂、洛铂等
119.75.如权利要求70-72任一所述的应用，其中所述亚硝脲类包括但不限于卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、尼莫司汀等。
120.76.如权利要求70-72任一所述的应用，其中所述抗嘧啶类包括但不限于卡培他滨、吉西他滨、安西他滨、替加氟、氟尿苷、去氧氟尿苷、尤福定等。
121.77.如权利要求70-72任一所述的应用，其中所述长春碱类包括但不限于长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨等。
122.78.如权利要求70-72任一所述的应用，其中所述紫杉醇类包括但不限于紫杉醇、多西紫杉醇、长效紫杉醇等。
123.79.如权利要求70-72任一所述的应用，其中所述喜树碱类包括但不限于喜树碱、
伊立替康、拓扑替康、卢比替康等。
124.80.如权利要求70-72任一所述的应用，其中所述蒽环类包括但不限于多柔比星、表柔比星、吡柔比星等。
125.81.如权利要求70-72任一所述的应用，其中所述抗叶酸类包括但不限于培美曲塞、洛拉曲塞、雷替曲塞等。
126.82.如权利要求70-72任一所述的应用，其中所述化疗包括使用选自下组中一种或多种药物进行治疗氟尿嘧啶、卡培他滨、奥沙利铂。
127.83.如权利要求70-72任一所述的应用，其中所述化疗为xelox或sox。
128.84.如权利要求70-72任一所述的应用，其中所述肿瘤包括乳头状瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺瘤或腺癌、囊腺瘤或囊腺癌、多形性腺瘤、乳头状瘤、移行上皮癌等。
129.85.如权利要求84所述的应用，其中所述乳头状瘤见于皮肤、鼻、鼻窦、喉等处；鳞癌见于宫颈、皮肤、食管、鼻咽、肺、喉、阴茎等处；基底细胞癌见于头面部皮肤；腺瘤见于皮肤、甲状腺、胃、肠；腺癌见于胃、肠、乳腺、甲状腺等；囊腺瘤或囊腺癌见于卵巢；多形性腺瘤见于涎腺；乳头状瘤和移行上皮癌见于膀胱、肾盂。
130.86.如权利要求84所述的应用，其中所述间叶组织肿瘤包括但不限于纤维瘤、纤维肉瘤、良性或恶性纤维组织细胞瘤、脂肪瘤、脂肪肉瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌瘤、横纹肌肉瘤、血管瘤、淋巴管瘤、血管肉瘤、淋巴管肉瘤、骨瘤、骨肉瘤、巨细胞瘤、恶性巨细胞瘤、软骨瘤、软骨肉瘤、滑膜瘤、滑膜肉瘤、间皮瘤、恶性间皮瘤。
131.87.如权利要求84所述的应用，其中所述纤维瘤、纤维肉瘤、良性或恶性纤维组织细胞瘤多见于四肢；脂肪瘤多见于皮下组织，脂肪肉瘤多见于下肢和腹膜后；平滑肌瘤和平滑肌肉瘤见于子宫和胃肠；横纹肌瘤和横纹肌肉瘤多见于头颈、生殖泌尿道及四肢；血管瘤、血管肉瘤、淋巴肉瘤、淋巴管肉瘤多见于皮肤、皮下组织、舌、唇等；骨瘤、骨肉瘤、巨细胞瘤多见于骨组织；软骨瘤多见于手足短骨，软骨肉瘤多见于盆骨、肋骨、股骨、肱骨、及肩胛骨等；滑膜瘤多见于关节附近；间皮瘤多见于胸膜、腹膜等。
132.88.如权利要求84所述的应用，其中所述造血淋巴组织肿瘤包括但不限于恶性淋巴瘤、各种白血病、多发性骨髓瘤。
133.89.如权利要求84所述的应用，其中所述神经组织肿瘤包括但不限于神经纤维瘤、神经纤维肉瘤、神经鞘瘤、恶性神经鞘瘤、胶质细胞瘤、恶性胶质细胞瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、恶性脑膜瘤、节细胞神经瘤、神经母细胞瘤等。
134.90.如权利要求84所述的应用，其中所述皮肤和生殖系统肿瘤包括但不限于发生于皮肤和粘膜的黑色素瘤，发生于子宫的葡萄胎、绒毛膜上皮癌、恶性葡萄胎，发生于卵巢、睾丸、纵膈、骶尾的支持细胞和间质细胞瘤、恶性支持细胞和间质细胞瘤、颗粒细胞瘤、恶性颗粒细胞瘤、精原细胞瘤、无性细胞瘤、胚胎性癌、畸胎瘤、恶性畸胎瘤等。
