PTPRE作为靶标在制备或筛选抗肝癌药物中的用途及其相关药物的制作方法

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及ptpre作为靶标在制备或筛选抗肝癌药物中的用途及其相关药物。

背景技术：

肝细胞癌(hcc)是世界上最常见的恶性肝癌之一。其发病机制是极其复杂的，可以有多种原因，包括慢性乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒感染、接触黄曲霉毒素b1、酒精性和非酒精性脂肪性疾病等。尽管最近的研究发现了许多影响肝癌发展的基因和途径，但治疗和患者预后仍不能令人满意。

tgf-β是一种多向性、多效性的细胞因子，以自分泌或旁分泌的方式通过细胞表面的受体信号转导途径调节细胞的增殖、分化、凋亡，对细胞外基质的合成、创伤的修复、免疫功能等有重要的调节作用。成熟的tgf-β是通过二硫键连接而成的分子量为25×10³的同质二聚体。tgf-β是参与慢性肝脏疾病和癌症的发病机理的重要的多功能细胞因子。tgf-β/smad信号通路为：tgf-β与tgf-βii型受体结合后，再激活募集tgf-βi型受体组合后形成二聚体形式的受体复合物。tgf-βii型受体磷酸化tgf-βi型受体的甘氨酸-丝氨酸富集区域(gs序列)并活化tgf-βi型受体的丝氨酸/苏氨酸活性。活化的tgf-βi型受体又磷酸化受体相关smad蛋白。其中smad2和smad3直接被tgf-βi型受体磷酸化，使得构象发生改变从而从受体复合物中释放出来，进入细胞核，参与细胞核内相关基因的调控。然而，smad2-smad3如何介导tgf-β在肝癌入侵与转移中的机制仍不完全清楚，需要进一步研究。

ptpre(proteintyrosinephosphatasereceptorepsilon)受体型蛋白酪氨酸磷酸酶epsilon，属于蛋白酪氨酸磷氨酸家族，催化蛋白的酪氨酸去磷酸化反应，从而调节信号通路的转导。但是目前ptpre在肝癌入侵与转移中尚无相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供ptpre作为靶标在制备或筛选抗肝癌药物中的用途及其相关药物。

本发明是这样实现的：

本发明的目的之一在于提供ptpre作为靶标在制备或筛选抗肝癌药物中的用途。

优选地，所述抗肝癌药物包括抑制肝癌细胞的增殖、侵袭与转移的药物。

所述抗肝癌药物的作用机理包括：抑制ptpre基因的表达或者抑制ptpre蛋白的酶活从而抑制其对tgf-β/smad3信号通路的调节。

本发明的目的之二在于提供ptpre作为分子标志物在制备肝癌细胞的增殖、侵袭与转移的检测试剂盒中的用途。实验表明ptpre的表达与肝癌细胞的增殖、侵袭与转移成正相关，因此可以作为分子标志物。所述检测试剂盒可包括ptpre的多克隆抗体或单克隆抗体，或者实时定量pcr检测试剂盒等等，只要能够检测ptpre的常规方法均在本发明的保护范围之内。

本发明的目的之三在于提供一种抗肝癌药物该抗肝癌药物包括抑制ptpre的表达的药物或抑制ptpre酶活的药物。

具体地，所述抗肝癌药物包括能够抑制ptpre的表达或抑制ptpre酶活的药物(不限于有机合成药物、或者中药组合物等)，以及抑制ptpre表达的核酸分子药物。

所述抑制ptpre表达的核酸分子药物包括ptpre基因的shrna，所述ptpre基因shrna中含有能够在严紧条件下与ptpre基因杂交的核苷酸序列。其包括序列如seqidno.1-3任一所示的shrna。

