一种猪种布鲁氏菌IalB基因缺失菌株及其构建方法和应用与流程

本发明涉及一种猪种布鲁氏菌invasionassociatedlocusb(ialb)基因缺失菌株的构建方法，属于生物技术领域。

背景技术：

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌(brucella)引起的一种人兽共患传染病，主要引起患病动物流产和不育，在人上主要表现为波状热、骨关节炎症、生殖系统炎症等，严重威胁人类的生命健康和畜牧业的健康、可持续发展。疫苗免疫接种是预防布鲁氏菌病最有效的手段，但是目前我国市售布鲁氏菌病疫苗在免疫保护力和区分野毒感染与疫苗接种方面尚存在诸多不足，而且全球范围内尚没有有效的人用布鲁氏菌病疫苗。因此，布鲁氏菌病疫苗的研制及相关研究亟待深入。

布鲁氏菌是一种革兰氏阴性、兼性胞内寄生菌，球杆状，无荚膜，无鞭毛，不形成芽胞，以专业和非专业吞噬细胞为宿主细胞。布鲁氏菌进化出了多种毒力因子和毒力系统，一旦进入宿主细胞即通过各种毒力因子干扰、逃避宿主的免疫杀伤机制，建立胞内增殖，引起慢性感染。目前研究发现，外膜蛋白(outmembraneproteins,omps)、磷酸脂多糖(lipopolysaccharide,lps)、virbiv型分泌系统、bvrr/bvrs双组份系统、核蛋白l7/l12、群体感应系统等是参与布鲁氏菌感染的重要毒力因子，大都具有较强的免疫保护活性，且大部分组分是膜相关分子。

invasionassociatedlocusb(ialb)最早是在巴尔通体中发现的一种内膜蛋白质，是巴尔通体侵染宿主细胞必要的毒力因子。在布鲁氏菌中，有研究发现ialb参与了布鲁氏菌对热应激的反应，但其具体作用仍未可知。我们的研究发现，ialb基因缺失对布鲁氏菌的生长活性具有显著影响，表明ialb缺失菌株具有制备减毒活疫苗及其相关检测方法的潜力。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种猪种布鲁氏菌invasionassociatedlocusb(ialb)基因缺失菌株及其构建方法和应用，所要解决的技术问题是将猪种布鲁氏菌s2疫苗株进行ialb基因缺失，进一步减弱其毒性，提高其在疫苗研制和相配套检测方法建立方面的可用性、有效性。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

一种猪种布鲁氏菌invasionassociatedlocusb(ialb)基因缺失菌株，其特殊之处在于：用卡那霉素抗性基因替换猪种布鲁氏菌ialb基因获得。

一种猪种布鲁氏菌ialb基因缺失菌株的构建方法，其特殊之处在于，包括以下步骤：

(1)根据猪种布鲁氏菌基因组序列和pegfp-c1基因序列以及puc18质粒的酶切位点信息，设计所需pcr引物；

(2)以布鲁氏菌s2疫苗株基因组为模板，pcr扩增获得ialb上、下游同源臂ialb-up和ialb-dw；以pegfp-c1质粒为模板，pcr扩增获得卡那霉素抗性基因kanr；

(3)将步骤(2)得到的基因片段分别与pmd19t-simple载体连接，获得相应的重组质粒pmd19t-ialb-up、pmd19t-ialb-dw和pmd19t-kanr；

(4)将步骤(3)得到的重组质粒分别转化dh5α感受态细胞，挑取阳性转化子进行培养，提取相应重组质粒，送生物公司测序；

(5)将步骤(4)测序正确的重组质粒分别用相应的限制性内切酶进行双酶切，回收纯化ialb上、下游同源臂基因片段和kanr基因片段；

(6)将步骤(5)得到的基因片段等体积混合后与puc18载体进行连接，获得同源重组缺失质粒puc18-ialb-kanr；

(7)制备猪种布鲁氏菌感受态细胞备用；

(8)将步骤(6)得到的同源重组缺失质粒与步骤(7)所得的感受态细胞混匀，冰置10min，转移到预冷的1mm电击杯内，以2.5kv、4.5ms的条件进行电转化，立即加入1ml无抗tsb液体培养基，37℃、180rpm复苏12h，然后涂布含25μg/ml卡那霉素的tsa固体培养基，置于37℃培养72h，挑取单克隆菌落进行培养；