135.91.如权利要求70-72任一所述的应用，其中所述肿瘤包括呼吸系统肿瘤、消化系统肿瘤、泌尿系统肿瘤、循环系统肿瘤、运动系统肿瘤、生殖系统肿瘤、其他肿瘤等。
136.92.如权利要求91所述的应用，其中所述呼吸系统肿瘤包括但不限于肺癌、鼻咽癌、喉癌、腺癌等；
137.93.如权利要求91所述的应用，其中所述消化系统肿瘤包括但不限于胃癌、肝癌、食道癌、肠癌、胰腺癌、胆囊癌、腹膜癌、肛门癌、壶腹周围癌、口腔癌、盲肠癌、腮腺癌、印戒
细胞癌、胰岛素癌等；
138.94.如权利要求91所述的应用，其中所述泌尿系统肿瘤包括但不限于肾癌、膀胱癌、前列腺癌、尿道癌、透明细胞癌；
139.95.如权利要求91所述的应用，其中所述循环系统肿瘤包括急性或慢性白血病、淋巴癌、血管瘤、动脉瘤、血管母细胞瘤等；
140.96.如权利要求91所述的应用，其中所述运动系统肿瘤包括骨癌、腱鞘癌、平滑肌瘤、神经鞘瘤等；
141.97.如权利要求91所述的应用，其中所述生殖系统肿瘤包括宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、畸胎瘤、绒毛膜癌、输卵管癌、阴道癌、阴茎癌等。
142.98.如权利要求91所述的应用，其中所述其他肿瘤包括脂肪瘤、乳腺癌、脑瘤、鳞癌、皮肤癌、甲状腺癌、唇癌、黑色素癌、舌癌、垂体瘤、错构瘤、粉瘤、胶质瘤、汗管瘤、间质瘤、颅肿瘤、肉瘤、软骨瘤、头颈癌、纤维癌、眼癌、胸腔癌、牙龈癌、基底细胞腺癌、浸润性导管癌、外耳道胆脂瘤、皮脂腺癌、听神经瘤、嗜铬细胞瘤、纵膈肿瘤等。
143.有益效果
144.本发明首次确定了c10orf71基因突变为与肿瘤对新辅助化疗响应的关键分子特征，基于本发明的技术方案，新辅助化学疗法在改善预后以及在治疗开始之前确定响应性患者方面具有优势，因此可以制定更好的治疗方案。本发明的方案针对个别gc患者优化治疗策略的重要一步。
附图说明
145.图1：样品收集和治疗效果评估：(a)样品收集和多组学数据生成。研究包括35例在手术前接受新辅助化疗的gc患者。收集了治疗前的活检样本和治疗后的手术切除的肿瘤样本。根据严格评估的放射学和病理学证据，将患者分为响应组(n＝17)和非响应组(n＝18)。通过全外显子组测序(wes)、全基因组测序(wgs)和rna测序(rnaseq)获得了治疗前样品和非响应-治疗后样品的多组学数据。(b)来自响应性和非响应性患者的代表性放射学和病理学图像。箭头指示病变部位。(c)响应和非响应组中的坏死率分布。(d)响应和非响应组中的mandard肿瘤消退评分。
146.图2.治疗前gc样品中的突变特征：(a)在不同核苷酸背景下六种可能取代类型的贡献。无应答组和应答组之间的cosmic突变特征17的相对权重(b)和微卫星不稳定性(msi)得分(c)。p值基于wilcoxon rank-sum检验。(d)两组之间的肿瘤突变负担分布。p值基于单尾t检验。(b)-(d)方框的中线是中位数，方框的底部和顶部是第一和第三四分位数，并且whiskers分别延伸到下部和上部四分位数的1.5
×
四分位范围。
147.图3.治疗前gc样品中的显著突变的基因：(a)在治疗前的肿瘤样本中通过music2(fdr＜0.05)鉴定出的选定显著突变基因(smgs)。顶部和右侧的条分别显示了在每个患者观察到的突变率和所选基因中突变的组成。基因按其突变频率排序，不同类型的突变以不同的灰度颜色标记。(b)c10orf71在非响应样品中显示出显著的突变偏倚(p＜0.045)。gene cartoon中显示了突变位点。(c)c10orf71突变与胃细胞系对顺铂的耐药性相关，t检验，p＝1.1x10-4
。(d)基于反相蛋白质阵列中的8种蛋白质标记的细胞周期功能蛋白质组学分析。(e)c10orf71突变与胃细胞系中较低的细胞周期得分相关，t检验，p＝0.015。(f)一种拟议