所述抗肝癌药物还包括可诱导shrna在体内表达的诱导剂。

本发明的目的之四在于提供抗肝癌的慢病毒载体药物，其有效成分含有ptpre基因干扰慢病毒载体。所述慢病毒载体的表达区序列如seqno.1-3任一所示。

本发明的目的之五在于提供一种抗肝癌的慢病毒药物，其有效成分含有ptpre基因干扰慢病毒，所述ptpre基因干扰慢病毒由所述ptpre基因干扰慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。

含有治疗有效量的所述shrna或者所述ptpre基因干扰慢病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组成的药物组合物也在本发明的保护范围之内。

本发明具有的有益效果是：

本发明通过大量的实验数据证明，ptpre能够促进肝癌细胞的侵袭与转移，通过进一步的机制研究发现ptpre能够介导受体tgfbr1对smad3的招募，使其磷酸化激活。且发现ptpre的两个酶活位点对于smad3磷酸化至关重要。因此针对ptpre为靶标，可以筛选药物，该药物通过抑制ptpre基因的表达或者抑制ptpre蛋白的酶活从而抑制其对tgf-β/smad3信号通路的调节，进而能够抑制肝癌细胞的增殖、侵袭与转移，因此本发明为药物筛选提供一个新的靶标。且本发明的ptpre基因的shrna、慢病毒载体及慢病毒能够抑制ptpre的表达，因此可以作为抗肝癌药物。

附图说明

图1为本发明实施例1的smad3在体外的检测结果；其中图1a为smad3过表达细胞系与smad3敲减细胞系的鉴定结果；图1b和图1e为过表达细胞系与敲减细胞系的划痕实验结果；图1c和图1f为过表达细胞系与敲减细胞系的转移实验结果；图1d和图1g为过表达细胞系与敲减细胞系的侵袭实验结果；

图2为本发明实施例1的smad3在体内的检测结果；其中图2a为肝癌组织和癌旁组织中的smad3的免疫组化结果和表达分析检测结果，图中横坐标中n代表癌旁组织，c代表肝癌组织；图2b为smad3高表达和低表达的病人的预后结果；图2c为smad3过表达后肝癌肺转移的结果；图2d为smad3敲减后肝癌肺转移的结果；图2e为smad3过表达后肝癌肝内转移的结果；图2f为smad3敲减后肝癌肝内转移的结果；

图3为本发明实施例1的ptpre在体外的检测结果；其中图3a为ptpre过表达细胞系与ptpre敲减细胞系的鉴定结果；图3b为过表达细胞系与敲减细胞系的划痕实验结果；图3c为过表达细胞系与敲减细胞系的转移实验结果；图3d为过表达细胞系与敲减细胞系的侵袭实验结果；

图4为本发明实施例1的ptpre在体内的检测结果；图4a为ptpre过表达后肝癌肺转移的结果；图4b为ptpre敲减后肝癌肺转移的结果；图4c为ptpre过表达后肝癌肝内转移的结果；图4d为ptpre敲减后肝癌肝内转移的结果；图4e为肝癌组织和癌旁组织中的ptpre的免疫组化结果和表达分析检测结果，图中横坐标中n代表癌旁组织，c代表肝癌组织；图4f为ptpre高表达和低表达的病人的预后结果；

图5是实施例3中ptpre与tgfbr1、smad3之间存在相互作用示意图；其中图5a为ptpre分别与tgfbr1，以及smad3共转后的co-ip结果；图5b为内源性ptpre与tgfbr1相互作用的结果；如图5c为内源性ptpre与smad3相互作用的结果；

图6是实施例3中ptpre介导受体tgfbr1对smad3的招募的示意图；其中图6a、6b为ptpre分别与tgfbr1，以及smad3共转后的正拉、反拉的的co-ip结果；图6c为ptpre促进tgf-β诱导的smad3的磷酸化的结果；

