脂质生产的制作方法

发明领域本发明涉及用于生产脂质的重组细胞和生物技术方法。具体地，所述细胞是经遗传修饰以产生至少一种rubiwettin的非致病性细胞。发明背景如今，大多数可用的表面活性剂诸如月桂醇聚醚硫酸酯钠(sles)、甜菜碱等都以工业规模化学生产。这些化学生产的表面活性剂具有化学生产过程通常带来的所有缺点，例如有害副产物的形成。例如，在sles生产过程中，产生至少一种有害的副产物1,4-二氧杂环己烷。为了减少产生的有毒产物的量，并且考虑到消费者对环境友好产品的不断增加的需求，生物表面活性剂的生产和使用是普遍趋势。除了在生产过程中产生较少的有毒副产物外，生物表面活性剂还具有有用的特性，如高结构多样性、有益的表面活性剂特性、低环境毒性、抗生素或生物活性特性以及完全的生物可降解性。因此，通常有动力来生产和使用生物表面活性剂代替化学表面活性剂。rubiwettin是这样的生物表面活性剂的至少一个实例。rubiwettin代表一类在经济上令人关注的表面活性剂，因为它们可能会替代化学生产的表面活性剂。rubiwettin是由与一个3-羟基脂肪酸二聚体连接的一个β-d-葡萄糖分子组成的外脂质（exolipid），具有链长度c14和c10作为脂质主要组分。它们具有表面活性性能。目前，通过野生型深红沙雷氏菌（serratiarubidaea）分离物合成rubiwettin，该菌株为人和动物病原体。这种生产生物能够引起疾病的事实大大降低了消费者对这些常规生产的rubiwettin的接受。此外，在rubiwettin的生产过程中还需要更高的安全性要求，并且这由于增加的资本支出和可能的额外生产步骤而增加成本。目前可用于生产生物表面活性剂诸如rubiwettin的方法涉及使用这些病原性生物。通过改变ph、氧供应、培养基组成、进料策略、氮供应、温度、底物的选择等，可以优化产率。但是，如果将rubiwettin大规模用作表面活性剂，它们将必须与目前使用的表面活性剂竞争。后者是大批化学品，可以以非常低的成本生产。因此，rubiwettin还必须以尽可能低的成本生产，对客户没有健康风险，并具有尽可能确定的性能。仅通过过程优化来优化性能参数是不可能的。因此，本领域需要一种更便宜且更有效的以高产物收率生产生物表面活性剂例如rubiwettin的方法。发明详述本发明试图通过提供使用非致病性细胞从碳源生产生物表面活性剂诸如脂质、尤其是rubiwettin的生物技术手段来解决上述问题。具体地，可以对非致病性细胞进行基因修饰以增加至少一种酶(e2)的表达，所述酶(e2)能够将与ndp-葡萄糖组合的3-羟基烷酰基-3-羟基烷酰基辅酶a/acp和/或3-(3-羟基烷酰氧基)链烷酸(haa)转化成β-d-吡喃葡萄糖基-3-羟基烷酰基-3-羟基链烷酸酯。然后可以使用遗传修饰的细胞将合适的碳源转化成具有以下通式ii的脂质：通式ii其中r1和r2彼此独立地是具有5-13个碳原子的相同或不同的烷基。具体地，所述烷基可以是饱和的或不饱和的。更具体地，r1和/或r2的烷基可以是单不饱和的烷基残基。甚至更具体地，r1和/或r2可以选自戊烯基、庚烯基、壬烯基、十一烯基、十三烯基和(ch2)n-ch3，其中n=4-12。通式ii的这种脂质也可以被称为糖脂，更特别地称为rubiwettinrg1。根据本发明的任何方面的遗传修饰的细胞具有非致病性且易于培养的优点。这使得细胞可以更安全地进行生产，并且可以降低成本，因为实验室在生产和使用rubiwettin过程中不需要特殊的安全要求。根据本发明的任何方面的细胞具有其它优点，即能够使用多种碳底物来生产根据本发明的任何方面的脂质。例如，简单碳诸如葡萄糖可用作碳底物。并且，根据本发明的任何方面形成的脂质具有确定的和柔性的性质。根据本发明的任何方面的另一个优点是，可以使用非致病性细胞来产生rubiwettin。另一个优点是，与没有增加这些活性的细胞相比，可以以更高的时空产率、更高的碳产率、产物浓度、产物均一性（脂肪酸种类）来生产rubiwettin。根据本发明的一个方面，提供了用于从至少一种碳底物生产至少一种具有通式ii的脂质的微生物细胞，通式ii其中r1和r2彼此独立地是具有5-13个碳原子的相同或不同的烷基，且其中所述细胞是非致病性细胞，其经过遗传修饰以相对于野生型细胞增加酶(e2)的异源表达，所述酶(e2)能够将3-羟基烷酰基-3-羟基烷酰基辅酶a/acp和/或3-(3-羟基烷酰氧基)链烷酸(haa)转化成β-d-吡喃葡萄糖基-3-羟基烷酰基-3-羟基链烷酸酯。