一株解淀粉芽孢杆菌TBA03及其应用的制作方法

本发明属于微生物和生物防治技术领域，具体涉及一株解淀粉芽孢杆菌tba03及其应用。

背景技术：

烟草是一种叶用经济作物。中国作为烟草生产大国，烟草种植面积、产量和销量均位居世界首位。烟草是一种忌连作的作物，如果在同一片耕地上连续种植烟草，会带来产量降低、烟叶品质变劣和生育状况变差的现象，严重影响了烟草的产量和质量。据统计，每年由于烟草连作带来的直接及间接经济损失高达40亿元人民币，严重威胁到我国烟业的可持续发展。所以，如何缓解烟草连作障碍是当前亟待解决的重要问题，成为国内外同行研究的热点。

当前国内外对于烟草连作障碍的治理主要采用化学试剂法、轮作和间套作法和微生物消减法。往连作烟草土壤中添加肥料等化学试剂具有速效、方便、经济效益高等优点，但是有效期短，过量或长期使用会污染环境，影响植物品质；轮作和间套作法对消减连作障碍有着不可忽视的作用，但由于土壤资源匮乏，该方法目前很少应用；微生物消减法通过从土壤中筛选并添加有益微生物，抑制有害微生物生长，改善烟草生长性状，减轻烟草病害，具有环保、生态、安全等优点。

据报导，土壤微生物结构是影响烟草病害、导致烟草连作障碍的重要因素之一。利用拮抗菌进行植物病害防治被认为是一种科学、合理、高效、环境友好型的措施。本发明的解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)tba03能显著抑制烟草土壤中青枯雷尔氏病原菌的生长，可达到缓解烟草青枯病害的目的。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一株解淀粉芽孢杆菌菌株tba03及其在缓解烟草青枯病病害中的应用。研究表明，本发明的解淀粉芽孢杆菌菌株tba03在接种浓度为4.0×10⁸cfu/kg风干土壤时，能够达到显著缓解烟草青枯病害的目的。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一株解淀粉芽孢杆菌tba03，其分类命名为：解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)，该菌株于2019年12月9日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，其保藏号为cgmccno.19108，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，该菌株为青枯雷尔氏病原菌的拮抗菌。

一株解淀粉芽孢杆菌tba03在防治烟草青枯雷尔氏菌(ralstoniasolanacearum)中的应用。

一种含上述一株解淀粉芽孢杆菌tba03的微生物制剂。

一种含上述一株解淀粉芽孢杆菌tba03的微生物制剂在防治烟草青枯雷尔氏菌(ralstoniasolanacearum)中的应用。

解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)tba03的筛选方案参见图1。先采集中国云南省玉溪市富良棚乡30年连作烤烟k326根际土壤，通过高通量测序并分析，获得连作烟草土壤病原菌为青枯病菌（ralstonia）。接着，采用青枯病菌选择性培养基(smsa培养基)，富集培养青枯雷尔氏病原菌。设计了青枯雷尔氏病原菌特异性引物，进行pcr扩增后，获得纯的青枯雷尔氏病原菌，再添加到常规水稻土壤中，验证青枯雷尔氏病原菌对烤烟k326幼苗的致病性，获得具有导致烟草青枯病害的青枯雷尔氏病原菌，再采用平板对峙法，筛选出对青枯雷尔氏病原菌具有最佳拮抗作用的拮抗菌，并对筛选出的拮抗菌做形态学和16s核榶体rna基因(16srdna)等相关鉴定工作，最终得到解淀粉芽孢杆菌tba03。

具体步骤如下：

(1)土壤采集：2018年08月底，分别采集云南省玉溪市富良棚乡30年连作烤烟k326根际土壤和烟区附近未植烟的对照土壤，采用四分法缩分土壤样品，将采集的土壤样品保存于-80℃冰箱中，备接下来的土壤微生物群落结构多样性分析和病原菌筛选使用。

(2)土壤微生物群落结构多样性分析：分别提取未植烟对照土壤(cs)和连作烤烟根际土壤(ccs)的基因组dna，利用琼脂糖凝胶电泳检测所提取dna的纯度和浓度，使用带有barcode的特异性引物(341f:cctaygggrbgcascag和543r:attaccgcggctgctgg)，进行cs和ccs基因组dna的pcr扩增。dna样本送至北京奥维森基因科技有限公司，利用illuminamiseqpe300高通量测序平台测序，微生物多样性检测选取细菌16srdnav3-v4区。测序结果表明，青枯雷尔氏菌是菌群数量较高、导致该地区烟草连作障碍的重要病原菌。