图7为实施例4中ptpre的突变体系的建立结果；其中图7a表明ptpre的两个突变位点y164a、d250a在tgf-β刺激下对sbe4荧光素酶的活性调控结果；其中图7b为ptpre的dm突变(y164a、d250a同时突变)与野生型wt、空载vec在tgf-β刺激下对sbe4荧光素酶的活性调控结果；图7c为dm突变与野生型wt、空载vec构建的稳定细胞系的鉴定结果；图7d为ptpre-wt、ptpre-dm以及vec稳定细胞系在不同时间的tgf-β刺激下对smad3磷酸化水平的调控结果；图7e和7f为dm突变与野生型wt、空载vec的稳定细胞系的体外迁移和侵袭实验结果。

具体实施方式

实施例1smad3促进肝癌细胞的增殖、转移与侵袭

一、体外实验

1、smad3过表达细胞系与敲减细胞系的构建

(1)设计smad3-shrna靶序列(5’-gagcctggtcaagaaactcaa-3’，如seqno.4所示)；交由上海生工生物公司合成含有smad3-shrna序列的引物构建plko.1-shrna质粒。重组慢病毒表达载体进行病毒包装：培养293t细胞，取上述plko.1-shrna质粒与慢病毒包装质粒pmd2.g(addgene#12259)，pspax2(addgene#12260)一起共转染293t细胞(三者比例为4：1：3)，按照病毒包装辅助试剂盒操作说明书进行操作，48h后收集病毒上清，1500g离心10min后取上清经0.45μm滤膜过滤，于-80℃保存。将包装成功的慢病毒分别感染细胞lm3，得到ptpre敲减细胞系lm3。

(2)smad3过表达细胞系的构建：构建含有ptpre编码序列的慢病毒载体plenti-smad3。所述plenti-smad3载体采用常规克隆方法构建，然后将plenti-smad3与慢病毒包装质粒pmd2.g(addgene#12259)，pspax2(addgene#12260)一起共转染293t细胞(三者比例为4：1：3)，按照病毒包装辅助试剂盒操作说明书进行操作，48h后收集病毒上清，1500g离心10min后取上清经0.45μm滤膜过滤，于-80℃保存。将包装成功的过表达慢病毒分别感染细胞7721，得到smad3过表达细胞系7721。

图1a为smad3过表达细胞系与敲减细胞系的鉴定结果；由图1a可知smad3过表达细胞系及敲减细胞系构建成功。

2、transwell与细胞划痕实验检测smad3对肝癌细胞系转移能力的影响

图1b和图1e为过表达细胞系与敲减细胞系的划痕结果；图1c和图1f为过表达细胞系与敲减细胞系的转移结果；结果表明过表达细胞系的肝癌细胞转移能力增加；敲减细胞系的肝癌细胞转移能力降低。表明smad3促进肝癌细胞的转移。

3、matrigel实验检测smad3对肝癌细胞系侵袭能力的影响

图1d和图1g为过表达细胞系与敲减细胞系的侵袭结果；结果表明过表达细胞系的肝癌细胞侵袭能力增加；敲减细胞系的肝癌细胞侵袭能力降低。表明smad3促进肝癌细胞的侵袭。

二、临床样本及体内实验

1、病人肝癌组织和癌旁组织smad3的表达情况

选取病人肝癌组织和癌旁组织，分别做免疫组化检测smad3的表达。肝癌组织和癌旁组织由华中科技大学同济医学院附属同济医院提供。整个采集及后续实验过程符合医学伦理道德要求并严格遵循病例资料的保密原则。组织样品经手术取出后，经福尔马林固定、石蜡包埋后切片备用。

图2a为肝癌组织和癌旁组织中的smad3的免疫组化结果和表达分析检测结果，图中横坐标中n代表癌旁组织，c代表肝癌组织；由图可知，smad3在肝癌组织的表达量明显高于癌旁组织。