(9)将步骤(8)中得到的菌液置于70℃水浴灭活2h，然后用鉴定引物ialb-f/r进行pcr鉴定，筛选出ialb基因缺失菌株。

上述的猪种布鲁氏菌ialb基因缺失菌株的构建方法，其特征在于，制备猪种布鲁氏菌感受态细胞包括：将冻存于-80℃的猪种布鲁氏菌s2疫苗株于无抗性的tsa固体培养基上划线复苏，挑取单菌落接种于10ml无抗性tsb液体培养基中，37℃、180rpm培养48h，然后按照体积比1:100接种于50ml无抗性tsb液体培养基中扩大培养；当od600＝0.9时，将菌液置于冰上预冷30min，然后4500g离心20min，弃上清；用20ml预冷的ddh2o重悬菌体，4500g离心15min，弃上清，重复1次；然后用20ml预冷的10％甘油水溶液重悬菌体，4500g离心15min，弃上清，重复1次；最后用1ml预冷的10％甘油水溶液重悬菌体，以100μl的体积分装，-80℃冻存备用。

上述的猪种布鲁氏菌ialb基因缺失菌株的构建方法，其特征在于，所述引物组包括：

一种猪种布鲁氏菌ialb基因缺失菌株在制备布鲁氏菌减毒活疫苗中的应用。

一种猪种布鲁菌ialb基因缺失菌株在制备用于检测布鲁氏菌感染动物的检测试剂盒中的应用。

上述猪种布鲁菌ialb基因缺失菌株在制备用于检测布鲁氏菌感染动物的检测试剂盒中的应用，其特殊之处在于：所述试剂盒还包括ialb抗体检测试剂。

本发明的有益效果是：

本发明通过同源重组的方法，构建了猪种布鲁氏菌ialb基因缺失菌株，并证明ialb基因缺失会显著影响布鲁氏菌的生长活性，使布鲁氏菌表现出生长减慢、聚合度增强、活性降低等特点。本发明获得的猪种布鲁氏菌ialb基因缺失菌株为新的布鲁氏菌病减毒活疫苗研发及其相应检测方法的建立提供了理论和物质基础，也为研究ialb基因在布鲁氏菌中的生理功能提供了理论基础。

附图说明

图1为ialb基因上游同源臂pcr结果

m为dl5000dnamarker，1泳道为ialb基因上游同源臂ialb-uppcr产物。

图2为ialb基因下游同源臂pcr结果

m为dl5000dnamarker，1泳道为ialb基因下游同源臂ialb-dwpcr产物。

图3为卡那霉素抗性基因pcr结果

m为dl5000dnamarker，1泳道为卡那霉素抗性基因kanrpcr产物。

图4为pmd19t-ialb-up酶切鉴定结果

m为dl5000dnamarker，1泳道为pmd19t-ialb-up经sphi和sali双酶切的结果。

图5为pmd19t-ialb-dw酶切鉴定结果

m为dl5000dnamarker，1泳道为pmd19t-ialb-dw经spei和kpni双酶切的结果。

图6为pmd19t-kanr酶切鉴定结果

m为dl5000dnamarker，1泳道为pmd19t-ialb-kanr经sali和spei双酶切的结果。

图7为同源重组缺失质粒酶切鉴定结果

m为dl5000dnamarker，1泳道为puc18-ialb-kanr经sphi和kpni双酶切的结果。

图8为猪种布鲁氏菌ialb基因缺失菌株鉴定结果

m为dl5000dnamarker，1泳道为猪种布鲁氏菌活疫苗s2菌株的鉴定pcr产物，2泳道为猪种布鲁氏菌ialb基因缺失菌株的鉴定pcr产物。

图9为猪种布鲁氏菌ialb基因缺失菌株聚合度检测结果

a为猪种布鲁氏菌活疫苗s2株菌液和猪种布鲁氏菌ialb基因缺失株菌液室温静置24h后的聚合度，b为猪种布鲁氏菌活疫苗s2株菌液和猪种布鲁氏菌ialb基因缺失株菌液室温静置24h前后的菌液状况。