(3)青枯雷尔氏病原菌富集、分离和纯化：称取10g云南省玉溪市富良棚乡30年连作烤烟k326根际土壤，溶于装有90ml无菌水的三角瓶中，充分振荡摇匀，得10^-1稀释液。取10ml10^-1稀释度的土壤悬浮液至另一瓶90ml无菌水的三角瓶中，充分振荡摇匀，得10^-2稀释液，依次稀释得10^-3稀释液。吸取50µl10^-3稀释度的土壤稀释液，涂布到smsa选择性培养基上，置于30℃恒温培养箱中，培养72h。待培养基上长出清晰可挑选的细菌菌落时，将smsa固体培养基上清晰可见的细菌菌落挑至装有1mlsmsa液体培养基的离心管中，30℃摇床(200rpm)过夜培养，置于4℃冰箱中，保存备用。smsa培养基参照elphinstonejg等的配方进行配制(elphinstonejg.,hennessyj.,wilsonjk.,steadde.sensitivityofdifferentmethodsforthedetectionofralstoniasolanacearuminpotatotuberextracts.eppobulletin,1996,26,663-678)。

smsa培养基配制：称取10g蛋白胨和lg酪蛋白氨基酸，加入5ml甘油和995ml18.2mω超纯水，制得1l液体培养基。若配制固体培养基，每1l液体培养基中需加入15g琼脂。121℃高压灭菌15min，冷却至50℃后，每升培养基中加入25mg杆菌肽(1250u)、100mg多粘菌素b硫酸盐(600000u)、0.5mg青霉素(825u)、5mg氯霉素、5mg结晶紫和50mg2,3,5-氯化三苯基四氮唑(ttc)。

(4)青枯雷尔氏病原菌鉴定：

参照kubotar等的描述(kubotar.,vinebg.,alvarezam.,jenkinsdm.detectionofralstoniasolanacearumbyloop-mediatedisothermalamplification[j].phytopathology,2008,98,1045)，设计青枯雷尔氏菌flic致病基因的特异性引物(f:5′-tggcggttgcggtcta-3′和r:5′-gatcaggtcttccggctcta-3′)，pcr扩增flic基因。pcr扩增体系(20μl)为：taqpcrmastermix10μl，上下游引物各1μl，无菌水5μl，dna模板3μl。扩增程序为：95°c预变性5min，95°c变性30sec，55°c退火30sec，72°c延伸1min，30个循环，继续72°c延伸10min。pcr产物用1%(m/v)琼脂糖凝胶电泳进行纯度检测后，送福州伯尚生物科技有限公司测序，在ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库上进行blast比对分析，鉴定该病原菌为青枯雷尔氏菌(ralstoniasolanacearum)。

(5)拮抗菌解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)tba03富集、分离和纯化：

s1：通过五点采样法采集云南省玉溪市富良棚乡30年连作烤烟k326根际土壤，并将采集到的土壤保存在-80℃冰箱中，备用；

s2：将采集到的土壤研细过筛后，称取10g土壤，溶于90ml无菌水中，充分振荡摇匀，置于80℃水浴，处理10min(以杀死不能形成芽孢的菌体)，得到土壤悬浮液；

s3：将上述土壤悬浮液梯度稀释，得到不同稀释度的土壤悬浮液；

s4：吸取稀释度为10^-1、10^-2和10^-3的土壤悬浮液各50μl，涂布到肉汤(lb)固体培养基上，放置于30℃培养箱中，培养24h；

s5：挑选培养基上清晰可辨且形态不一的单菌落，富集培养12h，置于4℃冰箱中，保存备用；

s6：将富集、分离和纯化并于4℃冰箱中保存备用的青枯雷尔氏菌用无菌水稀释10倍，制成青枯雷尔氏菌悬浮液。吸取50μl菌株悬浮液，涂布到lb平板上，在lb平板上均匀放置2张直径为7mm的滤纸片，其中1张滤纸上点接20μls5中富集培养的菌液，另一块滤纸上点接20μl灭菌水作为对照，置于30℃培养箱中，培养3d后，挑选出一株对青枯雷尔氏菌具有强拮抗效应的细菌，命名为tba03。将筛选出的强拮抗菌株转接至5mllb液体培养基中扩大培养，30℃摇床(200rpm)过夜培养，置于4℃冰箱中，保存备用。

lb购自青岛高科园海博生物技术有限公司，其成分为：胰蛋白胨10.0g/l、酵母浸粉5.0g/l、氯化钠10.0g/l。每升超纯水中加25glb，121℃高压灭菌15min后备用。若配制固体培养基，每升lb液体培养基中需加入15g琼脂。