图2b为smad3高表达和低表达的病人的预后结果；表明肝癌组织中smad3的表达量越高病人的预后效果越差。

2、肺转移模型以及肝内转移模型验证smad3基因的促转移功能

(1)肺转移模型结果

肺转移模型中，将含荧光素酶的hcc细胞(1×10⁶)注入5周龄雄性balb/c裸小鼠尾静脉。每组6只老鼠。每只小鼠注射后第1、4、5、6周分别捕获荧光素酶生物发光。所有小鼠于注射后6周处死。每只小鼠的肺分离固定，进行h&e染色。在显微镜下计数各组转移灶的平均数量。所述肺转移模型中实验动物分为4组分别为：分别转入实施例1制备得到敲低smad3的稳转细胞系及其阴性对照组；转入smad3基因的稳转细胞系及其阴性对照组(空载)。

图2c为smad3过表达后肝癌肺转移的结果；由图2c的左图可知，smad3过表达后生物发光强度和荧光数量明显大于对照组；图2c的右图可知，smad3过表达后转移灶的平均数量明显大于对照组。

图2d为smad3敲减后肝癌肺转移的结果；由图2d的左图可知，smad3敲减后生物发光强度和荧光数量明显小于对照组；图2d的右图可知，smad3敲减后转移灶的平均数量明显小于对照组。

(2)肝内转移模型结果

在原位移植和肝内转移模型中，将含有荧光素酶的hcc细胞(1×10⁶)注射到5周大的balb/c雄性裸小鼠皮下，形成肿瘤异种移植物。将皮下移植瘤模型的肿瘤结节分离并切成1mm³块，植入裸鼠(雄性，5周龄)肝左外叶，模拟原发性hcc。每组6只老鼠。植入8周后处死小鼠，计数肝内可见肿瘤结节。所述原位移植和肝内转移模型中实验动物也分为4组分别为：分别转入敲低smad3稳转细胞系及其阴性对照组；转入smad3基因的稳转细胞系及其阴性对照组(空载)。

图2e为smad3过表达后肝癌肝内转移的结果；由图2e可知，smad3过表达后生物发光强度和荧光数量明显大于对照组。

图2f为smad3敲减后肝癌肝内转移的结果；由图2f可知，smad3敲减后生物发光强度和荧光数量明显小于对照组。

综上可知，体内实验与体外实验均证明smad3能促进肝癌细胞的侵袭与转移。

实施例2ptpre促进肝癌细胞的侵袭与转移

一、体外实验

1、ptpre过表达细胞系与敲减细胞系的构建

(1)ptpreshrna的靶序列如表1所示，交由上海生工生物公司合成含有smad3-shrna序列的引物构建得到plko.1-shrna质粒。

表1

将质粒pmd2.g(addgene#12259)，pspax2(addgene#12260)和plko.1-shrna质粒(三者比例为1：3：4)共转染293t细胞。按照慢病毒包装辅助试剂盒操作说明书进行操作，48h后收集病毒上清，1500g离心10min后取上清经0.45μm滤膜过滤，用peg-8000沉淀，于-80℃保存。将包装成功的慢病毒分别感染细胞alex、lm3，构建ptpre敲减的alex、lm3细胞系。

(2)ptpre过表达细胞系的构建：构建含有ptpre编码序列的慢病毒载体plenti-ptpre，所述载体的编码区的序列如seqno.5所示。所述plenti-ptpre载体采用常规克隆方法构建，然后将plenti-ptpre与慢病毒包装质粒pmd2.g(addgene#12259)，pspax2(addgene#12260)一起共转染293t细胞(三者比例为4：1：3)，按照病毒包装辅助试剂盒操作说明书进行操作，48h后收集病毒上清，1500g离心10min后取上清经0.45μm滤膜过滤，于-80℃保存。将包装成功的过表达慢病毒分别感染细胞7721、hlf，得到ptpre过表达的7721细胞系和hlf细胞系。

图3a为ptpre过表达细胞系与敲减细胞系的鉴定结果；由图3a可知ptpre过表达及敲减细胞系构建成功。

2、transwell与细胞划痕实验检测ptpre对肝癌细胞系转移能力的影响

图3b为过表达细胞系与敲减细胞系的划痕结果；图3c为过表达细胞系与敲减细胞系的转移结果；结果表明过表达细胞系的肝癌细胞系转移能力增加；敲减细胞系的肝癌细胞系转移能力降低。表明ptpre促进肝癌细胞的转移。