图10为猪种布鲁氏菌活疫苗s2株菌液和猪种布鲁氏菌ialb基因缺失株菌液调整至相同吸光值(600nm)时所含有的活菌浓度。

图11为猪种布鲁氏菌ialb基因缺失菌株pi染色结果

a为分别吸取猪种布鲁氏菌活疫苗s2株和猪种布鲁氏菌ialb基因缺失株2×10⁷cfu进行pi染色后的荧光强度，b为猪种布鲁氏菌活疫苗s2株菌液和猪种布鲁氏菌ialb基因缺失株菌液调整至相同吸光值(600nm)后分别吸取100μl菌液进行pi染色后的荧光强度。

具体实施方式

为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。

一种猪种布鲁氏菌invasionassociatedlocusb(ialb)基因缺失菌株的构建方法，具体步骤如下：

(1)引物设计：根据猪种布鲁氏菌基因组序列，设计ialb基因上、下游同源臂pcr引物ialb-uf/ialb-ur(分别含有sphi和sali酶切位点)和ialb-df/ialb-dr(分别含有spei和kpni酶切位点)；根据pegfp-c1基因序列，设计卡那霉素抗性基因pcr引物kanr-f/kanr-r(分别含有sali和spei酶切位点)；另外，根据猪种布鲁氏菌基因组序列，在ialb基因序列内部设计缺失菌株鉴定引物ialb-tf/ialb-tr。引物序列如下：

(2)目的片段获得：以提取的猪种布鲁氏菌s2疫苗株基因组为模板，利用pcr引物ialb-uf/ialb-ur和ialb-df/ialb-drpcr扩增获得ialb基因上、下游同源臂基因片段ialb-up和ialb-dw；以pegfp-c1质粒为模板，利用pcr引物kanr-f/kanr-rpcr扩增获得卡那霉素抗性基因片段kanr。将获得的ialb-up、ialb-dw和kanr与pmd19t-simple克隆载体进行t-a连接，获得重组质粒pmd19t-ialb-up、pmd19t-ialb-dw和pmd19t-kanr。将上述重组质粒分别热激转化dh5α感受态细胞，37℃、180rpm复苏1h后涂布含有60μg/ml氨苄霉素的lb固体培养基，次日分别挑取阳性转化子，37℃、180rpm培养16h，然后提取相应重组质粒。将提取的pmd19t-ialb-up、pmd19t-ialb-dw和pmd19t-kanr重组质粒分别进行sphi/sali、spei/kpni和sali/spei双酶切鉴定，酶切鉴定正确的质粒送生物公司进行测序。

(3)同源重组缺失质粒构建：将步骤(2)测序正确的重组质粒pmd19t-ialb-up、pmd19t-ialb-dw和pmd19t-kanr分别进行sphi/sali、spei/kpni和sali/spei双酶切，酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，分别回收纯化ialb上、下游同源臂基因片段ialb-up、ialb-dw和卡那霉素抗性基因片段kanr。将上述纯化的基因片段等体积混合，与经sphi/kpni双酶切的puc18于16℃连接过夜，获得用于ialb基因缺失的同源重组缺失质粒puc18-ialb-kanr。上述连接产物热激转化dh5α感受态细胞，37℃、180rpm复苏1h后涂布含有25μg/ml卡那霉素的lb固体培养基，次日分别挑取阳性转化子，37℃、180rpm培养16h，然后提取相同源重组缺失质粒。对提取的puc18-ialb-kanr进行sphi/kpni双酶切鉴定，鉴定正确的质粒送生物公司进行测序。