的机制模型，其中c10orf71突变通过引起较不活跃的细胞周期状态赋予对新辅助化疗的耐药性。
148.图4.治疗前gc样品中显著的体细胞拷贝数变化及其下游信号传导效应：(a)针对响应与无响应组绘制的体细胞拷贝数变化的扩增信号。在响应组中，两个癌基因myc和ccne分别位于8q24.21和19q21的唯一峰中，而tp53负调节剂mdm2在响应组中的12q15的唯一峰中。无反应和反应组中的myc(b)和mdm2(d)mrna表达水平。p值基于单尾wilcoxon rank-sum检验。方框中的中线是中位数，方框的底部和顶部是第一和第三四分位数，并且whiskers分别延伸到下部和上部四分位数的1.5
×
四分位范围。相对于无反应组，反应组中上调基因中myc靶基因(c)和dna修复途径(e)的富集。fdr基于基因集富集分析。
149.图5.新辅助化疗后的突变进化：(a)新辅助化疗前后的癌症基因突变图谱。(b)在治疗之后，顶部子网富含突变变化。圆圈的大小表示网络中发生突变的样本数量。(c)在四名患者的治疗前后c10orf71编码区的突变等位基因频率。p值基于成对的t-检验。不同患者的突变以不同灰度颜色显示。(d-e)两名患者中获得的c10orf71突变的假定进化的示意图。
150.图6.新辅助化疗后基因表达和肿瘤浸润免疫细胞的变化：(a)火山图显示了匹配的治疗前和治疗后样品之间差异表达的基因。重要的基因显示为深色(fc＞2，fdr＜0.05)。(b)新辅助化疗后显着下调的途径。在倍数变化＞2、fdr＜0.05时鉴定出显着差异表达的基因。条形颜色表示该途径中差异表达基因的数量。(c)热图，显示了由myc扩增的肿瘤中的治疗驱动的myc靶基因的mrna表达倍数变化(治疗后/治疗前)。具有显着差异表达的基因(配对t检验，p＜0.05)以浅色(下调)和深色(上调)标记。(d)在治疗前和治疗后样品中gc治疗靶标的差异表达。基于配对的wilcoxon rank-sum计算p值。(e)在治疗前和治疗后样品中的中性粒细胞和树突状细胞的分数。基于配对t检验计算p值。(d)和(e)方框的中线是中位数，方框的底部和顶部是第一和第三四分位数，并且whiskers分别延伸到下部和上部四分位数的1.5
×
四分位范围。
具体实施方式
151.在下文中更详细地描述了本发明以有助于对本发明的理解。
152.定义：
153.肿瘤(tumor)是指机体在各种致瘤因子作用下，局部组织细胞增生所形成的新生物。根据肿瘤的细胞特性和对机体的危害程度，肿瘤包括良性肿瘤和恶性肿瘤。
154.根据肿瘤的组织发生来源，肿瘤包括上皮组织肿瘤、间叶组织肿瘤、淋巴造血组织肿瘤、神经组织肿瘤、皮肤和生殖系统肿瘤等。
155.所述上皮组织肿瘤包括但不限于乳头状瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺瘤或腺癌、囊腺瘤或囊腺癌、多形性腺瘤、乳头状瘤、移行上皮癌等。
156.其中，乳头状瘤见于皮肤、鼻、鼻窦、喉等处；鳞癌见于宫颈、皮肤、食管、鼻咽、肺、喉、阴茎等处；基底细胞癌见于头面部皮肤；腺瘤见于皮肤、甲状腺、胃、肠；腺癌见于胃、肠、乳腺、甲状腺等；囊腺瘤或囊腺癌见于卵巢；多形性腺瘤见于涎腺；乳头状瘤和移行上皮癌见于膀胱、肾盂。
157.所述间叶组织肿瘤包括但不限于纤维瘤、纤维肉瘤、良性或恶性纤维组织细胞瘤、脂肪瘤、脂肪肉瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌瘤、横纹肌肉瘤、血管瘤、淋巴管瘤、血管
肉瘤、淋巴管肉瘤、骨瘤、骨肉瘤、巨细胞瘤、恶性巨细胞瘤、软骨瘤、软骨肉瘤、滑膜瘤、滑膜肉瘤、间皮瘤、恶性间皮瘤。