(6)拮抗菌解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)tba03鉴定：

采用细菌通用性引物(27f:5'-agagtttgatcctggctcag-3'和1492r:5'-ggttaccttgttacgactt-3')，进行tba03的16s核榶体rna基因(16srdna)的pcr扩增。pcr扩增体系(20μl)为：taqpcrmastermix10μl，上下游引物各1μl，无菌水5μl，dna模板3μl。扩增程序为：95°c预变性5min，95°c变性30sec，55°c退火30sec，72°c延伸1min，30个循环，继续72°c延伸10min。pcr产物用1%(m/v)琼脂糖凝胶电泳进行纯度检测后，送福州伯尚生物科技有限公司测序，在ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库上进行blast比对分析，构建进化树，鉴定该拮抗菌为解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefacienstba03)，保藏编号为：cgmccno.19108。

菌学特征如下：菌体呈杆状、形态为长直、两端钝圆、长2~3μm、宽0.6~0.7μm，革兰氏阳性菌，适宜生长温度20~50℃，适宜ph3.0-9.0，兼性好氧，在lb培养基上为乳白色、圆形、突起的菌落。

解淀粉芽孢杆菌tba03的保藏：解淀粉芽孢杆菌tba03使用甘油冷冻管-80℃保藏。

本发明的优点在于：

利用拮抗菌进行植物病害防治是一种科学、合理、高效、环境友好型的措施。本发明分离筛选到的解淀粉芽孢杆菌tba03能够显著抑制青枯雷尔氏病原菌的生长，降低烟草青枯病的危害。本发明菌株是从连作烟草土壤中分离筛选得到的，对烟草土壤环境具有较强的抗性和适应性，在缓解烟草青枯病害方面发挥重要作用。

附图说明

图1：本发明的技术路线图。

图2：本发明的30年连作烤烟k326根际土壤中病原菌在属水平上的相对丰度，ccs代表云南省玉溪市富良棚乡30年连作烤烟k326根际土壤，cs代表烟区附近未植烟的对照土壤；横坐标代表土壤，纵坐标代表微生物的相对丰度。

图3：本发明的解淀粉芽孢杆菌tba03与青枯雷尔氏菌的平板对峙图。a：接种解淀粉芽孢杆菌tba03，b：接种无菌水对照组。

图4：本发明的解淀粉芽孢杆菌tba03的进化树。

图5：本发明的解淀粉芽孢杆菌tba03的扫描电镜照片。

图6：本发明的解淀粉芽孢杆菌tba03防控青枯病菌侵染烟草幼苗结果。a：未添加青枯雷尔氏病原菌和解淀粉芽孢杆菌tba03的对照土壤，b：同时接种青枯雷尔氏病原菌(4.0×10⁸cfu/kg土壤)和解淀粉芽孢杆菌tba03(4.0×10⁸cfu/kg土壤)的烟苗土壤，c：仅接种青枯雷尔氏病原菌(4.0×10⁸cfu/kg土壤)的烟苗土壤。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。

实施例1解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)tba03的筛选及鉴定

1、青枯雷尔氏病原菌(ralstoniasolanacearum)的筛选

(1)土壤采集：2018年08月底，分别采集云南省玉溪市富良棚乡30年连作烤烟k326根际土壤和烟区附近未植烟的对照土壤，采用四分法缩分土壤样品，将采集的土壤样品保存于-80℃冰箱中，备接下来的土壤微生物群落结构多样性分析和病原菌筛选使用。

(2)土壤微生物群落结构多样性分析：分别提取未植烟对照土壤(cs)和连作烤烟根际土壤(ccs)的基因组dna，利用琼脂糖凝胶电泳检测所提取dna的纯度和浓度，使用带有barcode的特异性引物(341f:cctaygggrbgcascag和543r:attaccgcggctgctgg)，进行cs和ccs基因组dna的pcr扩增。dna样本送至北京奥维森基因科技有限公司，利用illuminamiseqpe300高通量测序平台测序，微生物多样性检测选取细菌16srdnav3-v4区。测序结果表明，青枯雷尔氏菌是菌群数量较高、导致该地区烟草连作障碍的重要病原菌(图2)。

