本发明属于羧酸β-石竹烯-5-酯的制备技术领域，具体涉及吡啶甲酸β-石竹烯-5-酯类化合物及其制备方法和应用。
背景技术：
随着人们生活品质的改善，人们对健康要求也越来越高，且随着合成药物副作用导致的一系列的问题，使得人们将目光转向天然产物类的化合物。而β-石竹烯作为一种广泛存在于植物中的一种倍半萜类化合物而受到关注。β-石竹烯(isocarophyllene)又名β-丁香油，是一种双环倍半萜类化合物，广泛存在于枫香树脂，柠檬，丁香叶油，黑加仑等天然植物中。其药理方面具有局部麻醉、抗菌抗炎(kim，y.s.，etal.journaloffoodscience，2008.73(7)，c540-c545.doi：10.1111/j.1750-3841.2008.00879.x)、骨保护等多种活性(oh，m.-s.，etal.pestmanagementscience，2013.70(5)，757-762.doi：10.1002/ps.3608)。
就目前的研究而言，对β-石竹烯的研究多集中在β-石竹烯的本身的药理上。2016年，fidyt，k.报道了β-石竹烯及其氧化物具有抗癌镇痛的作用(fidyt，k.，etal.cancermedicine，2016.5(10)，3007-3017.doi：10.1002/cam4.816)。同年basha，r.h.则报道了β-石竹烯能够有效的减轻实验性糖尿病大鼠高血糖介导的氧化应激和炎症应激(basha，r.h.chemico-biologicalinteractions，2016.245，50-58.doi：10.1016/j.cbi.2015.12.019)。在2019年，韩国研究者shim，h研究发现β-石竹烯能够有效的抑制幽门螺杆菌的感染，从而改善消化不良的症状(shim，h.etal.thekoreanjoumalofgastroenterology，2019.74(4)，199.doi：10.4166/kjg.2019.74.4.199)。虽然对β-石竹烯的研究较多但是对β-石竹烯进行改性的研究较少，β-石竹烯结构修饰主要集中在对β-石竹的环上双键的环氧化，通过环氧化在β-石竹烯上引入活性氧从而提高其抗炎抑菌及镇痛等方面的效果(park，k.-r.，etal.cancerletters，312(2)，178-188.doi：10.1016/j.canlet.2011.08.001)。但是通过化学手段在β-石竹烯上引入吡啶环的还未有报道。对β-石竹烯醇羧酸酯的报道仅在2014年，chicca，a通过利用苯甲酰氯合成了一个带有苯环的β-石竹烯醇羧酸酯，并对其进行了环氧化酶抑制作用研究，发现其并不能够有效地抑制环氧化酶的产生(chicca，a.，etal.acschemicalbiology，2014.9(7)，1499-1507.doi：10.1021/cb500177c)。这种合成方法需要用吡啶作为溶剂毒性较大，且酰氯在环境中不稳定。
技术实现要素：
本发明要解决的一个技术问题是提供吡啶甲酸β-石竹烯-5-酯类化合物，是一类新的化合物，且对炎症及多种肿瘤细胞有抑制活性。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种吡啶甲酸β-石竹烯-5-酯类化合物的制备方法，制备方法简单，产物得率高。本发明要解决的技术问题还有一个是提供一种吡啶甲酸β-石竹烯-5-酯类化合物的应用，该化合物对炎症及多种癌症细胞均有较好的抑制活性，可以应用于抗炎、抗癌症药物的制备中。
技术方案：为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
吡啶甲酸β-石竹烯-5-酯类化合物，结构式如式i所示：
其中，r基团为：
上述吡啶甲酸β-石竹烯-5-酯类化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将吡啶甲酸和dcc溶解于ch2cl2中，0～5℃反应20～30min；所述dcc与吡啶甲酸的摩尔比为1∶1～1∶2，dcc的浓度为0.15～0.20mol/l；
(2)将dmap溶解于ch2cl2中得到dmap溶液，将dmap溶液和β-石竹烯醇加入步骤(1)的溶液中，25～35℃反应4～5h；所述dmap与β-石竹烯醇的摩尔比为1∶15～1∶20，dmap的浓度为0.02～0.08mol/l；所述吡啶甲酸与β-石竹烯醇的摩尔比为1～3∶1；
(3)反应节结束后洗涤反应液，干燥，除溶剂，经硅胶柱洗脱，得到吡啶甲酸β-石竹烯-5-酯类化合物。
