一种高产戊二胺的大肠杆菌工程菌与方法与流程

文档序号：20684009发布日期：2020-05-08 18:40阅读：348来源：国知局

本发明属于生物催化技术领域，具体地，涉及一种高产戊二胺的大肠杆菌工程菌与方法。

背景技术：

1,5-戊二胺，又名1,5-二氨基戊烷、五亚甲基二胺、尸胺和尸毒素，是具有多种生物活性的天然多胺，其可通过赖氨酸脱羧酶(e.c.4.1.1.18)催化l-赖氨酸直接脱羧形成，并且广泛分布在原核生物和真核生物中。1，5-戊二胺在农业，医药和工业中具有广泛应用，特别是作为生物基聚酰胺的重要单体。戊二胺与不可再生化石燃料六亚甲基二胺相似的结构，可替代其合成常规聚酰胺，尤其是与可再生资源的二羧酸聚合生成生物基聚酰胺。因此，戊二胺是一种重要的工业化学品。

目前，戊二胺的生产方法主要包括微生物发酵法或全细胞生物转化法，菌种来源都是通过菌种改造来提高赖氨酸脱羧酶的表达量，往往都需采用昂贵诱导剂来诱导表达，从而大大提高了生产成本。关于微生物发酵法，其菌株通常由具有生产赖氨酸能力的谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌改造而来，存在的主要问题是发酵周期长，转化率低等；此外，发酵体系复杂，杂质多，戊二胺分离纯化困难，进而增加了生产成本。关于全细胞生物转化法，与微生物发酵法区别是先通过发酵富集菌株，再分离获得全细胞菌株，用于生物催化底物l-赖氨酸转化生成戊二胺，优点在于体系杂质少，易于纯化。但是，该方法存在的问题是传质效率低：细胞壁和细胞膜的天然屏障功能限制了底物l-赖氨酸向细胞胞内转运，以及细胞中积累的戊二胺产物的释放，从而降低了转化效率，限制了工业规模化生产。针对于现有方法的诸多问题，本发明开发了一种高产戊二胺的大肠杆菌工程菌和方法，包括外源表达l-赖氨酸脱羧酶的大肠杆菌工程菌制备方法，也包括大肠杆菌工程菌发酵制备和富含l-赖氨酸脱羧酶的全细胞透性处理，还包括高产率的戊二胺催化制备。

技术实现要素：

本发明的目的在于开发一种能够利用l-赖氨酸盐酸盐高效生产戊二胺的方法以及用于该方法的外源表达赖氨酸脱羧酶的大肠杆菌工程菌。该方法无需诸如昂贵的itpg诱导剂，传质效率高，转化率高，生产成本低。

为了实现了上述目的，本发明的技术方案如下：

一种高产戊二胺的大肠杆菌工程菌，所述大肠杆菌tju-cada-1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为大肠埃希氏菌(escherichiacoli)，保藏编号为cgmccno.17454。保藏日期为2019年3月28日。

本发明的高产戊二胺的大肠杆菌工程菌的制备方法，包含如下步骤：

1)以序列seq.1和seq.2为引物，以pet-22b空载质粒作为模板，通过pcr扩增获得pet-22b载体dna序列，序列为seq.3；

2)以序列seq.4和seq.5为引物，以大肠杆菌基因组为模板，通过菌落pcr扩增获得pcad启动子序列，序列为seq.6；

3)以序列seq.7和seq.8为引物，以大肠杆菌基因组为模板，通过菌落pcr扩增获得l-赖氨酸脱羧酶dna序列，序列为seq.9；

4)通过peasy-uniseamlesscloningandassemblyki技术手段将序列seq.3,seq.6和seq.9连接成环形成重组质粒pet-22b-cada，序列为seq.10；通过cacl2转化法将重组质粒pet-22b-cada转入大肠杆菌bl21(de)获得大肠杆菌工程菌tju-cada-1。

