Yp_2058蛋白在调控鼠疫耶尔森菌毒力中的应用的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及yp_2058蛋白在调控鼠疫耶尔森菌毒力中的应用。
背景技术：
：鼠疫是中国法定的甲类传染病，其病原菌为鼠疫耶尔森氏菌(yersiniapestis)。鼠疫是自然疫源性疾病，中国的鼠疫疫源地主要分布于17个省及自治区，总面积多达60多万平方公里。鼠疫耶尔森氏菌主要由节肢动物跳蚤通过叮咬传染给宿主啮齿类动物，并有可能传播给人类导致腺鼠疫、肺炎鼠疫和败血症等的发生，给人类造成了巨大的生命和财产损失。世界卫生组织已将鼠疫列为重新抬头的传染病，因此，必须要给予高度重视。鼠疫菌是一种革兰氏染色阴性的短小杆菌，经蚤传播，蚤体被认为是室温动物，体内温度为26℃，在叮咬动物或人后，进入37℃环境。因此，鼠疫菌有一套机制来应对这个温度转换的刺激。鼠疫菌通过分泌毒力蛋白来应对温度转换和发挥致病性对其有重要的意义。技术实现要素：本发明的目的是降低鼠疫耶尔森菌毒力。本发明首先保护yp_2058蛋白在调控鼠疫耶尔森菌毒力和/或预防鼠疫中的应用。上述应用中，所述yp_2058蛋白可为如下a1)或a2)或a3)：a1)氨基酸序列是seqidno：2所示的蛋白质；a2)在seqidno：2所示的蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质；a3)将a1)或a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与鼠疫耶尔森菌毒力相关的蛋白质。其中，seqidno：2由199个氨基酸残基组成。本发明还保护编码所述yp_2058蛋白的核酸分子在调控鼠疫耶尔森菌毒力和/或预防鼠疫中的应用。所述编码yp_2058蛋白的核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的dna分子：b1)编码区是seqidno：1所示的dna分子；b2)核苷酸序列是seqidno：1所示的dna分子；b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，来源于鼠疫耶尔森氏菌且编码所述yp_2058蛋白的dna分子；b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，来源于鼠疫耶尔森氏菌且编码所述yp_2058蛋白的dna分子。其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。其中，seqidno：1由600个核苷酸组成，seqidno：1所示的dna分子编码seqidno：2所示的氨基酸序列。上述任一所述的应用中，所述鼠疫耶尔森菌可为鼠疫耶尔森菌201株。本发明还保护一种重组鼠疫耶尔森菌甲，其制备方法如下：抑制鼠疫耶尔森菌中所述yp_2058蛋白的表达量和/或活性，得到的重组菌即为重组鼠疫耶尔森菌甲；与鼠疫耶尔森菌相比，重组鼠疫耶尔森菌甲的毒力降低。上述方法中，所述“抑制鼠疫耶尔森菌中所述yp_2058蛋白的表达量和/或活性”可通过rna干扰、同源重组、基因敲除、基因定点编辑等本领域熟知的方法，达到抑制yp_2058蛋白的表达量和/或活性的目的。上述方法中，所述“抑制鼠疫耶尔森菌中yp_2058蛋白的表达量和/或活性”可通过向鼠疫耶尔森菌中导入抑制yp_2058蛋白的表达量和/或活性的物质实现。上述任一所述的方法中，所述“抑制yp_2058蛋白的表达量和/或活性的物质”具体可为以质粒pkd4为模板，采用实施例中表1的2058-k-f和2058-k-r组成的引物对进行pcr扩增，得到的pcr扩增产物。