(3)青枯雷尔氏病原菌富集、分离和纯化：

称取10g云南省玉溪市富良棚乡30年连作烤烟k326根际土壤，溶于装有90ml无菌水的三角瓶中，充分振荡摇匀，得10^-1稀释液。取10ml10^-1稀释度的土壤悬浮液至另一瓶90ml无菌水的三角瓶中，充分振荡摇匀，得10^-2稀释液，依次稀释得10^-3稀释液。吸取50µl10^-3稀释度的土壤稀释液，涂布到smsa选择性培养基上，置于30℃恒温培养箱中，培养72h。待培养基上长出清晰可挑选的细菌单菌落时，将smsa固体培养基上清晰可见的细菌单菌落挑至装有1mlsmsa液体培养基的离心管中，30℃摇床(200rpm)过夜培养，置于4℃冰箱中，保存备用。smsa培养基参照elphinstonejg等的配方进行配制(elphinstonejg.,hennessyj.,wilsonjk.,steadde.sensitivityofdifferentmethodsforthedetectionofralstoniasolanacearuminpotatotuberextracts.eppobulletin,1996,26,663-678.)。

smsa培养基配制：称取10g蛋白胨和lg酪蛋白氨基酸，加入5ml甘油和995ml18.2mω超纯水，制得1l液体培养基。若配制固体培养基，每1l液体培养基中需加入15g琼脂。121℃高压灭菌15min，冷却至50℃后，每升培养基中加入25mg杆菌肽(1250u)、100mg多粘菌素b硫酸盐(600000u)、0.5mg青霉素(825u)、5mg氯霉素、5mg结晶紫和50mg2,3,5-氯化三苯基四氮唑(ttc)。

(4)青枯雷尔氏病原菌鉴定：

参照kubotar等的描述(kubotar.,vinebg.,alvarezam.,jenkinsdm.detectionofralstoniasolanacearumbyloop-mediatedisothermalamplification[j].phytopathology,2008,98,1045)，设计青枯雷尔氏菌flic致病基因的特异性引物(f:5′-tggcggttgcggtcta-3′和r:5′-gatcaggtcttccggctcta-3′)，pcr扩增flic基因。pcr扩增体系(20μl)为：taqpcrmastermix10μl，上下游引物各1μl，无菌水5μl，dna模板3μl。扩增程序为：95°c预变性5min，95°c变性30sec，55°c退火30sec，72°c延伸1min，30个循环，继续72°c延伸10min。pcr产物用1%(m/v)琼脂糖凝胶电泳进行纯度检测后，送福州伯尚生物科技有限公司测序，在ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库上进行blast比对分析，鉴定该病原菌为青枯雷尔氏菌(ralstoniasolanacearum)。

2、解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)tba03的筛选

本发明所述的解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)tba03从云南省玉溪市富良棚乡30年连作烤烟k326根际土壤分离获得。

(1)tba03培养基的选择

使用lb肉汤培养基（购自青岛高科园海博生物技术有限公司），其成分为：胰蛋白胨10.0g/l、酵母浸粉5.0g/l、氯化钠10.0g/l，每1l超纯水中加25glb肉汤粉末（若配制固体培养基，每1l液体培养基中需加入15g琼脂）。经过121℃，高压灭菌15min后使用。

(2)tba03富集、分离和纯化

s1：通过五点采样法采集云南省玉溪市富良棚乡30年连作烤烟k326根际土壤，并将采集到的土壤保存在-80℃冰箱中，备用；

s2：将采集到的土壤研细过筛后，称取10g土壤，溶于90ml无菌水中，充分振荡摇匀，置于80℃水浴，处理10min(以杀死不能形成芽孢的菌体)，得到土壤悬浮液；

s3：将上述土壤悬浮液10倍梯度稀释，得到不同稀释度的土壤悬浮液；

s4：吸取稀释度为10^-1、10^-2和10^-3的土壤悬浮液各50μl，涂布到lb肉汤固体培养基上，放置于30℃培养箱中，培养24h；

s5：挑选培养基上清晰可辨且形态不一的单菌落，富集培养12h，置于4℃冰箱中，备用；

s6：将筛选所得青枯雷尔氏菌(ralstoniasolanacearum)转接至smsa液体培养基中，过夜培养(30℃，200rpm)后的悬浮液用无菌水稀释10倍，吸取50μl菌株悬浮液，涂布到lb平板上，在lb平板上均匀放置2张直径为7mm的滤纸片，其中1张滤纸上点接20μls5中富集培养的菌液，另一块滤纸上点接20μl灭菌水作为对照，置于30℃培养箱中，培养3d后，挑选出一株对青枯雷尔氏菌具有强拮抗效应的细菌，命名为tba03。将筛选出的强拮抗菌株转接至5mllb液体培养基中扩大培养，30℃摇床(200rpm)过夜培养，置于4℃冰箱中，保存备用。

lb购自青岛高科园海博生物技术有限公司，其成分为：胰蛋白胨10.0g/l、酵母浸粉5.0g/l、氯化钠10.0g/l。每升超纯水中加25glb，121℃高压灭菌15min后备用。若配制固体培养基，每升lb液体培养基中需加入15g琼脂。