158.其中，纤维瘤、纤维肉瘤、良性或恶性纤维组织细胞瘤多见于四肢；脂肪瘤多见于皮下组织，脂肪肉瘤多见于下肢和腹膜后；平滑肌瘤和平滑肌肉瘤见于子宫和胃肠；横纹肌瘤和横纹肌肉瘤多见于头颈、生殖泌尿道及四肢；血管瘤、血管肉瘤、淋巴肉瘤、淋巴管肉瘤多见于皮肤、皮下组织、舌、唇等；骨瘤、骨肉瘤、巨细胞瘤多见于骨组织；软骨瘤多见于手足短骨，软骨肉瘤多见于盆骨、肋骨、股骨、肱骨、及肩胛骨等；滑膜瘤多见于关节附近；间皮瘤多见于胸膜、腹膜等。
159.所述造血淋巴组织肿瘤包括但不限于恶性淋巴瘤、各种白血病、多发性骨髓瘤。
160.所述神经组织肿瘤包括但不限于神经纤维瘤、神经纤维肉瘤、神经鞘瘤、恶性神经鞘瘤、胶质细胞瘤、恶性胶质细胞瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、恶性脑膜瘤、节细胞神经瘤、神经母细胞瘤等。
161.所述皮肤和生殖系统肿瘤包括但不限于发生于皮肤和粘膜的黑色素瘤，发生于子宫的葡萄胎、绒毛膜上皮癌、恶性葡萄胎，发生于卵巢、睾丸、纵膈、骶尾的支持细胞和间质细胞瘤、恶性支持细胞和间质细胞瘤、颗粒细胞瘤、恶性颗粒细胞瘤、精原细胞瘤、无性细胞瘤、胚胎性癌、畸胎瘤、恶性畸胎瘤等。
162.根据肿瘤与发生的部位可以分为呼吸系统肿瘤、消化系统肿瘤、泌尿系统肿瘤、循环系统肿瘤、运动系统肿瘤、生殖系统肿瘤、其他肿瘤等。
163.所述呼吸系统肿瘤包括但不限于肺癌、鼻咽癌、喉癌、腺癌等；
164.所述消化系统肿瘤包括但不限于胃癌、肝癌、食道癌、肠癌、胰腺癌、胆囊癌、腹膜癌、肛门癌、壶腹周围癌、口腔癌、盲肠癌、腮腺癌、印戒细胞癌、胰岛素癌等；
165.所述泌尿系统肿瘤包括但不限于肾癌、膀胱癌、前列腺癌、尿道癌、透明细胞癌；
166.所述循环系统肿瘤包括急性或慢性白血病、淋巴癌、血管瘤、动脉瘤、血管母细胞瘤等；
167.所述运动系统肿瘤包括骨癌、腱鞘癌、平滑肌瘤、神经鞘瘤等；
168.所述生殖系统肿瘤包括宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、畸胎瘤、绒毛膜癌、输卵管癌、阴道癌、阴茎癌等；
169.所述其他肿瘤包括脂肪瘤、乳腺癌、脑瘤、鳞癌、皮肤癌、甲状腺癌、唇癌、黑色素癌、舌癌、垂体瘤、错构瘤、粉瘤、胶质瘤、汗管瘤、间质瘤、颅肿瘤、肉瘤、软骨瘤、头颈癌、纤维癌、眼癌、胸腔癌、牙龈癌、基底细胞腺癌、浸润性导管癌、外耳道胆脂瘤、皮脂腺癌、听神经瘤、嗜铬细胞瘤、纵膈肿瘤等。
170.突变(mutation)是指生物体、病毒或染色体外dna基因组核苷酸序列的改变。天然情况下，突变是有dna复制(特别是减数分裂)出错或dna损伤(如暴露与辐射或致癌物引起)后错误的修复造成的。
171.小规模的突变影响基因中一个或几个核苷酸，其中仅影响一个核苷酸点突变称为点突变。小规模突变包括：插入、缺失、取代、替换等。
172.插入是将一个或多个额外的核苷酸添加到dna中。
173.缺失是从dna中去除一个或多个核苷酸。
174.替换通常由化学物质或dna复制失常引起的将基因中单个核苷酸替换为另一个核
苷酸。
175.点突变是基因内单个碱基对的突变，在基因的蛋白质编码区发生的点突变可分为同义突变、非同义突变(错义突变)。
176.大规模的突变涉及到染色体结构的突变，包括：扩增、缺失、重排等。
177.扩增导致染色体各区域内拷贝数增加、从而增加染色体中基因的数量。
178.缺失是大片段染色体缺失，导致该区域内基因的丢失。
179.重排包括染色体易位(部分遗传物质与非同源染色体发生交换)、染色体倒位(染色体片段方向颠倒)、非同源交叉、间质缺失(从单个染色体中去除一段dna引起染色体内缺失)、杂合性缺失(在具有两个不同等位基因的生物中，通过缺失或重组丢失了一个等位基因)等。
180.抗体(antibody)是指机体由于抗原的刺激而产生的具有保护作用的蛋白质，是由浆细胞分泌、被免疫系统用来识别与中和异源物质的大型蛋白质。抗体的本质是一类能与抗原特异性结合的免疫球蛋白，抗体一般包括igg、igm、iga、igd和ige五种，在禽类的卵黄中还有igy。