所述吡啶甲酸β-石竹烯-5-酯类化合物的制备方法，所述β-石竹烯醇的制备包括以下步骤：
(a)将儿萘酚硼烷溶解于四氢呋喃中得到儿萘酚硼烷溶液，然后加入β-石竹烯，70～90℃回流反应17～19h；所述儿萘酚硼烷与β-石竹烯的摩尔比为1～2∶1，所述儿萘酚硼烷溶液的浓度为1～2mol/l；
(b)反应结束后采用ch2cl2稀释冷却，依次加入koh溶液和30％h2o2，反应20～40min；所述koh与β-石竹烯的摩尔比为6.5～7.0∶1，所述koh溶液的浓度为3～4mol/l；所述koh溶液与30％h2o2的体积比为1∶1～1∶2；
(c)反应结束后用饱和nacl洗涤3次，干燥，除溶剂，得到暗黄色油状液体，利用100～200目硅胶柱层析法洗脱，流动相石油醚∶乙酸乙酯＝1∶7，得到淡黄色油状液体β-石竹烯醇。
所述吡啶甲酸β-石竹烯-5-酯类化合物的制备方法，所述吡啶甲酸为吡啶-2-甲酸、吡啶-3-甲酸或吡啶-4-甲酸。
所述吡啶甲酸β-石竹烯-5-酯类化合物的制备方法，所述步骤(1)，0℃反应30min；步骤(2)，25℃反应5h。
所述吡啶甲酸β-石竹烯-5-酯类化合物的制备方法，所述吡啶甲酸与β-石竹烯醇的摩尔比为1∶1。
所述吡啶甲酸β-石竹烯-5-酯类化合物的制备方法，所述dcc与吡啶甲酸的摩尔比为1∶1，dcc的浓度为0.18mol/l；所述dmap与β-石竹烯醇的摩尔比为1∶18，dmap的浓度为0.05mol/l。
上述吡啶甲酸β-石竹烯-5-酯类化合物在制备抗炎症药物中的应用。
上述吡啶甲酸β-石竹烯-5-酯类化合物在制备抗癌症药物中的应用。
所述吡啶甲酸β-石竹烯-5-酯类化合物在制备抗癌症药物中的应用，所述癌症为宫颈癌、肝癌、乳腺癌或肺癌。
有益效果：与现有的技术相比，本发明的优点包括：
(1)本发明吡啶甲酸β-石竹烯-5-酯类化合物的制备方法反应步骤简单，反应条件温和。
(2)本发明制备的吡啶甲酸β-石竹烯-5-酯类化合物能够有效的抑制炎症细胞的no的产生，且对细胞的损伤较小，在制备抗炎药物中有着很好的应用前景。
(3)本发明制备的吡啶甲酸β-石竹烯-5-酯类化合物对宫颈癌、肝癌、乳腺癌和肺癌细胞均有很好的抑制活性，在制备抗癌症药物中有着很好的应用前景。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
实施例1
β-石竹烯醇c1(6，10，10-trimethyl-2-methylenebicyclo[7.2.0]undecan-5-ol)的合成方法：
向6.6ml的1m儿萘酚硼烷的四氢呋喃溶液中，加入β-石竹烯4.4mmol，在80℃回流反应18h，用40mlch2cl2稀释冷却，依次加入20ml3m的koh和20ml30％h2o2，反应30min，用饱和nacl洗涤3次，干燥，除溶剂，得到暗黄色油状液体，利用100～200目硅胶柱洗脱，流动相石油醚∶乙酸乙酯＝1∶7，得到淡黄色油状液体c1。反应方程式如下所示：
c11hnmr(600m，dmso-d6)δ：4.83(d，2h，＝ch2，j＝6hz)，4.22(d，1h，-oh，j＝6hz)，3.32(s，1h，-ch)，2.46-2.42(m，1h，-ch)，2.22-2.12(m，2h，-ch2)，1.92-1.86(m，1h，-ch)，1.74-1.71(m，2h，-ch2)，1.70(t，1h，j＝6hz，-ch)，1.58-1.53(m，1h，-ch)，1.51-1.48(m，2h，-ch2)，1.44-1.39(m，2h，-ch2)，0.38(s，3h，-ch3)，0.97(s，3h，-ch3)，0.96-0.95(m，1h，-ch)，0.83(d，3h，-ch3，j＝6hz)；13cnmr(dmso-d6，150mhz)：153.05，108.59，56.83，55.20，42.02，36.75，35.64，33.87，32.6，30.78，30.25，26.84，21.87；ir，υ(cm-1)：3372(-oh)，3076(c＝ch2)997(c-o)；elementalanal.calcdforc15h26o：c81.02；h11.79；o7.19；found：c81.14；h11.82；o7.21.hrms(esi+)：m/z[c15h26o+h]+223.2056测试值223.2064。
吡啶-2-甲酸β-石竹烯-5-酯c2(6，10，10-trimethyl-2-methylenebicyclo[7.2.0]undecan-5-ylpicolinate)合成方法：
