一种同时降解玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素的贝莱斯芽孢杆菌及其应用的制作方法

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种同时降解玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素的贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)ansb01e及其应用。

背景技术：

霉菌毒素是由曲霉菌属(aspergillusspp.)、镰刀菌属(fusariumspp.)和青霉菌属(penicilliumspp.)等真菌在生长过程中产生的有毒的次级代谢产物。目前已经报道大约有300多种对人类和动物具有毒害作用的霉菌毒素，其中，黄曲霉毒素(aflatoxin)、玉米赤霉烯酮(zearalenone)、单端孢霉烯族类毒素(trichothecenes)、赭曲霉毒素(ochratoxin)及伏马毒素(fumonisins)等对畜牧业威胁最严重。传统的物理和化学消除方法存在效果不稳定、营养成分损失大、影响饲料适口性，且难以规模化生产等缺点而不能广泛应用到实际生产中。微生物及生物酶降解具有解毒效率高、特异性强、对饲料和环境没有污染等特点和优势，从而备受研究者的关注。近年来已有报道降解玉米赤霉烯酮的微生物菌株，也有一些降解黄曲霉毒素菌株的研究报道，这些报道大多数是单一或混合菌株降解一种毒素，关于单一菌株同时降解多种毒素的研究很少，目前还没有贝莱斯芽孢杆菌同时降解玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素的研究报道。本发明公开了一种能同时降解玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素的贝莱斯芽孢杆菌，为有效控制和消除霉菌毒素对粮食和饲料的污染，改善动物生产性能和保障人类食品安全有非常重要的意义。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是从大量的自然界样品中筛选同时降解玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素的有益菌，从而解决粮食、饲料和食品中霉菌毒素污染问题。

鉴于此，本发明提供一种同时降解玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素的贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)及其在霉菌毒素脱毒中的应用。

本发明的另一目的在于提供上述贝莱斯芽孢杆菌的应用。

本发明的另一目的在于提供一种含有上述贝莱斯芽孢杆菌的霉菌毒素生物降解剂。

本发明的另一目的在于提供上述含有贝莱斯芽孢杆菌的霉菌毒素生物降解剂的制备方法。

本发明的另一目的在于提供上述含有贝莱斯芽孢杆菌的霉菌毒素生物降解剂的应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明的贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)ansb01e，已于2019年03月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.17328。

所述同时降解玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素的贝莱斯芽孢杆菌ansb01e，是发明人经过复杂筛选工作从鸡肠道食靡中分离得到的。

本发明还提供了上述贝莱斯芽孢杆菌的应用，尤其在霉菌毒素脱毒方面的应用，其能够高效降解玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素等霉菌毒素。

本发明还提供一种霉菌毒素生物降解剂，包含上述贝莱斯芽孢杆菌以及生理上可接受的载体，所述生理上可接受的载体包括但不限于酵母细胞培养物、小麦麸、麦芽糖糊精、环糊精、稻米、米糠、蔗糖、淀粉、滑石粉、蒙脱石、植物提取物中的一种或多种。

上述霉菌毒素生物降解剂还包括微生态制剂，所述微生态制剂包括但不限于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、乳酸肠球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德式乳杆菌乳酸亚种、植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、产朊假丝酵母、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、嗜热链球菌、罗伊氏乳杆菌、动物双歧杆菌、米曲霉、迟缓芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、纤维二糖乳杆菌、发酵乳杆菌或德氏乳杆菌保加利亚亚种中的一种或多种，优选的，所述霉菌毒素生物降解剂在用于青贮饲料或牛饲料时，还含有产丙酸杆菌、布氏乳杆菌和副干酪乳杆菌中的至少一种；或者所述霉菌毒素生物降解剂在用于禽类、猪和水产养殖动物的饲料时，还含有凝结芽孢杆菌和/或侧孢短芽孢杆菌。

上述霉菌毒素生物降解剂还包括另外的酶，所述另外的酶包括但不限于脱氧瓜萎镰菌醇环氧化物水解酶、羧肽酶、黄曲霉毒素氧化酶、玉米赤霉烯酮内酯酶、伏马毒素羧基酯酶、伏马毒素氨基转移酶、漆酶、氨基多元醇胺氧化酶、黑曲霉天冬氨酸蛋白酶、弹性蛋白酶、氨基肽酶、胃蛋白酶、胃蛋白酶样蛋白酶、胰蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶、细菌蛋白酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、过氧化氢酶、纤维素酶、半纤维素酶、木质素降解酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、表异构酶、酯酶、半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、葡糖苷酶，葡糖醛酸酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、脂解酶、裂解酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶、氧化酶、氧化还原酶、醛酮还原酶、果胶酸裂解、果胶乙酰酯酶、果胶去聚合酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、过氧化物酶、锰过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、多聚半乳糖醛酸酶、乙醇脱氢酶、鼠李-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、转移酶、转运蛋白、转谷酰胺酶、环氧化物水解酶、己糖氧化酶、酸性磷酸酶及涉及淀粉代谢、纤维降解、脂质代谢的酶，涉及糖原代谢的蛋白质或酶中的一种或多种。