181.广义的抗体不仅包括天然抗体，还包括人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体、单价抗体、fab、f(ab)2、重链抗体、单域抗体等各种形式的抗体衍生物。
182.适体(aptamer)是用配体指数富集法系统演化(selex)技术从人工体外合成的随机寡核苷酸序列库中反复筛选得到的能以极高的亲和力和特异性与靶分子结合的一段寡核苷酸序列。适体可以是dna、rna、pna等，可以是单链也可以是双链。适体与靶分子的结合和抗原-抗体作用相似，适体具有靶分子范围广、与配体亲和力高、特异性强、高度稳定、制备简单等优点。
183.引物(primer)是在核苷酸聚合作用起始时，刺激合成的一种具有特定核苷酸序列的大分子，与反应物以共价键形式连接。引物通常是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与靶区域一端的一条dna模板链互补，另一个引物与靶区域另一端的另一条dna模板链互补，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由3’端开始合成新的核酸链。体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链反应、测序、探针合成等。
184.探针(probe)是能与靶核苷酸序列互补结合的一段单链核酸分子。通常根据探针的来源可分为特异性dna探针、特异性rna探针、人工合成寡核苷酸探针。
185.实施例：c10orf71相关分子对gc肿瘤患者化疗响应性的验证
186.患者招募和样本队列
187.本项发明研究的gc患者(＞t2n+m0，uicc-ajcc第8版)于2015年至2018年在北京大学肿瘤医院(中国北京)招募。该研究根据赫尔辛基的声明进行，并得到了北京大学癌症医院伦理委员会的批准(irb批准号，2019kt05)。所有患者在治疗、样本收集和分析之前均提供了书面知情同意书。在新辅助治疗之前，通过活检收集了肿瘤并匹配了相邻的非肿瘤组织。对于没有可用的相邻非肿瘤组织的患者，取血样代替。然后，所有患者均接受以氟尿嘧啶为基础的卡培他滨/s-1+奥沙利铂治疗方案(xelox[奥沙利铂，130mg/m2，静脉注射，第1天；卡培他滨，1000mg/m2，口服，第1至14天]或sox[奥沙利铂130mg/m2，第1天静脉滴注；s-1，40-60mg，每天2次，口服，第1至14天2-4个循环，并在手术前评估对治疗的响应。根据mandard trg评分评估病理学特征，该评分由三位独立的盲测病理学家(李忠武、刘以强和
fold change and dispersion for rna-seq data with deseq2.genome biol 15，550(2014))。选择fdr＜0.05且倍数变化＞2.0或＜0.5的基因作为差异表达基因。对由后处理样品中上调和下调的基因分别进行了由clusterprofiler(g.yu，l.g.wang，y.han，q.y.he，clusterprofiler：an r package for comparingbiological themes among gene clusters.omics 16，284-287(2012))实现的msigdb标志性基因集的超表达分析(e.i.boyle et al.，go：：termfinder
--