(4)猪种布鲁氏菌感受态制备：将冻存于-80℃的猪种布鲁氏菌s2疫苗株于无抗性的tsa固体培养基上划线复苏，挑取单菌落接种于10ml无抗性tsb液体培养基中，37℃、180rpm培养48h，然后按照体积比1:100接种于50ml无抗性tsb液体培养基中扩大培养；当od600＝0.9时，将菌液置于冰上预冷30min，然后4℃、4500g离心20min，弃上清；用20ml预冷的ddh2o重悬菌体，4℃、4500g离心15min，弃上清，重复1次；然后用20ml预冷的10％甘油水溶液重悬菌体，4℃、4500g离心15min，弃上清，重复1次；最后用1ml预冷的10％甘油水溶液重悬菌体，以100μl的体积分装，-80℃冻存备用。

(5)猪种布鲁氏菌ialb基因缺失菌株的筛选与鉴定：将步骤(4)制备的感受态细胞于冰上融化，取20μlpuc18-ialb-kanr与之混合，冰置10min，转移到预冷的1mm电击杯内，以2.5kv、4.5ms的条件进行电转化；电转化完成后立即加入1ml无抗tsb液体培养基，37℃、180rpm复苏12h，然后涂布含25μg/ml卡那霉素的tsa固体培养基，置于37℃培养72h；挑取单克隆菌落于tsb液体培养基中，37℃、180rpm培养48h，无菌吸取1ml菌液置于70℃水浴灭活2h，然后用鉴定引物ialb-f/r进行pcr鉴定。由于鉴定引物ialb-f/r是设计在ialb基因内部的，因此只有当ialb基因被完全替换之后才会出现pcr无条带的现象，也就表明获得了ialb基因缺失菌株。

实施例

同源重组缺失质粒的构建

1.引物设计

根据ncbi公布的猪种布鲁氏菌基因组序列(登录号：nc_017251.1)，设计ialb基因上、下游同源臂pcr引物ialb-uf/ialb-ur(分别含有sphi和sali酶切位点)和ialb-df/ialb-dr(分别含有spei和kpni酶切位点)，和在ialb基因序列内部的缺失菌株鉴定引物ialb-tf/ialb-tr；根据ncbi公布的pegfp-c1质粒基因序列(登录号：u55763.1)，设计卡那霉素抗性基因pcr引物kanr-f/kanr-r(分别含有sali和spei酶切位点)。引物序列如下：

2.目的片段的获得

(1)ialb基因上、下游同源臂ialb-up、ialb-dw的pcr

以猪种布鲁氏菌活疫苗s2株基因组为模板，用引物ialb-uf/ur和ialb-df/dr进行pcr，反应体系如下：

反应条件如下：

上述pcr反应结束后，pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，切取特异性目的条带，使用天根普通琼脂糖凝胶dna回收试剂盒，按照试剂盒说明书，回收纯化pcr产物。

结果如图1、2所示，分别于1060bp和1010bp处出现单一条带，分子量大小与预期相符。

(2)卡那霉素抗性基因kanr的pcr

以pegfp-c1质粒为模板，用引物kanr-f和kanr-r进行pcr，反应体系如下：

反应条件如下：

上述pcr反应结束后，pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，切取特异性目的条带，使用天根普通琼脂糖凝胶dna回收试剂盒，按照试剂盒说明书，回收纯化pcr产物。

结果如图3所示，于1375bp处出现单一条带，分子量大小与预期相符。

(3)pmd19t-ialb-up、pmd19t-ialb-dw重组质粒构建

利用takaraligationmix将步骤(1)、(2)回收纯化的ialb-up、ialb-dw和kanr分别与pmd19t-simple载体进行连接，获得重组质粒pmd19t-ialb-up、pmd19t-ialb-dw和pmd19t-kanr，反应体系如下：