特别地，可以添加葡萄糖以使所述转化中的任何一个或两个发生。因此可以添加葡萄糖以将3-羟基烷酰基-3-羟基烷酰基辅酶a/acp转化成β-d-吡喃葡萄糖基-3-羟基烷酰基-3-羟基链烷酸酯。在另一个实施例中，可以添加葡萄糖以将haa转化成β-d-吡喃葡萄糖基-3-羟基烷酰基-3-羟基链烷酸酯。在另一个实施例中，haa和3-羟基烷酰基-3-羟基烷酰基辅酶a/acp可同时存在以产生β-d-吡喃葡萄糖基-3-羟基烷酰基-3-羟基链烷酸酯。酶e2可以能够将3-羟基烷酰基-3-羟基烷酰基辅酶a/acp转化成β-d-吡喃葡萄糖基-3-羟基烷酰基-3-羟基链烷酸酯。在一个实施例中，酶e2可以能够将haa转化成β-d-吡喃葡萄糖基-3-羟基烷酰基-3-羟基链烷酸酯。在另一个实施例中，酶e2可以能够将3-羟基烷酰基-3-羟基烷酰基辅酶a/acp和haa转化成β-d-吡喃葡萄糖基-3-羟基烷酰基-3-羟基链烷酸酯。在所有这些实施例中，ndp-葡萄糖可以特别存在，以包括通式ii中的葡萄糖部分。酶e2可以是糖基转移酶(ec2.4)。具体地，酶e2包含seqidno:4或其变体。本文中使用的术语“变体”包含氨基酸或核酸序列，其分别与参照氨基酸或核酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性，其中优选地功能（例如蛋白的催化活性，或分子的折叠或结构）必需氨基酸以外的氨基酸被删除、置换或通过插入而替换，或必需氨基酸被以保守方式替换以达到保留参照序列或由其衍生出的分子的生物活性的效果。现有技术包括可以用于比对两个给出的核酸或氨基酸序列和计算同一性程度的算法，参见arthurlesk(2008),thompson等人,1994,和katoh等人,2005。术语“变体”与术语“同系物”同义地和可互换地使用。这样的变体可以如下制备：在氨基酸或核酸序列以及包含这样的大分子或其变体的融合体中引入缺失、插入或置换。在一个实施例中，关于氨基酸序列，除了以上序列同一性以外，术语“变体”还包含与各个参照或野生型序列相比包含一个或多个保守氨基酸变化的氨基酸序列，或包含编码含有一个或多个保守氨基酸变化的氨基酸序列的核酸序列。在一个实施例中，除了以上序列同一性程度以外，术语氨基酸序列或核酸序列的“变体”包含所述氨基酸序列或核酸序列各自的任意活性部分和/或片段，或编码氨基酸序列的活性部分和/或片段的任意核酸序列。本文中使用的术语“活性部分”表示这样的氨基酸序列或核酸序列：其分别小于全长氨基酸序列或编码小于全长氨基酸序列，其中所述氨基酸序列或所述编码的氨基酸序列分别保留它的基本生物活性的至少一些。例如蛋白酶的活性部分和/或片段可以能够水解多肽中的肽键。本文中使用的短语“保留它的基本生物活性的至少一些”是指，目标氨基酸序列具有超过和不同于背景活性的生物活性和表征所述活性的动力学参数，更具体地kcat和km优选地是在参照分子关于特定底物表现出的值的3、2或1个数量级内。类似地，术语核酸的“变体”包含核酸互补链，其优选地在严谨条件下与参照或野生型核酸杂交。在一个实施例中，seqid:4的变体可以与seqidno:4具有60%序列同一性。在一个实施例中，酶e2可以具有多肽序列seqidno:4或这样的多肽序列：其中至多25%、优选地至多20%、特别优选地至多15%、尤其是至多10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%的氨基酸残基与参照序列seqidno:4相比通过缺失、插入、置换或它们的组合被修饰，并且仍然具有至少10%、优选地50%、特别优选地80%、尤其是超过90%的具有参照序列seqidno:4的酶的酶活性，其中酶e2的酶活性被理解为是指优选地将3-羟基烷酰基-3-羟基烷酰基辅酶a/acp或3-(3-羟基烷酰氧基)链烷酸(haa)转化成β-d-吡喃葡萄糖基-3-羟基烷酰基-3-羟基链烷酸酯的能力。ndp-葡萄糖在该转化中可以存在。通式ii的脂质也可以称作rubiwettin。r1和r2基团的长度可以具有不同长度。具体地，r1和r2可以独立地选自饱和的和不饱和的烷基。