上述霉菌毒素生物降解剂中，所述微生态制剂/另外的酶的含量为0-20％。

上述霉菌毒素生物降解剂的制备方法，包括以下步骤：将贝莱斯芽孢杆菌ansb01e菌细胞以及生理上可接受的载体，配制成含有贝莱斯芽孢杆菌菌细胞的混合剂，进一步的，或者再与微生态制剂或另外的酶按一定比例混合，得到霉菌毒素生物降解剂；该霉菌毒素生物降解剂中贝莱斯芽孢杆菌ansb01e菌细胞含量为1-10％。

上述添加剂中，贝莱斯芽孢杆菌ansb01e菌细胞：生理上可接受的载体：微生态制剂/另外的酶的质量比例可以为：1∶79∶20或2∶78∶20或3∶77∶20或4∶76∶20或5∶75∶20或6∶74∶20或7∶73∶20或8∶72∶20或9∶71∶20或10∶70∶20。

本发明还提供上述霉菌毒素生物降解剂在霉菌毒素脱毒中的方法和应用。

上述降解霉菌毒素的方法和应用，其特征在于，将上述贝莱斯芽孢杆菌或上述霉菌毒素生物降解剂处理含有霉菌毒素的材料；所述材料包括但不限于食品、饲料及其原料、粮食及其加工副产物、粮油、牛奶、陈化粮、茶叶、水果、果汁或中草药中的一种或多种。

生物保藏说明

ansb01e，分类命名：贝莱斯芽孢杆菌，bacillusvelezensis，于2019年03月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.17328。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示本发明的菌株ansb01e电镜下细胞形态图；

图2示本发明的菌株ansb01e降解玉米赤霉烯酮液相色谱图；

图3示本发明的菌株ansb01e降解黄曲霉毒素b1液相色谱图；

图4示本发明的菌株ansb01e对zen霉变玉米中zen的降解效果。

具体实施方式

本发明公开了一种贝莱斯芽孢杆菌ansb01e及其在霉菌毒素脱毒中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1同时降解玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素菌株的筛选

收集土壤、霉变饲料、猪和鸡肠道食靡等29个样品用于筛选同时降解玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素的微生物。将1g样品溶于无菌的pbs缓冲液中，涂布在lb平板上，37℃培养24h。从每个平板上随机挑取20个单菌落，再在lb平板上划线纯化3次，获得纯化的菌株。将分离纯化的菌株在37℃，lb培养基中培养24h后，检测各菌株对zen和afb1的降解率。

反应条件为：990μl菌株发酵液与10μlzen(200μg/ml)，37℃孵育48h，以990μl无菌pbs与10μlzen(200μg/ml)为对照，反应结束后，加入等体积甲醇终止反应，用hplc检测zen的浓度，计算降解率。

试验结果表明，其中一株来源于肉鸡盲肠食靡的菌株ansb01e(电镜形态如图1所示)对zen有较高的降解作用，降解率为95％(如图2所示)。

再将该菌株发酵液与afb1孵育，验证其是否能够同时降解黄曲霉毒素。反应条件为：990μl菌株发酵液与10μlafb1(10μg/ml)，37℃孵育48h，以990μl无菌pbs与10μlafb1(10μg/ml)为对照，反应结束后，加入等体积甲醇终止反应，用hplc检测afb1的浓度，计算降解率。

试验结果表明，ansb01e可以降解afb1，其对afb1的降解率为90％(如图3所示)。

实施例2贝莱斯芽孢杆菌ansb01e对自然霉变玉米中zen的降解效果

首先将zen霉变的玉米粉碎，称取10g重悬在40ml蒸馏水中，121℃灭菌15min，检测玉米粉浸提液中zen浓度为0.74μg/ml，分别在玉米粉浸提液中接种10％的贝莱斯芽孢杆菌ansb01e或lb培养基，在37℃下孵育48h后，分别在孵育0、12、24和48h取样，采用hplc检测zen含量。