上述反应体系16℃连接过夜，转化dh5α感受态细胞，涂含60μg/ml氨苄霉素的lb固体培养基，37℃培养过夜，次日挑取单克隆菌落，37℃、180rpm培养16h。

(4)pmd19t-ialb-up、pmd19t-ialb-dw和pmd19t-kanr重组质粒鉴定利用天根质粒小提中量试剂盒，按照试剂盒说明书，对步骤(3)中的菌液分别进行质粒提取，获得的pmd19t-ialb-up、pmd19t-ialb-dw和pmd19t-kanr重组质粒分别进行双酶切鉴定，反应体系如下：

上述反应体系37℃反应2h，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统观察酶切结果。对于酶切鉴定正确的重组质粒，送生物公司进行测序。

结果如图4、5、6所示，分别于2694bp和1060bp，2694bp和1010bp，2694bp和1375bp处出现特异性条带，表明重组质粒连接正确。

(5)ialb-up、ialb-dw和kanr片段的获得

对步骤(3)中测序正确的pmd19t-ialb-up、pmd19t-ialb-dw和pmd19t-kanr重组质粒分别进行双酶切，反应体系如下：

上述反应体系37℃反应过夜，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳，切取特异性目的条带，使用天根普通琼脂糖凝胶dna回收试剂盒，按照试剂盒说明书，回收纯化目的条带，即得ialb基因上、下游同源臂ialb-up、ialb-dw和卡那霉素抗性基因kanr。

3.puc18-ialb-kanr同源重组缺失质粒的构建

将回收纯化的ialb-up、ialb-dw和kanr等体积混合，然后利用takaraligationmix与puc18载体进行连接，获得同源重组缺失质粒puc18-ialb-kanr，反应体系如下：

上述反应体系16℃连接过夜，转化dh5α感受态细胞，涂含25μg/ml卡那霉素的lb固体培养基，37℃培养过夜，次日挑取单克隆菌落，37℃、180rpm培养16h。

4.同源重组缺失质粒puc18-ialb-kanr的鉴定

利用天根质粒小提中量试剂盒，按照试剂盒说明书，对步骤3中的菌液进行质粒提取，获得的同源重组缺失质粒puc18-ialb-kanr进行双酶切鉴定，反应体系如下：

上述反应体系37℃反应2h，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统观察酶切结果。对于酶切鉴定正确的重组质粒，送生物公司进行测序。