所述pcr扩增产物带有同源臂的kana突变盒。上述任一所述的方法中，所述鼠疫耶尔森菌可为鼠疫耶尔森菌201株。在本发明的一个实施例中，当鼠疫耶尔森菌为鼠疫耶尔森菌201株，重组鼠疫耶尔森菌甲具体可为鼠疫菌δyp_2058。本发明还保护一种重组鼠疫耶尔森菌乙，其制备方法如下：提高鼠疫耶尔森菌中所述yp_2058蛋白的表达量和/或活性，得到的重组菌即为重组鼠疫耶尔森菌乙；与鼠疫耶尔森菌相比，重组鼠疫耶尔森菌乙的毒力增强。上述方法中，所述“提高鼠疫耶尔森菌中所述yp_2058蛋白的表达量和/或活性”可通过多拷贝、改变启动子、调控因子、转基因等本领域熟知的方法，达到提高yp_2058蛋白的表达量和/或活性的效果。上述方法中，所述“提高鼠疫耶尔森菌中所述yp_2058蛋白的表达量和/或活性”可通过向鼠疫耶尔森菌中导入提高yp_2058蛋白的表达量和/或活性的物质实现。所述“提高yp_2058蛋白的表达量和/或活性的物质”可为编码所述yp_2058蛋白的核酸分子。所述向鼠疫耶尔森菌中导入提高yp_2058蛋白的表达量和/或活性的物质具体可通过向鼠疫耶尔森菌中导入含有编码yp_2058蛋白的核酸分子的重组载体实现。所述含有编码yp_2058蛋白的核酸分子的重组载体具体可为将pbad24质粒的限制性内切酶nheⅰ和hindiii识别序列间的小片段替换为seqidno：1所示的dna分子，得到重组质粒。上述方法中，所述鼠疫耶尔森菌可为重组鼠疫耶尔森菌甲或鼠疫耶尔森菌201株。在本发明的一个实施例中，当鼠疫耶尔森菌为鼠疫菌δyp_2058，重组鼠疫耶尔森菌乙具体可为鼠疫菌δyp_2058回补株。本发明还保护上述任一所述抑制yp_2058蛋白的表达量和/或活性的物质。本发明还保护上述任一所述抑制yp_2058蛋白的表达量和/或活性的物质在调控鼠疫耶尔森菌毒力和/或预防鼠疫中的应用。上述应用中，所述鼠疫耶尔森菌可为鼠疫耶尔森菌201株。上述任一所述的应用中，所述调控鼠疫耶尔森菌毒力可为降低鼠疫耶尔森菌毒力或提高鼠疫耶尔森菌毒力。在本发明的实施例中，向balb/c小鼠腹股沟皮下、尾静脉或滴鼻注射100cfu鼠疫菌δyp_2058(相当于重组鼠疫耶尔森菌甲)、鼠疫菌δyp_2058回补株或鼠疫菌201株，然后正常喂养14d；期间观察小鼠的生存情况。结果表明，与鼠疫菌201株相比，鼠疫菌δyp_2058的毒力显著下降；鼠疫菌δyp_2058回补株能够完全回补毒力。由此可见，yp_2058蛋白对鼠疫耶尔森菌的毒力有重要影响。本发明具有重大的应用价值。附图说明图1为实施例3耐酸实验的结果。图2为实施例4绘制的生长曲线。图3为实施例5中步骤一小鼠毒力实验中各组小鼠的生存曲线。图4为实施例5中步骤二小鼠毒力实验中各组小鼠的生存曲线。图5为实施例5中步骤三小鼠毒力实验中各组小鼠的生存曲线。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中涉及的引物名称和核苷酸序列见表1。表1注：单下划线为限制性内切酶nheⅰ的识别序列，双下划线为限制性内切酶hindiii的识别序列。鼠疫耶尔森菌201株记载于如下文献中：songy，tongz，wangj，wangl，guoz，hany，zhangj，peid，zhoud，qinhetal.completegenomesequenceofyersiniapestisstrain91001，anisolateavirulenttohumans.dnaresearch：aninternationaljournalforrapidpublicationofreportsongenesandgenomes2004，11(3):179-197.在下文中，鼠疫耶尔森菌201株简称鼠疫菌201株。质粒小提试剂盒为qiagen公司的产品。