将吡啶-2-甲酸0.9mmol和二环己基碳二亚胺(dcc，0.9mmol)溶解于5ml的ch2cl2中，0℃反应30min；加入c10.9mmol和溶解于1mlch2cl2的4-二甲氨基吡啶(dmap，0.05mmol)，常温反应5h，洗涤，干燥，除溶剂，经硅胶柱，得到黄色油状液体c2130mg。反应方程式如下所示：
c21hnmr(600m，cdcl3)δ：8.71(d，1h，-ch，j＝4.2)，8.01(d，1h，j＝7.8hz)，7.78-7.77(m，1h，-ch)，7.40-7.38(m，1h，-ch)，4.88-4.80(m，2h，＝ch2)，3.52-3.49(m，1h，-ch)，2.43-2.37(m，1h，-ch)，2.23-2.14(m，2h，-ch2)，1.81-1.78(m，1h，-ch)，1.73-1.68(m，2h，-ch2)，1.60-1.55(m，2h，-ch2)，1.55-1.52(m，2h，ch2)，1.473-1.45(m，1h，-ch)，0.97(d，3h，ch3，j＝3.6hz)，0.94(s，3h，-ch3)，0.916(s，1h，-ch)，0.90-0.87(m，3h，ch3)；13cnmr(cdcl3，150mhz)δppm：164.51，152.67，150.01，136.86，126.57，124，89，108.60，56.58，56.50，42.10，36.78，35.4135.14，33.92，33.83，31.93，29.99，26.80，21.48，21.43.ir，υ(cm-1)：3076(c＝ch2)，1714(c＝o)，1460(c＝n，c-c)，303(c-o)，1134(c-o-c)；elementalanal.calcdforc21h29no2：c77.02；h8.93；n4.28；o9.77；found：c77.13；h9.02；n4.37；o9.84.hrms(esi+)：m/z[c21h29no2+h+]+328.2271，[c21h29no2+na+]350.2091测试值328.2280，350.2099.
实施例2
3-吡啶甲酸β-石竹烯-5-酯c3(6，10，10-trimethyl-2-methylenebicyclo[7.2.0]undecan-5-ylnicotinate)的合成方法：
将吡啶-3-甲酸0.9mmol和dcc0.9mmol溶解于5ml的ch2cl2中，0℃反应30min；加入实施例1制备得到的c10.9mmol和溶解于1mlch2cl2的dmap0.05mmol常温反应5h，洗涤，干燥，除溶剂。经硅胶柱，得到黄色油状液体140mg。反应方程式如下所示：
c31hnmr(600m，cdcl3)δ：9.23(d，1h，ch，j＝1.2hz)，8.77-8.76(m，1h，ch)，8.30-8.28(m，1h，ch)，7.40-7.38(m，1h，ch)，4.93-4.84(m，2h，＝ch2)，2.35-2.33(m，1h，ch)，2.25-2.18(m，1h，ch)，2.09-2.05(m，1h，ch)，1.93-1.87(m，1h，ch)，1.81-1.77(m，2h，ch2)，1.76-1.73(m，2h，ch2)1.53-1.50(m，1h，ch)，1.25(s，1h，ch)，1.03(d，3h，ch3，j＝1.2hz)，0.99(s，3h，ch3)，0.97(t，1h，ch，j＝0.6hz)，0.932-0.913(m，3h，ch3)；13cnmr(cdcl3，150mhz)δppm：164.73，153.04，151.98150.70，137.18，126.85，123.36，109.39，56.52，42.19，36.82，35.03，33.94，31.45，29.99，28.58，26.81，21.45.ir，υ(cm-1)：3076(c＝ch2)，1718(c＝o)，1460(c＝n，c-c)，1134(c-o-c)；elementalanal.calcdforc21h29no2：c77.02；h8.93；n4.28；o9.77；found：c77.15；h9.06；n4.32；o9.86.hrms(esi+)：m/z[c21h29no2+h+]+328.2271，[c21h29no2+na+]350.20916，[c21h29no2+k+]366.1830测试值328.2279，350.2099，366.2047.