open source software for accessing gene ontologyinformation and finding significantly enriched gene ontology terms associated with a list of genes.bioinformatics 20，3710-3715(2004))。进一步使用student’s t-test比较了myc扩增的非响应者治疗前后myc目标基因的差异基因表达。使用timer从mrna表达数据推断出肿瘤浸润免疫细胞的丰度(b.li et al.，comprehensive analyses of tumor immunity：implications for cancer immunotherapy.genome biology 17，174(2016))。进行了成对的student’s t-test，以识别匹配的治疗前和治疗后样本之间细胞组成的差异。
[0203]
对35名新辅助化疗前的gc患者的活检肿瘤样品进行了多组学测序(图1a显示了详细的患者和样品信息)。对于这些情况，对肿瘤样本以及匹配的种系dna样本进行了全外显子组测序，这主要用于鉴定体细胞碱基取代和小的插入/缺失。在35例病例中的32例(由于dna量不足而排除了3例)中，还进行了全基因组测序，以及匹配的种系样品，用于鉴定体细胞拷贝数变化(scna)。此外，对所有肿瘤样品进行了rna测序，以表征蛋白质编码基因的mrna表达谱。活检后，患者接受了基于5-氟尿嘧啶+奥沙利铂的新辅助化疗，持续了2-4个周期。然后，根据三位独立病理学家对放射学和病理学证据的严格评估，将病例分为两类：响应(n＝17)和非响应(n＝18)。图1b显示了代表性的放射学和病理学图像。在响应组中，所有病例的坏死率均高于65％，而在非响应组中，坏死率均低于15％(图1c)。响应组病例的mandard肿瘤消退等级为＜2，而非响应组的情况为4或5(图1d)。通常，响应组的患者比非响应组的患者年轻(wilcoxon rank-sum检验，非响应与非响应＝17∶18，p＝0.047)；非响应组的患者倾向于晚期(wilcoxon rank-sum检验，非响应与非响应＝17∶18，p＝0.023)。
[0204]
在非响应组的18例患者中接受新辅助化疗后，通过手术从其中的14例中获得了新鲜肿瘤样品，并对这些治疗后样品进行了全外显子组测序(图1a)。对于这些情况，还分别进行了全基因组测序(针对13例)和rna测序。相反，对于响应组的患者，由于对新辅助化学疗法的良好响应导致肿瘤细胞含量低的病变，因此无法获得肿瘤组织。总之，该实验设计使能够从不同的角度(响应与非响应，治疗前与治疗后)鉴定涉及肿瘤对新辅助化疗响应的多种分子畸变(molecular aberrations)(体碱基置换scna和基因表达)。
[0205]
检查了六个可能的碱基对取代的组成，发现t＞g取代在响应和非响应组之间表现出最明显的模式，尤其是当取代位点位于c和t的侧翼时(图2a)。一致地，在将突变谱分解成不同的突变特征时，cosmic特征17(t＞g)(11.l.b.alexandrov et al.，clock-like mutational processes in human somatic cells.nat genet 47，1402-1407(2015).)是先前在食道和胃癌中观察到的特征，并与氧化损伤的副产物有关(12.m.tomkova，j.tomek，s.kriaucionis，b.schuster-bockler，mutational signature distribution varies with dna replication timing and strand asymmetry.genome biol 19，129(2018).)。响应组的贡献要比非响应组高得多(wilcoxon rank-sum检验，p＝0.049，响应vs非响应＝