实施例1、yp_2058蛋白的发现鼠疫耶尔森氏菌由传播媒介到哺乳动物宿主的过程经历了从环境温度26℃到37℃的转变，很多毒力基因在37℃被启动，开始大量表达，这大大增加了鼠疫耶尔森氏菌对宿主的毒力。已有研究表明，通过shotgun-lc-ms-ms、1d-lc-ms-ms和2d-ms三种不同方法对鼠疫菌201株的菌体蛋白进行质谱分析，共鉴定到1193个蛋白，占基因组预测cds的比例为28.7％。通过ltq-ft的方法对鼠疫201株体外跳蚤模拟条件下的蛋白质组学进行分析，共鉴定到1926个蛋白，占基因组预测cds的比例为46.50％。本发明的发明人通过tmt(tandemmasstag)质谱分析技术鉴定鼠疫菌跳蚤模拟条件及人体模拟条件下的蛋白质组的差异，去冗余后共检测到2141个蛋白，占基因组预测cds的52.2％(在已报道文献中覆盖率最高)。之后，通过分析，筛选出可能与鼠疫耶尔森氏菌的毒力相关的yp_2058蛋白。具体步骤如下：1、制备鼠疫菌201株在26℃(模拟跳蚤体内环境)的分泌蛋白样品1、鼠疫菌201株在37℃(模拟小鼠体内环境)的分泌蛋白样品2、26℃菌体蛋白样品3和37℃菌体蛋白样品4。2、完成步骤1后，采用同量异序化学标签(tandemmasstags，tmt)法分别对分泌蛋白样品1、分泌蛋白样品2、菌体蛋白样品3和菌体蛋白样品4进行定量分析，从而建立鼠疫菌201株蛋白分析平台。3、完成步骤2后，对鼠疫菌201株蛋白分析平台进行分析，结合蛋白表达量及组学分析结果，从分泌蛋白样品2中表达量显著上调的分泌蛋白中筛选出yp_2058蛋白。yp_2058蛋白的氨基酸序列如seqidno：2所示。编码yp_2058蛋白的基因(以下简称yp_2058基因)如seqidno：1所示。实施例2、yp_2058基因敲除株和回补株的构建一、yp_2058基因敲除株(即鼠疫菌δyp_2058)的构建构建基因突变株是研究基因功能最重要的方法之一。本发明的发明人运用一步法突变技术敲除yp_2058基因。该方法基于大肠杆菌的λ-red重组系统，能够使yp_2058基因与带有同源臂的抗性基因(即kana突变盒)发生同源重组，被抗性基因替换，从而yp_2058基因功能失效。该方法中，首先将编码λ-red重组系统的pkd46质粒导入鼠疫菌201株，该质粒能够通过阿拉伯糖诱导表达exo、beta和gam三种蛋白(exo蛋白是λ核酸外切酶，能够切开双链dna；beta蛋白能介导单链dna互补复性与其退火反应；gam蛋白能抑制对dna的外切酶活性)；然后转入带有同源臂的抗性基因(即kana突变盒)，在重组酶作用下与鼠疫菌201株染色体上的yp_2058基因进行同源重组，从而使该yp_2058基因失活；最后，提高培养温度，将温度敏感型质粒pkd46消除。1、质粒pkd46的提取(1)将含pkd46质粒的大肠杆菌dh5α接种于5mllb液体培养基，37℃、200rpm振荡培养至对数期，得到培养菌液。(2)取步骤(1)得到的培养菌液，用质粒小提试剂盒提取质粒，得到质粒pkd46(约177bp)。2、鼠疫菌201株感受态细胞的制备(1)将鼠疫菌201株接种于lb液体培养基，26℃、200rpm振荡培养至对数期，得到菌液1。(2)取菌液1，接种于lb液体培养基(接种比为1:50)，26℃、200rpm振荡培养，得到od620nm值为0.5-0.6的菌液2。(3)取菌液2，加入阿拉伯糖，得到诱导体系；该诱导体系中，阿拉伯糖的浓度为10mmol/l。(4)取诱导体系，26℃、200rpm振荡培养2h，得到菌液3。(5)取菌液3，4℃、4000rpm离心5min，收集菌体。(6)取步骤(5)收集的菌体，先用无菌的10％(v/v)甘油水溶液洗涤两次，再用100μl10％(v/v)甘油水溶液重悬，得到鼠疫菌201株感受态细胞。