利用本发明的大肠杆菌工程菌高产戊二胺的的方法，包含以下步骤：

1)大肠杆菌工程菌tju-cada-1发酵；

2)对发酵所得的大肠杆菌工程菌tju-cada-1进行透性处理，离心后获得透性细胞；

3)以l-赖氨酸盐酸盐为底物，采用步骤2)所述的透性细胞催化制备高产率的戊二胺。

所述步骤1)的发酵方法是：将大肠杆菌工程菌tju-cada-1接种至每升含有1～50g酵母粉、1～50g蛋白胨、1～30gnacl、1～1000mg氨苄的液体培养基中，在16～45℃，50～350rpm条件下，外源表达l-赖氨酸脱羧酶，培养1～24h后，离心收集富含l-赖氨酸脱羧酶的全细胞。

所述步骤2)的透性处理是采用有机溶剂与水体积比为15％～50％的有机溶液，透性处理富含l-赖氨酸脱羧酶的全细胞，处理条件为0～40℃，50～300rpm，处理时间为1min～2h，透性处理结束后，离心收集富含l-赖氨酸脱羧酶的透性细胞。

所述的有机溶剂包括甲醇、乙醇、甲苯或氯仿。

所述步骤3)是在反应釜中加入浓度为100～500g/l的底物l-赖氨酸盐酸盐、浓度为0.1mmol～100mmol的ph5.6的na2hpo4柠檬酸缓冲液、浓度为1～20g/l的透性细胞和浓度为0.0001～0.1mm的磷酸吡哆醛，在温度为30～45℃，转速为50～400rpm条件下催化制备戊二胺，催化时间为6～24h，戊二胺产率达到90％～100％。

本发明提供一种高产戊二胺的大肠杆菌工程菌与方法，与现有戊二胺生产技术相比具有以下优点：

(1)本发明所述的发酵制备赖氨酸脱羧酶的大肠杆菌工程菌，在发酵过程中，无需添加诱导剂即可实现赖氨酸脱羧酶的外源表达。此方法节省发酵过程中昂贵的诱导剂费用，大大降低了生产成本。

(2)本发明所述的方法中，将富含l-赖氨酸脱羧酶的全细胞透性处理后，离心收集富含l-赖氨酸脱羧酶的透性细胞，此方法有效的提高了细胞膜的通透性，解决了传质效率低的问题。有效的促进了底物l-赖氨酸向细胞胞内转运，以及细胞内累积产物戊二胺的释放，解除了底物以及产物对赖氨酸脱羧酶的抑制作用，提高了戊二胺的产率，而且还大幅缩短了生产周期，有效提高了生产效率。

(3)本发明所述的方法中，戊二胺产率高达98％以上，而且生产时间短，具有很高的产率以及生产效率，并且通过无需诱导剂大肠杆菌工程菌的构建和提高传质效率的透性处理方法的建立降低了戊二胺的生产成本，故该法适用于工业化生产，且具有广阔的市场前景。

(4)构建外源表达l-赖氨酸脱羧酶的大肠杆菌工程菌tju-cada-1，l-赖氨酸脱羧酶的酶活是空载菌株的100倍左右；将富含l-赖氨酸脱羧酶全细胞透性处理，透性细胞的l-赖氨酸脱羧酶的酶活是全细胞的3～4.5倍；利用透性细胞催化l-赖氨酸盐酸盐生产戊二胺，戊二胺产率在90％～100％，浓度可达220g/l以上。

(5)本发明利用l-赖氨酸盐酸盐高效生产戊二胺，与现有工艺相比，无需诸如昂贵的iptg诱导剂，传质效率高，产率高，生产成本低，更具经济可行性和实用性。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。对本发明内容所做的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。

实施例1.高产戊二胺的大肠杆菌工程菌的制备方法

以序列seq.1和seq.2为引物，以pet-22b空载质粒作为模板，通过pcr扩增获得pet-22b载体dna序列，序列为seq.3。以序列seq.4和seq.5为引物，以大肠杆菌基因组为模板，通过菌落pcr扩增获得pcad启动子序列，序列为seq.6。以序列seq.7和seq.8为引物，，以大肠杆菌基因组为模板，通过菌落pcr扩增获得l-赖氨酸脱羧酶dna序列，序列为seq.9。通过peasy-uniseamlesscloningandassemblyki技术手段将序列seq.3,seq.6和seq.9连接成环形成重组质粒pet-22b-cada，序列为seq.10。通过cacl2转化法将重组质粒pet-22b-cada转入大肠杆菌bl21(de3)获得大肠杆菌工程菌tju-cada-1。大肠杆菌tju-cada-1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为大肠埃希氏菌(escherichiacoli)，保藏编号为cgmccno.17454。