17∶18，图2b)。接下来，检查了mantis计算出的这些肿瘤中微卫星不稳定性(msi)分数的分布(13.e.a.kautto et al.，performance evaluation for rapid detection of pan-cancer microsatellite instability with mantis.oncotarget 8，7452-7463(2017).)。出人意料的是，发现非响应组中的msi得分显著高于响应组(wilcoxon rank-sum检验，p＝0.022，非响应vs.非响应＝17∶18，图2c)。因此，测试了非响应组中是否存在更高的突变负担，并证实了这种模式(student’s t检验，非响应vs非响应＝17∶18，p＝0.04，图2d和图3a)。临床前数据表明，msi-h状态的大肠肿瘤对基于5-氟尿嘧啶的化学疗法具有抗性(m.hewish，c.j.lord，s.a.martin，d.cunningham，a.ashworth，mismatch repair deficient colorectal cancer in the era of personalized treatment.nat rev clin oncol 7，(2010)；m.koopman et al.，predictive and prognostic markers for the outcome of chemotherapy in advanced colorectal cancer，a retrospective analysis of the phase iii randomised cairo study.eur j cancer 45，1999-2006(2009).)。临床上，只有msi阴性结直肠癌患者受益，而msi-h则不受益(16.c.m.ribic et al.，tumor microsatellite-instability status as a predictor of benefit from fluorouracil-based adjuvant chemotherapy for colon cancer.n engl j med 349，247-257(2003))，这使得msi-h状态成为对基于5氟尿嘧啶的化疗非响应的强有力的预测因素(g.des guetz et al.，does microsatellite instability predict the efficacy of adjuvant chemotherapy in colorectal cancer？a systematic review with meta-analysis.eur j cancer 45，1890-1896(2009))。该结果提供了第一个证据，即msi-h状态也可以作为gc患者新辅助化疗非响应的预测指标。
[0206]
为了鉴定可能在影响治疗响应中起作用的单个突变基因，接下来使用music2(18.n.d.dees et al.，music：identifying mutational significance in cancer genomes.genome res 22，1589-1598(2012).)鉴定了明显突变的基因(smg)(p＝2.9*10-4
，fdr＝0.05)。突变最高的基因包括tp53、p13kca、rnf43、arida1和kras，如先前在其他胃癌队列中报道的(19.n.cancer genome atlas research，comprehensive molecular characterization of gastric adenocarcinoma.nature 513，202-209(2014))(图3a)。在本研究和以前的研究中鉴定出的smg中(19.n.cancer genome atlas research.comprehensive molecular characterization of gastric adenocarcinoma.nature 513，202-209(2014))，c10orf71是唯一显示响应和非响应组之间明显模式的基因：在5个非响应样本中均发生了突变，但没有响应样本中发生了突变(fisher精确检验，p＝0.04，fdr＜0.25)，并且未检测到复发突变(图3b)。为了验证这一观察结果，基于使用一组21个胃癌细胞的药物响应数据(20个)，确实观察到，具有c10orf71突变的细胞系对顺铂(新辅助化疗方案中包括的等效铂药物)的耐药性高于这些野生型细胞系(student’s t检验，n