将鼠疫菌201株感受态细胞置于冰浴备用。3、电转化(1)取鼠疫菌201株感受态细胞，加入200μg质粒pkd46，混匀后加入预冷的电击杯，冰浴10min，然后置于电转仪中进行电击(电击参数为25μf、200ω、2.5kv)。(2)完成步骤(1)后，取所述电击杯，加入1mllb液体培养基，混匀后吸至ep管(规格为1.5ml)中，26℃、200rpm振荡培养2h；最后取100μl菌液均匀涂布于lb固体平板(amp抗性)上，26℃倒置培养36h，得到若干单克隆。(3)分别将各个单克隆涂板增菌(amp抗性，lb平板)，取少量菌体于无菌水中，99℃处理10min，离心，收集上清。(4)分别以上清为模板，以pkd46-f：5’-ggagcgcatggcagaacac-3’和pkd46-r：5’-cagagcggcaataagtcg-3’为引物进行pcr扩增。如果pcr扩增产物中含有893bp的dna片段，则对应的单克隆为阳性单克隆。阳性单克隆即含kd46质粒的鼠疫菌201株。将各个阳性单克隆甘油保种，-20℃保存。4、kana突变盒扩增以质粒pkd4为模板，采用2058-k-f和2058-k-r组成的引物对进行pcr扩增，得到约1500bp的pcr扩增产物，该pcr扩增产物即为带有同源臂的kana突变盒。5、含kd46质粒的鼠疫菌201株感受态细胞的制备按照步骤2的方法，将鼠疫菌201株替换为步骤3得到的阳性单克隆(即含kd46质粒的鼠疫菌201株)，其它步骤均不变，得到含kd46质粒的鼠疫菌201株感受态细胞。6、电转化(1)取含kd46质粒的鼠疫菌201株感受态细胞，加入1-2μg步骤4得到的pcr扩增产物，充分混匀后冰浴10min，再加入预冷的电击杯(直径1mm)。(2)完成步骤1后，将所述电击杯置于电转仪中进行电击(电击参数为25μf、200ω、2.5kv)。(3)完成步骤(2)后，取所述电击杯，加入1mllb液体培养基，混匀后吸至ep管(规格为1.5ml)中，26℃、200rpm振荡培养2h；最后取100μl菌液均匀涂布于lb固体平板(amp抗性和kana抗性)上，26℃倒置培养36h，得到若干单克隆。(4)分别将各个单克隆涂板增菌(amp抗性和kana抗性，lb平板)，取少量菌体于无菌水中，99℃处理10min，离心，收集上清。(5)分别以上清为模板，以引物对甲(由2058-i-f和kana-i-r组成，用于进行上搭桥pcr鉴定)、引物对乙(由kana-i-f和2058-i-r组成，用于进行下搭桥pcr鉴定)或引物对丙(由2058-n-f和2058-n-r组成，用于进行基因内部pcr鉴定)为引物进行pcr扩增。如果某单克隆采用引物对甲扩增得到的pcr扩增产物中含有约500bp的dna片段，采用引物对乙扩增得到的pcr扩增产物中含有约500bp的dna片段，采用引物对丙扩增得到的pcr扩增无条带，则该单克隆为阳性单克隆。将阳性单克隆甘油保种，-80℃保存。7、pkd46质粒消除(1)分别取步骤6得到的阳性单克隆，接种于lb液体培养基，37℃、200rpm振荡培养48h，得到菌液。(2)完成步骤(1)后，取100μl菌液，用lb液体培养基稀释1000倍后均匀涂布于lb固体平板(两种类型的lb固体平板，一种为kana抗性，另一种为amp抗性)上，26℃倒置培养36h。如果某阳性单克隆在lb固体平板(kana抗性)出现克隆，而lb固体平板(amp抗性)没有出现克隆，说明该阳性单克隆的pkd46质粒已消除。挑取lb固体平板(kana抗性)上的单克隆(即鼠疫菌δyp_2058)，甘油保种，-80℃保存。二、yp_2058基因回补株(即鼠疫菌δyp_2058回补株)的构建1、pbad24质粒的提取(1)将含pbad24质粒的大肠杆菌dh5α接种于5mllb液体培养基，37℃、200rpm振荡培养至对数期，得到培养菌液。