(3)tba03抑菌效果检测

将上述步骤中富集、分离、纯化所得并保存于4℃冰箱中的青枯雷尔氏菌用无菌水稀释10倍，制成悬浮液。吸取50μl青枯雷尔氏菌悬浮液，涂布到lb平板上，采用平板对峙法筛选青枯雷尔氏菌的拮抗菌。首先，在平板上均匀放置2张直径为7mm的滤纸片，其中1张滤纸上点接20μl富集培养的tba03悬浮液，另一块滤纸上点接20μl灭菌水作为对照。平行3组。平板放置于30℃培养箱中，培养3天后发现，解淀粉芽孢杆菌tba03能够高效抑制青枯病菌的生长（图3）。

(4)tba03鉴定

采用细菌通用性引物(27f:5'-agagtttgatcctggctcag-3'和1492r:5'-ggttaccttgttacgactt-3')，进行tba03的16s核榶体rna基因(16srdna)的pcr扩增。pcr扩增体系(20μl)为：taqpcrmastermix10μl，上下游引物各1μl，无菌水5μl，dna模板3μl。扩增程序为：95°c预变性5min，95°c变性30sec，55°c退火30sec，72°c延伸1min，30个循环，继续72°c延伸10min。pcr产物用1%(m/v)琼脂糖凝胶电泳进行纯度检测后，送福州伯尚生物科技有限公司测序，在ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库上进行blast比对分析，构建进化树(图4)，鉴定该拮抗菌为解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefacienstba03)。

解淀粉芽孢杆菌tba03菌株的菌学特征如下：菌体呈杆状、形态为长直、两端钝圆、长2~3μm、宽0.6~0.7μm，革兰氏阳性菌，适宜生长温度20~50℃，适宜ph3.0-9.0，兼性好氧，在lb培养基上为乳白色、圆形、突起的菌落(图5)。

解淀粉芽孢杆菌tba03的保藏：解淀粉芽孢杆菌tba03使用甘油冷冻管-80℃保藏。

解淀粉芽孢杆菌tba03，其分类命名为：解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)tba03，于2019年12月9日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmccno.19108。

实施例2解淀粉芽孢杆菌tba03防控青枯雷尔氏病原菌侵害烤烟k326幼苗效果评价

将4~5叶期k326烟苗移栽到7cm×7cm×8cm(长×宽×高)的小方盆中(1株/盆)，每盆加常规稻田土壤250g，移栽后第5天，进行以下三种处理。处理1：不加菌；处理2：采用灌根法，在烟草根部接种1ml浓度为1×10⁸cfu/ml的青枯雷尔氏菌菌悬液。接种1d后，继续在烟草根部接种1ml浓度为1×10⁸cfu/ml的解淀粉芽孢杆菌tba03菌悬液；处理3：只在烟草根部接种1ml浓度为1×10⁸cfu/ml青枯雷尔氏菌菌悬液。以上共3个处理，每个处理3次重复(表1)。放置于24~25℃光照培养箱中培养，持续观察病原菌侵染情况。培养30天后，发现不添加致病菌和拮抗菌的实验处理组1中(图6a)，k326烟草幼苗长势良好，而在只添加致病菌的实验处理组3中(图6c)，k326烟草幼苗植株矮小、叶片发黄枯萎，表明青枯雷尔氏菌显著抑制了k326烟草幼苗的生长；但在同时添加致病菌和拮抗菌的实验处理组2中(图6b)，k326烟草植株长势虽然没有实验处理组1好，却显著优于致病菌毒害处理组3，表明解淀粉芽孢杆菌tba03显著缓解了青枯雷尔氏病原菌对k326烟草植株的毒害作用。综上可见，本发明筛选出的解淀粉芽孢杆菌tba03(保藏号为：cgmccno.19108)能够有效防控青枯雷尔氏病原菌对烟草的毒害，在该领域具有广阔的应用前景。

表1试验设计表

以上所述仅为本发明的较佳实施例，任何在本发明申请专利范围之内所作的修改变化与修饰，均属本发明的涵盖范围。

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<110>福建农林大学

<120>一株解淀粉芽孢杆菌tba03及其应用

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