结果见图4，贝莱斯芽孢杆菌ansb01e对自然霉变玉米中zen的降解率为73％。

实施例3贝莱斯芽孢杆菌ansb01e对玉米赤霉烯醇、玉米赤霉醇、afm1和afg1的降解作用

将玉米赤霉烯醇、玉米赤霉醇、afm1和afg1分别溶解到二甲基亚砜中，按如下反应体系进行试验：990μl贝莱斯芽孢杆菌发酵液，10μl毒素，体系中玉米赤霉烯醇或玉米赤霉醇浓度为10μg/ml，afm1或afg1浓度为1μg/ml；以pbs与毒素反应为对照；在37℃下反应48h后，加入1ml甲醇终止反应，采用高效液相色谱检测各毒素含量。贝莱斯芽孢杆菌降解玉米赤霉烯醇、玉米赤霉醇、afm1和afg1的效率见表1。

表1贝莱斯芽孢杆菌降解玉米赤霉烯醇、玉米赤霉醇、afm1和afg1的效率

实施例4一种霉菌毒素生物降解剂及其制备方法

称取添加剂总质量的90％的载体(麦麸与淀粉按质量比2∶1比例混合)，然后再按添加剂总质量的10％的比例混入实施例1所述的贝莱斯芽孢杆菌ansb01e，得到霉菌毒素生物降解剂。

实施例5一种霉菌毒素生物降解剂及其制备方法

称取霉菌毒素生物降解剂总质量的9％的载体(蔗糖与淀粉按质量比1∶1比例混合)，然后再按添加剂总质量的1％的比例混入实施例1所述的贝莱斯芽孢杆菌ansb01e，最后按添加剂总量的90％混入地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌混合制剂粉(地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌质量比为2∶1)，得到霉菌毒素生物降解剂。

实施例6一种霉菌毒素生物降解剂及其制备方法

先将占添加剂总质量的70％的米糠与占添加剂总质量的10％的植物乳杆菌混合，然后再按添加剂总质量的10％的比例混入实施例1所述的贝莱斯芽孢杆菌ansb01e，最后按添加剂总量的10％混入胃蛋白酶，得到霉菌毒素生物降解剂。

实施例7一种霉菌毒素生物降解剂及其制备方法

先将占添加剂总质量的70％蔗糖与占添加剂总质量的20％的动物双歧杆菌混合，然后再按添加剂总质量的5％的比例混入实施例1所述的贝莱斯芽孢杆菌ansb01e，再按添加剂总质量的5％的比例混入淀粉酶，最后按添加剂总量的1％混入植物提取物，得到霉菌毒素生物降解剂。

实施例8霉菌毒素生物降解剂处理含有zen的霉变小麦

将实施例5所述霉菌毒素生物降解剂处理含有zen的小麦(zen＝4ppm)按0.1％比例混合，在体外模拟动物胃肠液中消化24h，用于降解饲料中的zen。

模拟胃液：称取2g含有zen的小麦，再添加2mg降解剂，放入100ml锥形瓶中，加入25mlpbs(0.1mph6.0)，调ph到6.8，混匀。加入1ml配制好的淀粉酶溶液，39℃，150r/min消化2h。加10ml0.2mhcl，用1mhcl或1mnaoh溶液调ph至2.0，加1ml新鲜配制的酸性蛋白酶(50000u/g)，混匀，用parafilm封口，于39℃恒温摇床培养6h(150r/min)。

模拟小肠液：模拟胃液孵育6h以后，再加入5ml0.6mnaoh溶液，用1mhcl或1mnaoh将ph调到6.8后加入新鲜配制的肠道外源酶混悬液(蛋白酶∶淀粉酶∶脂肪酶＝3∶1∶1)，用parafilm封口，于39℃恒温摇床分别培养18h(150r/min)。

反应结束后测定zen的降解率为89.63％。

实施例9霉菌毒素生物降解剂处理含有afb1的霉变花生粕

将实施例7所述霉菌毒素生物降解剂处理含有afb1的霉变花生粕(afb1＝730ppb)按0.1％比例混合，在体外模拟动物胃肠液中消化24h，用于降解饲料中的afb1。

模拟胃液：称取2g含有afb1的霉变花生粕，再添加2mg降解剂，放入100ml锥形瓶中，加入25mlpbs(0.1mph6.0)，调ph到6.8，混匀。加入1ml配制好的淀粉酶溶液，39℃，150r/min消化2h。加10ml0.2mhcl，用1mhcl或1mnaoh溶液调ph至2.0，加1ml新鲜配制的酸性蛋白酶(50000u/g)，混匀，用parafilm封口，于39℃恒温摇床培养6h(150r/min)。

模拟小肠液：模拟胃液孵育6h以后，再加入5ml0.6mnaoh溶液，用1mhcl或1mnaoh将ph调到6.8后加入新鲜配制的肠道外源酶混悬液(蛋白酶∶淀粉酶∶脂肪酶＝3∶1∶1)，用parafilm封口，于39℃恒温摇床分别培养18h(150r/min)。

反应结束后测定afb1的降解率为83.63％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。