(2)取步骤(1)得到的培养菌液，用质粒小提试剂盒提取质粒，得到pbad24质粒(约4542bp)。2、构建重组质粒pbad24-yp_2058(1)以鼠疫菌201株的基因组dna为模板，采用2058-f和2058-r组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。(2)取步骤(1)得到的pcr扩增产物，回收约600bp的dna片段。(3)取步骤(2)回收的dna片段，采用限制性内切酶nheⅰ和hindiii酶切，回收酶切片段。(4)取pbad24质粒，采用限制性内切酶nheⅰ和hindiii酶切，回收约4kb的载体骨架。(5)将步骤(3)回收的酶切片段和步骤(4)回收的载体骨架进行连接，得到重组质粒pbad24-yp_2058。将重组质粒pbad24-yp_2058进行测序。根据测序结果，对重组质粒pbad24-yp_2058描述如下：将pbad24质粒的限制性内切酶nheⅰ和hindiii识别序列间的小片段替换为seqidno：1所示的dna分子。3、制备鼠疫菌δyp_2058感受态细胞按照步骤一中2的方法，将鼠疫菌201株替换为鼠疫菌δyp_2058，其它步骤均不变，得到鼠疫菌δyp_2058感受态细胞。4、电转化(1)取鼠疫菌δyp_2058感受态细胞，加入200μg重组质粒pbad24-yp_2058，混匀后加入预冷的电击杯，冰浴10min，然后置于电转仪中进行电击(电击参数为25μf、200ω、2.5kv)。(2)完成步骤(1)后，取所述电击杯，加入1mllb液体培养基，混匀后吸至ep管(规格为1.5ml)中，26℃、200rpm振荡培养2h；最后取100μl菌液均匀涂布于lb固体平板(amp抗性和kana抗性)上，26℃倒置培养36h，得到若干单克隆。(3)分别将各个单克隆涂板增菌(amp抗性，lb平板)，取少量菌体于无菌水中，99℃处理10min，离心，收集上清。(4)分别以上清为模板，以2058-f和2058-r为引物进行pcr扩增。如果pcr扩增产物中含有约600bp的dna片段，则对应的单克隆为阳性单克隆。将各个阳性单克隆(即鼠疫菌δyp_2058回补株)甘油保种，-80℃保存。采用免疫印迹法检测待测菌(鼠疫菌201株、鼠疫菌δyp_2058或鼠疫菌δyp_2058回补株)的yp_2058蛋白在其菌液上清和菌液沉淀中的表达情况。结果表明，yp_2058蛋白在鼠疫菌201株的菌液上清和菌液沉淀中均表达，yp_2058蛋白在鼠疫菌δyp_2058的菌液上清和菌液沉淀中均没有表达，yp_2058蛋白在鼠疫菌δyp_2058回补株的菌液上清和菌液沉淀中均有表达且表达量高于鼠疫菌201株。实施例3、耐酸实验最小培养基记载于如下文献中：fsebbane，cojarrett，jrlinkenhoker，bjhinnebusch.evaluationoftheroleofconstitutiveisocitratelyaseactivityinyersiniapestisinfectionofthefleavectorandmammalianhost.infection&immunity，2004，72(12)：7334-7.待测菌下降的百分比＝在含20mm葡萄糖的最小培养基(ph3.5)中的菌数/在含20mm葡萄糖的最小培养基(ph6.5)中的菌数×100％。一、实验一(1)取待测菌(鼠疫菌δyp_2058或鼠疫菌201株)，接种于lb液体培养基，26℃、200rpm振荡培养至对数期，得到菌液1。(2)取菌液1，接种于lb液体培养基(接种比为1:50)，26℃、200rpm振荡培养，得到od620nm值为1.0的菌液2。