更具体地，r1和/或r2可以是具有5-13个碳原子的饱和的或不饱和的烷基。甚至更具体地，r1和r2可以是具有5-13个碳原子的饱和的或单不饱和的烷基。r1和r2烷基可以包含5-13个碳原子、7-13个碳原子、9-13个碳原子、5-11个碳原子、5-9个碳原子等。在其中r1和/或r2烷基是饱和烷基的实施例中，所述烷基可以包含5、6、7、8、9、10、11、12或13个碳原子。在其中r1和/或r2烷基是不饱和烷基的实施例中，所述烷基可以是包含5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1或13:1个碳原子的单不饱和烷基。根据本发明的任何方面的细胞可以能够生产具有不同r1和r2基团的rubiwettin的混合物。在一个实施例中，根据本发明的任何方面生产的通式ii的脂质可以是rubiwettinrg1(cas-nr.129039-46-9)。rubiwettinrg1也可以称作名称为β-d-吡喃葡萄糖基-3-(3'-羟基十四烷酰基氧基)癸酸酯或β-吡喃葡萄糖基-3-(3'-羟基十四烷酰基氧基)癸酸酯的糖脂。根据本发明的任何方面的细胞可以进一步遗传修饰以相对于野生型细胞增加酶(e1)的异源表达，所述酶(e1)能够将3-羟基烷酰基辅酶a/acp转化成3-羟基烷酰基-3-羟基烷酰基辅酶a/acp和进一步转化成3-(3-羟基烷酰氧基)链烷酸(haa)。酶e1可以是3-(3-羟基烷酰氧基)链烷酸(haa)合酶。在一个实施例中，酶e1包含seqidno:2或其变体。在另一个实施例中，酶e1包含选自以下的序列：seqidno:6,seqidno:8,seqidno:10,seqidno:12,seqidno:14及其变体，其中所述变体分别与seqidno:6、seqidno:8、seqidno:10、seqidno:12和seqidno:14具有60%序列同一性。在一个实施例中，酶e1可以具有多肽序列seqidno:6或这样的多肽序列：其中至多25%、优选地至多20%、特别优选地至多15%、尤其是至多10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%的氨基酸残基与参照序列seqidno:6相比通过缺失、插入、置换或它们的组合被修饰，并且仍然具有至少10%、优选地50%、特别优选地80%、尤其是超过90%的具有参照序列seqidno:6的酶的酶活性，其中酶e1的酶活性被理解为是指优选地将3-羟基烷酰基辅酶a/acp转化成3-羟基烷酰基-3-羟基烷酰基辅酶a/acp和进一步转化成haa的能力。在另一个实施例中，酶e1可以具有多肽序列seqidno:8或这样的多肽序列：其中至多25%、优选地至多20%、特别优选地至多15%、尤其是至多10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%的氨基酸残基与参照序列seqidno:8相比通过缺失、插入、置换或它们的组合被修饰，并且仍然具有至少10%、优选地50%、特别优选地80%、尤其是超过90%的具有参照序列seqidno:8的酶的酶活性，其中酶e1的酶活性被理解为是指优选地将3-羟基烷酰基辅酶a/acp转化成3-羟基烷酰基-3-羟基烷酰基辅酶a/acp和进一步转化成3-(3-羟基烷酰氧基)链烷酸(haa)的能力。在另一个实施例中，酶e1可以具有多肽序列seqidno:10或这样的多肽序列：其中至多25%、优选地至多20%、特别优选地至多15%、尤其是至多10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%的氨基酸残基与参照序列seqidno:10相比通过缺失、插入、置换或它们的组合被修饰，并且仍然具有至少10%、优选地50%、特别优选地80%、尤其是超过90%的具有参照序列seqidno:10的酶的酶活性，其中酶e1的酶活性被理解为是指优选地将3-羟基烷酰基辅酶a/acp转化成3-羟基烷酰基-3-羟基烷酰基辅酶a/acp和进一步转化成3-(3-羟基烷酰氧基)链烷酸(haa)的能力。