实施例2.发酵制备大肠杆菌工程菌tju-cada-1

将空载大肠杆菌bl21(de3)和大肠杆菌工程菌tju-cada-1分别接种至2瓶100ml含1g/l酵母粉、1g/l蛋白胨、1g/lnacl、1mg/l氨苄的液体培养基中，在16℃，50rpm条件下，外源表达l-赖氨酸脱羧酶，培养1h后，取样1ml发酵液，离心收集富含l-赖氨酸脱羧酶的大肠杆菌工程菌tju-cada-1，进行酶活测定。发酵1h的实验结果如下：空载菌体的细胞密度od600为0.483，酶活为0.032u/mg；大肠杆菌工程菌tju-cada-1的细胞密度od600为0.417，酶活为5.108u/mg；

将空载大肠杆菌bl21(de3)和大肠杆菌工程菌tju-cada-1分别接种至2瓶100ml含25g/l酵母粉、25g/l蛋白胨、15g/lnacl、500mg/l氨苄的液体培养基中，在30℃，200rpm条件下，外源表达l-赖氨酸脱羧酶，培养12h后，取样1ml发酵液，离心收集富含l-赖氨酸脱羧酶的大肠杆菌工程菌tju-cada-1，进行酶活测定。发酵12h的实验结果如下：空载菌体的细胞密度od600为7.256，酶活为0.063u/mg；大肠杆菌工程菌tju-cada-1的细胞密度od600为7.159，酶活为6.259u/mg；

将空载大肠杆菌bl21(de3)和大肠杆菌工程菌tju-cada-1分别接种至2瓶100ml含50g/l酵母粉、50g/l蛋白胨、30g/lnacl、1000mg/l氨苄的液体培养基中，在45℃，350rpm条件下，外源表达l-赖氨酸脱羧酶，培养24h后，取样1ml发酵液，离心收集富含l-赖氨酸脱羧酶的大肠杆菌工程菌tju-cada-1，进行酶活测定。发酵24h的实验结果如下：空载菌体的细胞密度od600为8.257，酶活为0.056u/mg；大肠杆菌工程菌tju-cada-1的细胞密度od600为8.149，酶活为6.986u/mg；

由此可见，大肠杆菌工程菌tju-cada-1无需诱导剂外源表达赖氨酸脱羧酶的酶活大约是空载大肠杆菌的100倍，明显高于空载大肠杆菌，更适于用来催化制备戊二胺。

酶活定义：1u/mg等于每分钟每毫克细胞催化生成1umol戊二胺。

酶活测定方法：取1ml发酵液8000rpm离心5min，去上清液，加入1ml浓度为30％的乙醇溶液重悬菌体2min，8000rpm离心5min，去上清液，再加入1mll-赖氨酸盐酸盐浓度为150g/l的pbs缓冲液(100mm,ph5.6)和终浓度为0.01mm的磷酸吡哆醛，在37℃，150rpm条件下反应30min后，加入300ulph9.5的过饱和nahco3-naoh缓冲液，1ml浓度为5g/l的丹磺酰氯溶液，水浴45min，加入200ul氨水和2.7ml甲醇，液相检测戊二胺浓度。

hplc高效液相色谱条件：流动相是甲醇和水体积比为8:2的混合液；流速为1ml/min；柱温为40℃；波长为254nm，进样量为10ul。

实施例3.透性处理大肠杆菌tju-cada-1

分别取2瓶实例2所得的发酵液80ml，离心获得富含l-赖氨酸脱羧酶的大肠杆菌工程菌tju-cada-1。其一用于透性处理，另一不作处理。透性处理组加入体积比为15％的甲醇溶液重悬菌体，在0℃，50rpm的条件下处理1min后，离心收集富含l-赖氨酸脱羧酶的透性细胞。将上述的大肠杆菌工程菌tju-cada-1和透性细胞分别利用na2hpo4-柠檬酸溶液(100mm，ph5.6)重悬至菌体浓度为1g/l，用于实施例4的催化反应，并进行酶活测定。酶活测定结果如下：未透性处理的大肠杆菌工程菌tju-cada-1中l-赖氨酸脱羧酶的酶活为1.569u/mg，透性细胞的酶活为4.956u/mg。