3、matrigel实验检测ptpre对肝癌细胞系侵袭能力的影响

图1d为过表达细胞系与敲减细胞系的侵袭结果；结果表明过表达细胞系的肝癌细胞系侵袭能力增加；敲减细胞系的肝癌细胞系侵袭能力降低。表明ptpre促进肝癌细胞的侵袭。

二、临床样本及体内实验

1、病人肝癌组织和癌旁组织的ptpre表达情况

选取病人肝癌组织和癌旁组织，分别做免疫组化检测ptpre的表达。肝癌组织和癌旁组织由华中科技大学同济医学院附属同济医院提供。整个采集及后续实验过程符合医学伦理道德要求并严格遵循病例资料的保密原则。组织样品经手术取出后，经福尔马林固定、石蜡包埋后切片备用。

图4e为肝癌组织和癌旁组织中的ptpre的免疫组化结果和表达分析检测结果，图中横坐标中n代表癌旁组织，c代表肝癌组织；由图可知，ptpre在肝癌组织的表达量明显高于癌旁组织。图4f为ptpre高表达和低表达的病人的预后结果；表明肝癌组织中ptpre的表达量越高，病人的预后效果越差。

2、肺转移模型以及肝内转移模型验证ptpre基因的促转移功能

(1)肺转移模型结果

肺转移模型中，将含荧光素酶的hcc细胞(1×10⁶)注入5周龄雄性balb/c裸小鼠尾静脉。每组6只老鼠。每只小鼠注射后第1、4、5、6周分别捕获荧光素酶生物发光。所有小鼠于注射后6周处死。每只小鼠的肺分离固定，进行h&e染色。在显微镜下计数各组转移灶的平均数量。所述肺转移模型中实验动物分为4组分别为：分别转入实施例1制备得到敲低ptpre的稳转细胞系及其阴性对照组；转入ptpre基因的稳转细胞系及其阴性对照组(空载)。

图4a为ptpre过表达后肝癌肺转移的结果；由图4a的左图可知，ptpre过表达后生物发光强度和荧光数量明显大于对照组；图4a的右图可知，ptpre过表达后转移灶的平均数量明显大于对照组。

图4b为ptpre敲减后肝癌肺转移的结果；由图4b的左图可知，ptpre敲减后生物发光强度和荧光数量明显小于对照组；图4b的右图可知，ptpre敲减后转移灶的平均数量明显小于对照组。

(2)肝内转移模型结果

在原位移植和肝内转移模型中，将含有荧光素酶的hcc细胞(1×10⁶)皮下注射到5周大的balb/c雄性裸小鼠的侧边，形成肿瘤异种移植物。将皮下移植瘤模型的肿瘤结节分离并切成1mm³块，植入裸鼠(雄性，5周龄)肝左外叶，模拟原发性hcc。每组6只老鼠。植入8周后处死小鼠，计数肝内可见肿瘤结节。所述原位移植和肝内转移模型中实验动物也分为4组分别为：分别转入敲低ptpre稳转细胞系及其阴性对照组；转入ptpre基因的稳转细胞系及其阴性对照组(空载)。