结果如图7所示，分别于2653bp、1279bp、927bp、763bp、386bp和72bp处出现特异性条带，表明同源重组缺失质粒连接正确。

猪种布鲁氏菌感受态细胞的制备

(1)将冻存于-80℃的猪种布鲁氏菌s2疫苗株于无抗性的tsa固体培养基上划线复苏，37℃培养72h；

(2)挑取单克隆菌落接种于10ml无抗性tsb液体培养基中，37℃、180rpm培养48h；

(3)按照体积比1：100的比例将上述菌液接种于50ml无抗性tsb液体培养基中，37℃、180rpm培养至菌液的od600＝0.9；

(4)将上述菌液置于冰上预冷30min，然后4℃、4500g离心20min，弃上清；

(5)用20ml预冷的ddh2o重悬菌体，4℃、4500g离心15min，弃上清，重复1次；

(6)用20ml预冷的10％甘油水溶液重悬菌体，4℃、4500g离心15min，弃上清，重复1次；

(7)用1ml预冷的10％甘油水溶液重悬菌体，以100μl的体积分装，-80℃冻存备用。

猪种布鲁氏菌ialb基因缺失菌株的筛选与鉴定。

1.布鲁氏菌感受态细胞电转化

(1)从-80℃取出布鲁氏菌感受态细胞，于冰上融化；

(2)吸取20μl同源重组缺失质粒puc18-ialb-kanr与感受态细胞混合，冰置10min；

(3)将上述混合物转移到预冷的1mm电击杯内，以2.5kv、4.5ms的条件进行电转化；

(4)立即加入1ml无抗tsb液体培养基，37℃、180rpm复苏12h；

(5)上述转化产物涂布含25μg/ml卡那霉素的tsa固体培养基，置于37℃培养72h；

(6)挑取单克隆菌落于10mltsb液体培养基中，37℃、180rpm培养48h；

(7)无菌吸取1ml上述菌液，置于70℃水浴灭活2h，剩余菌液于4℃暂存。

2.猪种布鲁氏菌ialb基因缺失菌株的pcr鉴定以步骤1的灭活菌液为模板，利用引物ialb-tf和ialb-tr对菌液样本进行pcr鉴定，反应体系如下：

反应条件如下：

上述pcr反应结束后，pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，然后用凝胶成像系统观察pcr结果。对鉴定正确的猪种布鲁氏菌ialb基因缺失菌株加入终浓度为25％的甘油，于-80℃冻存备用。

结果如图8所示，猪种布鲁氏菌活疫苗s2株在328bp处出现单一、特异性条带，而挑取的转化子则没有任何条带，表明所挑取的转化子即为猪种布鲁氏菌ialb基因缺失菌株。

猪种布鲁氏菌ialb基因缺失菌株聚合度测定

(1)将冻存于-80℃的猪种布鲁氏菌s2疫苗株和猪种布鲁氏菌ialb基因缺失菌株δialb分别于无抗性的tsa固体培养基和含有25μg/ml卡那霉素的tsa固体培养基上划线复苏，37℃培养72h；

(2)分别挑取单克隆菌落接种于10ml无抗性tsb液体培养基和含有25μg/ml卡那霉素的tsb液体培养基中，37℃、180rpm培养48h；

(3)分别上述菌液无菌吸取1ml，70℃水浴灭活2h，然后分别吸取200μl灭活菌液测定600nm处的吸光值；

(4)无菌吸取1ml后剩余的菌液室温静置24h，然后分别吸取上清1ml，70℃水浴灭活2h，同样分别吸取200μl灭活菌液测定600nm处的吸光值；

(5)根据以下公式计算两种菌株的聚合度

聚合度(％)＝([od全菌–od上清]/od全菌)×100

结果如图9所示，相比于猪种布鲁氏菌活疫苗s2株，猪种布鲁氏菌ialb基因缺失菌株的聚合度显著增强，表明缺失菌株的细胞外膜的特性发生了显著改变。

猪种布鲁氏菌ialb基因缺失菌株活性测定

(1)将冻存于-80℃的猪种布鲁氏菌s2疫苗株和猪种布鲁氏菌ialb基因缺失菌株δialb分别于无抗性的tsa固体培养基和含有25μg/ml卡那霉素的tsa固体培养基上划线复苏，37℃培养72h；

(2)分别挑取单克隆菌落接种于10ml无抗性tsb液体培养基和含有25μg/ml卡那霉素的tsb液体培养基中，37℃、180rpm培养48h；

(3)上述菌液4℃、5000g离心10min，无菌pbs重悬菌体，使两种菌在600nm处的吸光值(od600nm)相等；

(4)将上述菌液分别用无菌pbs进行10、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸倍稀释，涂布无抗性的tsa固体培养基，37℃培养72h，然后进行菌落计数；

(5)分别吸取菌量相同(2×10⁷cfu，稀释至100μl)或者体积相等(100μl)的上述两种菌液，与等体积的pi染液混匀，室温孵育20min，然后以激发波长535nm、发射波长615nm的条件测定荧光强度。

结果如图10和11所示，当吸光值相等时，相比于猪种布鲁氏菌活疫苗s2株，猪种布鲁氏菌ialb基因缺失菌株的活菌数显著降低，意味着δialb活性显著降低。

本申请的猪种布鲁氏菌ialb基因缺失菌株为brucellasuis-δialb，brucellasuis-δialb已进行保藏，保藏信息如下：

保藏日期：2019年12月5日；

保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏单位简称：cgmcc；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；

保藏编号：cgmccno.19090；

分类命名：猪布鲁氏菌(brucellasuis)。