实施例3
4-吡啶甲酸β-石竹烯-5-酯c4(6，10，10-trimethyl-2-methylenebicyclo[7.2.0]undecan-5-ylisonicotinate)的合成方法：
将吡啶-4-甲酸0.9mmol和dcc0.9mmol溶解于5ml的ch2cl2中，0℃反应30min。加入实施例1制备得到的c10.9mmol和溶解于1mlch2cl2的dmap0.05mmol常温反应5h，洗涤，干燥，除溶剂。经硅胶柱，得到黄色油状液体136mg。反应方程式如下所示：
c41hnmr(600m，cdcl3)δ：8.76(d，2h，ch，j＝5.4hz)，7.84(d，2h，ch，j＝6hz)，4.928-4.843(m，2h，＝ch2)，2.46-2.42(m，1h，ch)，2.34-2.32(m，1h，ch)，2.22-2.16(m，1h，ch)，2.07-2.00(m，1h，ch)，1.91-1.86(m，1h，ch)，1.81-1.75(m，2h，ch2)，1.73-1.75(m，1h，ch)，1.64-1.62(m，2h，ch2)，1.52-1.50(m，1h，ch)，1.24(s，1h，ch)，1.02(d，3h，ch3，j＝1.8hz，)，0.99(s，3h，ch3)，0.96(t，1h，j＝1.8hz，ch)，0.915(t，3h，ch3，j＝7.2hz).13cnmr(cdcl3，150mhz)δppm：164.62，152.71，151.92，150.51，138.17，122.89，109.47，108.61，56.60，42.12，36.79，35.03，33.85，31.97，31.42，29.99，28.53，26.82，21.46.ir，υ(cm-1)：3072(c＝ch2)，1724(c＝o)，1460(c＝n，c-c)，1124(c-o-c)；elementalanal.calcdforc21h29no2：c77.02；h8.93；n4.28；o9.77；found：c77.12；h8.99；n4.22；o9.76.hrms(esi+)：m/z[c21h29no2+h+]+328.2271，[c21h29no2+k+]366.1830测试值328.2285，366.2052.