在另一个实施例中，酶e1可以具有多肽序列seqidno:12或这样的多肽序列：其中至多25%、优选地至多20%、特别优选地至多15%、尤其是至多10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%的氨基酸残基与参照序列seqidno:12相比通过缺失、插入、置换或它们的组合被修饰，并且仍然具有至少10%、优选地50%、特别优选地80%、尤其是超过90%的具有参照序列seqidno:12的酶的酶活性，其中酶e1的酶活性被理解为是指优选地将3-羟基烷酰基辅酶a/acp转化成3-羟基烷酰基-3-羟基烷酰基辅酶a/acp和进一步转化成3-(3-羟基烷酰氧基)链烷酸(haa)的能力。在一个其它实施例中，酶e1可以具有多肽序列seqidno:14或这样的多肽序列：其中至多25%、优选地至多20%、特别优选地至多15%、尤其是至多10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%的氨基酸残基与参照序列seqidno:14相比通过缺失、插入、置换或它们的组合被修饰，并且仍然具有至少10%、优选地50%、特别优选地80%、尤其是超过90%的具有参照序列seqidno:14的酶的酶活性，其中酶e1的酶活性被理解为是指优选地将3-羟基烷酰基辅酶a/acp转化成3-羟基烷酰基-3-羟基烷酰基辅酶a/acp和进一步转化成3-(3-羟基烷酰氧基)链烷酸(haa)的能力。根据本发明的任何方面的细胞可以从碳底物生产具有通式i的另外脂质，通式i其中r1和r2彼此独立地是具有5-13个碳原子的相同或不同的烷基。具体地，所述烷基可以是饱和的或不饱和的。更具体地，r1和/或r2的烷基可以是单不饱和的烷基残基。甚至更具体地，r1和/或r2可以选自戊烯基、庚烯基、壬烯基、十一烯基、十三烯基和(ch2)n-ch3，其中n=4-12。通式i的脂质可以具有不同长度的r1和r2基团。具体地，r1和r2可以独立地选自饱和的和不饱和的烷基。更具体地，r1和/或r2可以是具有5-13个碳原子的饱和的或不饱和的烷基。甚至更具体地，r1和r2可以是具有5-13个碳原子的饱和的或单不饱和的烷基。r1和r2烷基可以包含5-13个碳原子、7-13个碳原子、9-13个碳原子、5-11个碳原子、5-9个碳原子等。在其中r1和/或r2烷基是不饱和烷基的实施例中，所述烷基可以是包含5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1或13:1个碳原子的单不饱和烷基。在其中r1和/或r2烷基是饱和烷基的实施例中，所述烷基可以包含5、6、7、8、9、10、11、12或13个碳原子。根据本发明的任何方面的细胞可以能够生产具有不同r1和r2基团的脂质的混合物。具体地，具有式i的脂质也可以称作rubiwettinr1(cas-nr.129039-45-8)。具体地，所述脂质是3-(3'-羟基十四烷酰基氧基)十四酸酯、3-(3'-羟基癸酰基氧基)癸酸酯、3-(3'-羟基十六碳烯酰基氧基)十六碳烯酸酯、3-(3'-羟基十四烷酰基氧基)癸酸酯、3-(3'-羟基十六碳烯酰基氧基)癸酸酯、3-(3'-羟基十六碳烯酰基氧基)十四酸酯和次要分子异构体的混合物。令人惊奇地，可以证实，与细胞的野生型相比，具有增加的e2和/或e1表达的根据本发明的任何方面的重组细胞能够生产增加量的具有式ii和/或i的脂质。因此，根据本发明的任何方面的细胞可以允许rubiwettinrg1的高选择性生产，并减少不希望的中间体如β-羟基脂肪酸的二聚体的产生。本文所用的短语“酶的异源表达增加”应理解为细胞内活性增加。基本上，酶活性的增加可以如下实现：使用强启动子或采用编码具有增加的活性的相应酶的基因或等位基因，并且任选地组合这些措施，增加编码酶的一个或多个基因序列的拷贝数。例如，通过转化、转导、缀合或这些方法与含有期望的基因、该基因的等位基因或其部分的载体和使得所述基因的表达成为可能的载体的组合，生产用于根据本发明的方法中的遗传修饰的细胞。异源表达具体地通过所述基因或所述等位基因在细胞的染色体中或染色体外复制的载体中的整合而实现。具体地，酶相对于野生型细胞的活性增加可以是超过野生型细胞的10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。技术人员将能够使用本领域已知的任何方法来遗传修饰细胞。