(3)取菌液2，用含20mm葡萄糖的最小培养基(ph6.5)或含20mm葡萄糖的最小培养基(ph3.5)稀释100倍，得到菌液稀释液。(4)取菌液稀释液，静置30min，然后倍比稀释，涂板计数，计算静置30min时待测菌下降的百分比。二、实验二(1)取鼠疫菌δyp_2058回补株，接种于lb液体培养基，26℃、200rpm振荡培养至对数期，得到菌液1。(2)取菌液1，接种于lb液体培养基(接种比为1:50)，26℃、200rpm振荡培养，得到od620nm值为0.8的菌液2。(3)取菌液2，加入阿拉伯糖，得到诱导体系；该诱导体系中，阿拉伯糖的浓度为0.2％(m/v)。(4)取所述诱导体系，26℃、200rpm振荡培养2h，得到菌液3。(5)取菌液3，用含20mm葡萄糖的最小培养基(ph6.5)或含20mm葡萄糖的最小培养基(ph3.5)稀释100倍，得到菌液稀释液。(6)取菌液稀释液，静置30min，然后倍比稀释，涂板计数，计算静置30min时鼠疫菌δyp_2058回补株下降的百分比。实验结果见图1(1为鼠疫菌201株，2为鼠疫菌δyp_2058，3为鼠疫菌δyp_2058回补株)。结果表明，与鼠疫菌201株相比，鼠疫菌δyp_2058的耐酸能力显著下降；鼠疫菌δyp_2058回补株的耐酸能力能够恢复90％。实施例4、生长曲线1、取鼠疫菌δyp_2058回补株的单克隆，接种于lb液体培养基，26℃、200rpm振荡培养，得到od620nm值为0.8的菌液1。2、取菌液1，加入阿拉伯糖，得到诱导体系；该诱导体系中，阿拉伯糖的浓度为0.2％(m/v)。3、取所述诱导体系，26℃、200rpm振荡培养2h，得到菌液2。4、取菌液2，接种于lb液体培养基(接种比为1:50)，26℃、200rpm振荡培养，测定不同培养时间时菌液的od620nm值。以培养时间为横坐标，对应的菌液od620nm值为纵坐标，绘制生长曲线。取待测菌(鼠疫菌δyp_2058或鼠疫菌201株)的单克隆，接种于lb液体培养基，26℃、200rpm振荡培养，测定不同培养时间时菌液的od620nm值。以培养时间为横坐标，对应的菌液od620nm值为纵坐标，绘制生长曲线。实验结果见图2。结果表明，与鼠疫菌201株相比，鼠疫菌δyp_2058生长速度均明显降低，达到平台期的时间明显滞后，生长状态受到显著抑制；yp_2058基因回补后(即鼠疫菌δyp_2058回补株)，生长状态恢复正常。实施例5、小鼠毒力实验一、腹股沟皮下途径取30只balb/c小鼠，随机分为突变组、回补株和对照组三组(每组10只)。进行如下处理：突变组：实验第1d，每只小鼠腹股沟皮下注射100cfu鼠疫菌δyp_2058；然后正常喂养14d；期间观察小鼠的生存情况；回补组：实验第1d，每只小鼠腹股沟皮下注射100cfu鼠疫菌δyp_2058回补株；然后正常喂养14d；期间观察小鼠的生存情况；对照组：实验第1d，每只小鼠腹股沟皮下注射100cfu鼠疫菌201株；然后正常喂养14d；期间观察小鼠的生存情况。实验结果见表2。结果表明，回补组和对照组的小鼠在第5d开始死亡且第5-7d全部死亡；突变组在第7d开始死亡且第7-12d全部死亡。由此可见，与鼠疫菌201株相比，鼠疫菌δyp_2058的毒力显著下降；鼠疫菌δyp_2058回补株能够完全回补毒力，排除极性突变。表2-1表2-2用graphpadprism软件(网址为：https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/)绘制各组小鼠的生存曲线绘制，结果见图3。用graphpadprism软件自带的卡方检验方法logrank与gehan-breslow-wilcoxon分析各组之间的差异是否具有统计学意义。对照组和突变组的差异统计结果见表3，对照组和回补组的差异统计结果见表4。