mut vs.n
wt
＝3∶18，p＝1.1*10-4
，图3c)。为了获得更多的机理上的见解，使用反相蛋白阵列分析了胃细胞系的功能蛋白质组学数据。发现具有c10orf71突变的细胞系显示出的细胞周期得分(基于8种蛋白质标记)明显低于那些野生型细胞系(student
′
s t检验，n
mut vs.n
wt
＝3∶18，p＝0.015，图3d、e)。由于细胞周期停滞是铂类药物的主要作用机制，不愿受理论的约束，发明人推测其中c10orf71突变通过引起较不活跃的细胞周期状态而赋予了对新辅助化疗的耐药性(图3f)。这些结果表明，该基因中的突变是
对新辅助化疗耐药的潜在生物标记。
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新辅助化疗后主要的体细胞碱基置换变化
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使用14个匹配的治疗前和治疗后样品对(平均覆盖率＞200*)的平行全外显子组测序数据，检查了新辅助化疗下gc的基因组进化。总体而言，没有发现突变负担或突变特征的显著变化。对于已知的癌症驱动器，一些肿瘤在治疗前后显示出关键的突变变化(突变丢失或增加)，而其他肿瘤则显示出相同的突变特征(图5a)。为了系统地鉴定出表现出最频繁发生的突变变化的基因或途径，采用了hotnet2来搜索富含此类信号的蛋白质相互作用网络(29.m.d.leiserson et al.，pan-cancer network analysis identifies combinations of rare somatic mutations across pathways and protein complexes.nat genet 47，106-114(2015))。确定的一个顶级子网由irs1、irs2、pik3ca、jak1和il6st组成(图5b)。特别是，irs1在将胰岛素和胰岛素样生长因子-1(igf-1)受体的信号传递至pi3k/akt途径中发挥了关键作用，它在五个治疗后样品中不断获得新的突变(fisher的精确检验，p＝0.041)，表明存在复发耐药机制。对响应性与非响应性治疗前样品的分析表明，c10orf71中的突变有助于提高治疗抵抗力。如果是这样，将期望在治疗后的样本中增加等位基因突变的频率或获得新的突变，因为对化疗敏感的肿瘤细胞(即那些没有这种突变的肿瘤细胞)很可能会在治疗过程中通过选择去除。在接受调查的14对样本中，有4例在治疗前或治疗后样本中显示c10orf71突变，其中两个在新辅助化疗后获得了新的突变。在检测到的五个突变位点上，确实观察到与治疗前样品相比突变等位基因频率显著增加(图5c，student’s t检验，n＝8对，p＜0.05；即使在调整了肿瘤纯度后，同样的模式仍然成立)。图5d和5e显示了两种情况的推定进化的示意图，其中获得的c10orf71突变逐渐增加其等位基因频率。尽管真正的进化轨迹很难验证，但这一结果表明c10orf71突变在影响肿瘤响应中具有关键作用。
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以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。