图4c为ptpre过表达后肝癌肝内转移的结果；由图4c可知，ptpre过表达后生物发光强度和荧光数量明显大于对照组。

图4d为ptpre敲减后肝癌肝内转移的结果；由图4d可知，ptpre敲减后生物发光强度和荧光数量明显小于对照组。

综上可知，体内实验于体外实验均证明ptpre能促进肝癌细胞的侵袭与转移。

实施例3

1、通过免疫共沉淀确定相互作用

构建flag-ptpre、ha-tgfbr1、ha-smad3表达质粒(本发明的flag、ha为常见的flag、ha标签)，将flag-ptpre表达质粒与ha-tgfbr1共转、flag-ptpre表达质粒与ha-smad3表达质粒共转后30小时，收取细胞，加入适量细胞裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂)，冰上裂解30min,细胞裂解液于4℃，最大转速离心15min后取上清得到细胞总蛋白。取少量裂解液以备westernblot分析(input分析)，剩余裂解液加1μg相应的抗体(剩余裂解液分为2份，一份加入1ug抗ha抗体共同孵育，另外一份加入1ugigg共同孵育)加入到细胞裂解液，4℃缓慢摇晃孵育过夜；取10μlproteing琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3次，每次3,000rpm离心3min；将预处理过的proteing琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4℃缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与proteing琼脂糖珠偶连；免疫沉淀反应后，在4℃以3,000rpm速度离心3min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3－4次；最后加入30μl的2×sds上样缓冲液，沸水煮5分钟；westernblotting分析。

图5a为flag-ptpre分别与ha-tgfbr1，以及ha-smad3共转后的co-ip结果；表明与阴性对照组相比，ptpre特异的与tgfbr1、smad3发生相互作用。

2、内源的相互作用

向肝癌细胞加tgf-β刺激，刺激1小时时间后收取细胞，加入适量细胞裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂)，冰上裂解30min,细胞裂解液于4℃，最大转速离心30min后取上清得到细胞总蛋白。取少量裂解液以备westernblot分析(input分析)，剩余裂解液加5μg相应的抗体加入到细胞裂解液4℃缓慢摇晃孵育过夜；取10μlproteing琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3次，每次3,000rpm离心3min；将预处理过的琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4℃缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与琼脂糖珠偶连；免疫沉淀反应后，在4℃以3,000rpm速度离心3min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3－4次；最后加入30μl的2×sds上样缓冲液，沸水煮5分钟；westernblotting分析。

由图5b可知，加tgf-β刺激后ptpre与tgfbr1的结合增强；由图5c可知，加tgf-β刺激后ptpre才能与smad3结合。

2、ptpre介导受体tgfbr1对smad3的招募

将实验组1：flag-ptpre与ha-tgfbr1、ha-smad3共转293t细胞；同上做外源性co-ip实验。

图6a、6b为共转后的flag正拉、ha反拉的的co-ip结果；结果表明ptpre介导受体tgfbr1对smad3的招募。

3、shrna-ptpre对smad磷酸化水平影响实验

为了进一步研究shrna-ptpre对smad3的磷酸化水平影响。我们将过表达和敲减ptpre的细胞进行了tgf-β和受体抑制剂刺激实验。

结果如图6c所示，实验结果可以看出，ptpre能够促进smad3的磷酸化。

实施例4ptpre蛋白的酶活与smad3的磷酸化的关系

1、构建ptpre的两个突变位点y164a(ptpre的第164位氨基酸由y突变成a)、d250a(ptpre的第250位氨基酸由d突变成a)的过表达质粒，荧光素酶活性检测采用双荧光素酶报告基因检测系统(promega,madison,wi,usa)，glomax20/20光度仪(promega)测定荧光素酶的相对活性。图7a表明，与野生型wt相比，ptpre的两个突变位点y164a、d250a能够降低sbe4荧光素酶报告基因的活性。所述ptpre-wt的序列如seqno.5所示，ptpre-y164a的序列如seqno.6所示，ptpre-d250a的序列如seqno.7所示，ptpre-dm的序列如seqno.8所示。

2、基于上述结果构建ptpre的y164a、d250a同时突变即dm突变的质粒。图7b表明，与野生型wt相比，ptpre的dm突变完全丧失对sbe4荧光素酶活性的调控作用。

3、构建稳定细胞系，图7c为ptpre-wt稳定细胞系与ptpre-dm稳定细胞系中ptpre的表达量。表明ptpre-wt稳定细胞系与ptpre-dm稳定细胞系构建成功。