结果表明，对照组和突变组的差异统计结果中p值<0.0001，有显著统计学差异；对照组和回补组的差异统计结果中p值为0.4930，没有显著差异。表3表4生存曲线比较时序检验卡方0.4930自由度1p值0.4826p值汇总无显著性差异生存曲线是否有显著性差异否gehan-breslow-wilcoxon检验卡方0.6420自由度1p值0.4230p值汇总无显著性差异生存曲线是否有显著性差异否二、尾静脉途径取30只balb/c小鼠，随机分为突变组、回补株和对照组三组(每组10只)。进行如下处理：突变组：实验第1d，每只小鼠尾静脉注射100cfu鼠疫菌δyp_2058；然后正常喂养14d；期间观察小鼠的生存情况；回补组：实验第1d，每只小鼠尾静脉注射100cfu鼠疫菌δyp_2058回补株；然后正常喂养14d；期间观察小鼠的生存情况；对照组：实验第1d，每只小鼠尾静脉注射100cfu鼠疫菌201株；然后正常喂养14d；期间观察小鼠的生存情况。实验结果见表5。结果表明，对照组的小鼠在第3d开始死亡且第3-4d全部死亡；回补组的小鼠在第3d开始死亡且第3-5d全部死亡；突变组的小鼠在第5d开始死亡且第5-8d全部死亡。由此可见，与鼠疫菌201株相比，鼠疫菌δyp_2058的毒力显著下降；鼠疫菌δyp_2058回补株能够完全回补毒力，排除极性突变。表5-1表5-2用graphpadprism软件绘制各组小鼠的生存曲线绘制，结果见图4。用graphpadprism软件自带的卡方检验方法logrank与gehan-breslow-wilcoxon分析各组之间的差异是否具有统计学意义。对照组和突变组的差异统计结果见表6，对照组和回补组的差异统计结果见表7。结果表明，对照组和突变组的差异统计结果中p值<0.0001，有显著统计学差异；对照组和回补组的差异统计结果中p值为1.339，没有显著差异。表6生存曲线比较时序检验卡方21.19自由度1p值＜0.0001p值汇总***生存曲线是否有显著性差异是gehan-breslow-wilcoxon检验卡方18.46自由度1p值＜0.0001p值汇总***生存曲线是否有显著性差异是表7三、滴鼻感染途径取30只balb/c小鼠，随机分为突变组、回补株和对照组三组(每组10只)。进行如下处理：突变组：实验第1d，每只小鼠滴鼻注射100cfu鼠疫菌δyp_2058；然后正常喂养14d；期间观察小鼠的生存情况；回补组：实验第1d，每只小鼠滴鼻注射100cfu鼠疫菌δyp_2058回补株；然后正常喂养14d；期间观察小鼠的生存情况；对照组：实验第1d，每只小鼠滴鼻注射100cfu鼠疫菌201株；然后正常喂养14d；期间观察小鼠的生存情况。实验结果见表8。结果表明，对照组的小鼠在第3d开始死亡且第3-5d全部死亡；回补组的小鼠在第3d开始死亡且第3-6d全部死亡；突变组的小鼠在第5d开始死亡且第5-12d全部死亡。由此可见，与鼠疫菌201株相比，鼠疫菌δyp_2058的毒力显著下降；鼠疫菌δyp_2058回补株能够完全回补毒力，排除极性突变。表8-1表8-2用graphpadprism软件绘制各组小鼠的生存曲线绘制，结果见图5。用graphpadprism软件自带的卡方检验方法logrank与gehan-breslow-wilcoxon分析各组之间的差异是否具有统计学意义。对照组和突变组的差异统计结果见表9，对照组和回补组的差异统计结果见表10。结果表明，对照组和突变组的差异统计结果中p值<0.0001，有显著统计学差异；对照组和回补组的差异统计结果中p值为2.19，没有显著差异。