分别取2瓶实例2所得的发酵液80ml，离心获得富含l-赖氨酸脱羧酶的大肠杆菌工程菌tju-cada-1。其一用于透性处理，另一不作处理。透性处理组加入体积比为40％的乙醇溶液重悬菌体，在20℃，180rpm的条件下处理1h后，离心收集富含l-赖氨酸脱羧酶的透性细胞。将上述的未透性处理的大肠杆菌工程菌tju-cada-1和透性细胞分别利用na2hpo4-柠檬酸溶液(100mm，ph5.6)重悬至菌体浓度为10g/l，用于实施例4的催化反应，并进行酶活测定。酶活测定结果如下：未透性处理的大肠杆菌工程菌tju-cada-1中l-赖氨酸脱羧酶的酶活为1.885u/mg，透性细胞的酶活为6.935u/mg。

分别取2瓶实例2所得的发酵液80ml，离心获得富含l-赖氨酸脱羧酶的大肠杆菌工程菌tju-cada-1。其一用于透性处理，另一不作处理。透性处理组加入体积比为50％的甲苯溶液重悬菌体，在40℃，300rpm的条件下处理2h后，离心收集富含l-赖氨酸脱羧酶的透性细胞。将上述的未透性处理的大肠杆菌工程菌tju-cada-1和透性细胞分别利用na2hpo4-柠檬酸溶液(100mm，ph5.6)重悬至菌体浓度为20g/l，用于实施例4的催化反应，并进行酶活测定。酶活测定结果如下：未透性处理的大肠杆菌工程菌tju-cada-1中l-赖氨酸脱羧酶的酶活为1.489u/mg，透性细胞的酶活为6.524u/mg。

由此可见，富含l-赖氨酸脱羧酶的透性细胞酶活大约是未透性处理的3～4.5倍，明显高于全细胞，更适于用来催化制备戊二胺。

酶活的定义、测定方法及hplc高效液相色谱条件如实施例2所述。

实施例4.催化制备高产率的戊二胺

向实施例4中含透性细胞浓度为1g/l的na2hpo4-柠檬酸溶液(0.1mm，ph5.6)中，加入浓度为0.0001mmol/l的磷酸吡哆醛和浓度为100g/l的底物l-赖氨酸盐酸盐，在30℃，50rpm水浴摇床中转化反应6小时后进行戊二胺浓度检测。检测结果如下：戊二胺浓度为50.38g/l，产率为90.19％。

向实施例4中含透性细胞浓度为10g/l的na2hpo4-柠檬酸溶液(100mm，ph5.6)中，加入浓度为0.1mmol/l的磷酸吡哆醛和浓度为400g/l的底物l-赖氨酸盐酸盐，在40℃，250rpm水浴摇床中转化反应18小时后进行戊二胺浓度检测。检测结果如下：戊二胺浓度为221g/l，产率为99.10％。

向实施例4中透性细胞浓度为20g/l的na2hpo4-柠檬酸溶液(50mm，ph5.6)中，加入浓度为0.01mmol/l的磷酸吡哆醛和浓度为500g/l的底物l-赖氨酸盐酸盐，在45℃，400rpm水浴摇床中转化反应24小时后进行戊二胺浓度检测。检测结果如下：戊二胺浓度为227.21g/l，产率为81.35％。

戊二胺检测方法：样品离心去除菌体，取上清稀释1000倍，取1ml稀释后的样品，加入300ulph9.5的过饱和nahco3-naoh缓冲液，1ml浓度为5g/l的丹磺酰氯溶液，水浴45min，加入200ul氨水和2.7ml甲醇，液相检测戊二胺浓度。

hplc高效液相色谱检测条件如实施例2所述。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>天津大学

<120>一种高产戊二胺的大肠杆菌工程菌与方法

<160>10

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