实施例4
一、化合物c2～c4的no抑制率实验：
(1)取对数生长周期的小鼠巨噬细胞raw264.7，以每孔3～4万接种在96孔板中，在37℃，5％的co2培养箱中孵育24h；孵育结束后移除培养基，用pbs洗涤3～4次；
(2)设置对照组、lps+地塞米松(dim)阳性药物组及化合物c2～c4(浓度为40,20，10，5，2.5μm)样品组；实验分组如下所示：
对照组：1、每孔加入50μl的2μg/ml的lps和50μl浓度分别为40、20、10、5、2.5μm的石竹烯c0；2、每孔加入50μl的2μg/ml的lps和50μl浓度分别为40、20、10、5、2.5μm的β-石竹烯醇c1；
lps+dim阳性药物组：每孔加入50μl的2μg/ml的lps和50μl浓度分别为40、20、10、5、2.5μm的dim；
化合物c2样品组：每孔加入50μl的2μg/ml的lps和50μl浓度为40、20、10、5、2.5μm的c2；
化合物c3样品组：每孔加入50μl的2μg/ml的lps和50μl浓度为40、20、10、5、2.5μm的c3；
化合物c4样品组：每孔加入50μl的2μg/ml的lps和50μl浓度为40、20、10、5、2.5μm的c4；
依次加入以上实验组的液体，继续在培养箱中孵育24h；
(3)离心取细胞培养上清液于96孔的霉标板中，依次加入elisa试剂盒的a和b，体积比为1∶1；避光反应3min，用霉标仪测试在540nm处的吸光度；no抑制率计算公式如下式(1)所示：
化合物c2～c4的no抑制率试验结果如表1所示。由表1可以看出经过改性后的化合物c1，c2，c3，c4对no的抑制上具有一个较好的效果。与未改性的c0(β-石竹烯)相比c2，c3，c4具有较好的抗炎活性。且c3，c4对no的抑制效果是阳性对照dim的1.2～1.3倍左右的提高。这就表明通过在β-石竹烯上引入吡啶杂环能够有效的提高c0的抗炎活性。
表1化合物c2～c4的no抑制率(％)实验结果
二、化合物c2～c4的对raw264.7的细胞毒性实验：
(1)取对数生长周期的raw264.7，以每孔3～4万接种在96孔板中，在37℃，5％的co2培养箱中孵育24h后，移除培养基，用pbs洗涤3～4次；
(2)设置对照组、lps+dim阳性药物组及化合物c2～c4样品组；实验分组如下所示：
对照组：1、每孔加入50μl的2μg/ml的lps和50μl浓度分别为40、20、10、5、2.5μm的石竹烯c0；2、每孔加入50μl的2μg/ml的lps和50μl浓度分别为40、20、10、5、2.5μm的β-石竹烯醇c1；
lps+dim阳性药物组：每孔加入50μl的2μg/ml的lps和50μl浓度分别为40、20、10、5、2.5μm的dim；
化合物c2样品组：每孔加入50μl的2μg/ml的lps和50μl浓度为40、20、10、5、2.5μm的c2；
化合物c3样品组：每孔加入50μl的2μg/ml的lps和50μl浓度为40、20、10、5、2.5μm的c3；
化合物c4样品组：每孔加入50μl的2μg/ml的lps和50μl浓度为40、20、10、5、2.5μm的c4；
继续在培养箱中孵育24h，移除上清液，加入1mg/ml的mtt染料，共孵育4h；
(3)孵育结束后移除培养液，加入200μldmso，37℃震板10min，用霉标仪检测595处的吸光度按照式(2)公式计算细胞存活率：
化合物c2～c4的细胞存活率实验结果如表2所示。由表2可知，通过对c0～c4以及阳性对照dim的细胞毒性测试发现，经过引入吡啶环的β-石竹烯(c2、c3、c4)能够有效的降低β-石竹烯的细胞毒性。且与阳性对照相比具有较好的细胞存活率。这就可以说明通过引入吡啶环能够有效的降低天然产物的细胞毒性，从而为β-石竹烯的成药提供了一定的数据支持。
表2化合物c2～c4细胞毒性实验结果(细胞存活率％)
三、mtt法测试化合物c2～c4抗癌活性：
(1)取对数生长周期的hela(宫颈癌细胞)、hepg2(肝癌细胞)、mcf-7(乳腺癌细胞)、a549(肺癌细胞)和huvec(人脐静脉血管内皮细胞)，以每孔1～2万接种在96孔板中，在37℃，5％的co2的培养箱中孵育24h；
(2)移除培养基，加入稀释好的对照组和实验组样品，孵育48h，移除培养基加入1mg/ml的mtt，孵育4h；其中，对照组采用dox(多西环素)，对照组和实验组样品的浓度为100，10，1，0.1，0.01μm；
(3)孵育结束后移除培养基，加入200μldmso，37℃震板10min，用霉标仪检测595处的吸光度按照式(3)公式计算细胞抑制率：
化合物c2～c4的抗肿瘤活性实验结果如表3所示。表3中通过对化合物c0～c4的抗肿瘤活性测试发现c1、c2、c3对mcf-7具有特征性的抑制效果，且对huvec的毒副作用较小。其ic50值都低于c0和阳性对照dox。这就表明通过引入吡啶环能够有效的提高β-石竹烯对癌细胞的杀死效果，且具有较高的安全系数。
表3化合物c2～c4对癌细胞的半抑制浓度ic50μm