4、检测ptpre-wt稳定细胞系与ptpre-dm稳定细胞系中smad3的磷酸化水平、以及src的磷酸化水平；结果如图7d所示，tgf-β刺激后，ptpre-wt稳定细胞系的smad3的磷酸化水平和src的磷酸化水平明显大于ptpre-dm稳定细胞系，表明ptpre蛋白两个突变位点y164a(ptpre的第164位氨基酸由y突变成a)、d250a(ptpre的第250位氨基酸由d突变成a)对smad3的磷酸化激活、src的磷酸化激活至关重要。

5、检测ptpre-wt稳定细胞系与ptpre-dm稳定细胞系的迁移和侵袭，结果如7e和7f所示。结果表明ptpre-wt稳定细胞系的细胞迁移和侵袭能力明显大于ptpre-dm稳定细胞系。

所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不限制本发明，凡在本发明之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>华中科技大学同济医学院附属同济医院

<120>ptpre作为靶标在制备或筛选抗肝癌药物中的用途及其相关药物

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ctgcgaccatcgtcatgttaa21

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gctaccgacagaaggactatt21

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ccgagtgatcctttccatgaa21

<210>4

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gagcctggtcaagaaactcaa21

<210>5

<211>2103

<212>dna

<213>野生型ptpre(ptpre-wt)

<400>5

atggagcccttgtgtccactcctgctggtgggttttagcttgccgctcgccagggctctc60

aggggcaacgagaccactgccgacagcaacgagacaaccacgacctcaggccctccggac120

ccgggcgcctcccagccgctgctggcctggctgctactgccgctgctgctcctcctcctc180

gtgctccttctcgccgcctacttcttcaggttcaggaagcagaggaaagctgtggtcagc240

accagcgacaagaagatgcccaacggaatcttggaggagcaagagcagcaaagggtgatg300

ctgctcagcaggtcaccctcagggcccaagaagtattttcccatccccgtggagcacctg360

gaggaggagatccgtatcagatccgccgacgactgcaagcagtttcgggaggagttcaac420

tcattgccatctggacacatacaaggaacttttgaactggcaaataaagaagaaaacaga480

gaaaaaaacagatatcccaacatccttcccaatgaccattctagggtgattctgagccaa540

ctggatggaattccctgttcagactacatcaatgcttcctacatagatggttacaaagag600

aagaataaattcatagcagctcaaggtcccaaacaggaaacggttaacgacttctggaga660

atggtctgggagcaaaagtctgcgaccatcgtcatgttaacaaacttgaaagaaaggaaa720

gaggaaaagtgccatcagtactggcccgaccaaggctgctggacctatggaaacatccgg780

gtgtgcgtggaggactgcgtggttttggtcgactacaccatccggaagttctgcatacag840

ccacagctccccgacggctgcaaagcccccaggctggtctcacagctgcacttcaccagc900

tggcccgacttcggagtgccttttacccccattgggatgctgaagttcctcaagaaagta960

aagacgctcaaccccgtgcacgctgggcccatcgtggtccactgtagcgcgggcgtgggc1020

cggacgggcaccttcattgtgatcgatgccatgatggccatgatgcacgcggagcagaag1080

gtggatgtgtttgaatttgtgtctcgaatccgtaatcagcgccctcagatggttcaaacg1140

gatatgcagtacacgttcatctaccaagccttactcgagtactacctctacggggacaca1200

gagctggacgtgtcctcactggagaagcacctgcagaccatgcacggcaccacaacccac1260

ttcgacaagatcgggctggaggaggagttcaggaaattgacaaatgtccggatcatgaag1320

gagaacatgaggacgggcaacttgccggcaaacatgaagaaggccagggtcatccagatc1380

atcccgtatgacttcaaccgagtgatcctttccatgaaaaggggtcaagaatacacagac1440

tacatcaacgcatccttcatagacggctaccgacagaaggactatttcatcgccacccag1500

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