表9表10生存曲线比较时序检验卡方2.190自由度1p值0.1389p值汇总无显著性差异生存曲线是否有显著性差异否gehan-breslow-wilcoxon检验卡方1.436自由度1p值0.2308p值汇总无显著性差异生存曲线是否有显著性差异否上述结果表明，yp_2058蛋白对鼠疫耶尔森菌的毒力有重要影响。<110>中国人民解放军军事科学院军事医学研究院<120>yp_2058蛋白在调控鼠疫耶尔森菌毒力中的应用<160>2<170>patentinversion3.5<210>1<211>600<212>dna<213>鼠疫耶尔森氏菌（yersiniapestis）<400>1atgatggagataggtactttttcattatctaacgtagatactgatcatttgattgctgac60ccaactgggattaaatcgattaaaacggtatgcgatcttcatatcgtcgaactggctcaa120gtcgataatgaaaaaaaactgcatatagcagaaatagataaaggtattagtgctgtactg180ccgggcattgattcgtgcattgggataattataaaaacagacttagggaaaattatcgcc240tcccatgttgggatatatgattgcggtgtggataaaggatttgatgccaacaaatttgat300gagagcgtttacgcaaacattgagtcagaaaacatgcgcagttcgatagcgcttattact360gatgatctaaaaaagatgataggtaaaaataaaatatctgaaatcatgatcatcggacaa420gatgcgggtagtgaatggcctcatcaacagttaaatgatttggcgaaagaactgggcttt480tctggcgagttaataatttgtgggcataaagaaggggtaaatacaacatgctctgtgatt540atagacagcgctggggatatatctatattgaatcgagatggaaagagaatagagatttaa600<210>2<211>199<212>prt<213>鼠疫耶尔森氏菌（yersiniapestis）<400>2metmetgluileglythrpheserleuserasnvalaspthrasphis151015leuilealaaspprothrglyilelysserilelysthrvalcysasp202530leuhisilevalgluleualaglnvalaspasnglulyslysleuhis354045ilealagluileasplysglyileseralavalleuproglyileasp505560sercysileglyileileilelysthraspleuglylysileileala65707580serhisvalglyiletyraspcysglyvalasplysglypheaspala859095asnlyspheaspgluservaltyralaasnileglusergluasnmet100105110argserserilealaleuilethraspaspleulyslysmetilegly115120125lysasnlysilesergluilemetileileglyglnaspalaglyser130135140glutrpprohisglnglnleuasnaspleualalysgluleuglyphe145150155160serglygluleuileilecysglyhislysgluglyvalasnthrthr165170175cysservalileileaspseralaglyaspileserileleuasnarg180185190aspglylysargilegluile195当前第1页12