不论根据本发明的任何方面使用的核酸分子、多肽、更具体地酶是否是重组的，不一定对其表达水平有影响。但是，在一个实施例中，根据本发明的任何方面使用的一种或多种重组核酸分子、多肽或酶可以被过表达。本文中使用的术语“过表达”是指，所编码或表达的各种多肽比在相同条件下在没有为了增加表达而进行的遗传修饰存在下在细胞中（例如在各种野生型细胞中）通常发现的水平更高地表达或以更高的活性表达。本领域技术人员熟悉引起过表达的多种方式。例如，可以将要过表达的核酸分子或编码要过表达的多肽或酶的核酸分子置于强诱导型启动子诸如lac启动子的控制下。现有技术描述了可用于该目的的标准质粒，例如以pet-3a(可商购得自novagen)为例的载体的pet系统。可以确定核酸或多肽是否过表达，在核酸分子的情况下，通过定量pcr反应，在多肽的情况下，通过sds聚丙烯酰胺电泳、蛋白质印迹或比较活性测定。遗传修饰可以针对转录、翻译和/或翻译后修饰，其导致在选定和/或鉴定的培养条件下酶活性和/或选择性的改变。因此，在本发明的不同实施例中，为了更有效地起作用，微生物可以包含一个或多个基因缺失。通过突变基因缺失方案和/或从具有这些酶中的一种或多种的降低表达或无表达的突变株开始和/或本领域技术人员已知的其它方法，可以实现基因缺失。de-a-10031999给出了增加细胞内酶活性（例如丙酮酸羧化酶）的可能性的一般性调查，其特此插入作为参考，且其关于增加细胞内酶活性的可能性的公开内容形成本发明公开内容的一部分。以上和所有随后提及的酶或基因的表达可如下检测：借助于一维和二维蛋白质凝胶进行分离，随后使用适当的分析软件对凝胶中的蛋白质浓度进行光学鉴定。如果酶活性的增加仅基于相应基因表达的增加，则通过野生型和遗传修饰细胞之间的一维或二维蛋白质分离的对比可以以简单的方式确定酶活性增加的定量。用于制备蛋白质凝胶（在棒状细菌的情况下）和鉴定蛋白质的常规方法是hermann等人(electrophoresis,22:1712.23(2001))描述的方法。同样可以如下分析蛋白浓度：使用对要检测的蛋白质具有特异性的抗体进行蛋白质印迹杂交(sambrook等人,molecularcloning:alaboratorymanual,第2版coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.usa,1989)，并随后使用适当的软件进行光学分析以确定浓度(lohaus和meyer(1989)biospektrum,5:32-39;lottspeich(1999)angewandtechemie111:2630-2647)。借助于dna带移测定（也称为凝胶阻滞）(wilson等人(2001)journalofbacteriology,183:2151-2155)，可以测量dna结合蛋白的活性。通过各种充分描述的报道基因测定的方法，可以检测dna结合蛋白对其它基因表达的作用(sambrook等人,molecularcloning:alaboratorymanual,第2版coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.usa,1989)。根据各种描述的方法可以确定细胞内酶活性(donahue等人(2000)journalofbacteriology182(19):5624-5627;ray等人(2000)journalofbacteriology182(8):2277-2284;freedberg等人(1973)journalofbacteriology115(3):816-823)。如果在下面的实施方案中没有指示用于确定某种酶的活性的实用方法，则优选通过在hermann等人,electophoresis,22:1712-23(2001),lohaus等人,biospektrum532-39(1998),lottspeich,angewandtechemie111:2630-2647(1999)和wilson等人,journalofbacteriology183:2151-2155(2001)中描述的方法进行酶活性的增加的确定以及酶活性的降低的确定。如果通过内源基因的突变来实现酶活性的增加，则可以如下随机产生这种突变：通过常规方法，例如通过紫外光照射或通过致突变的化学物质，或通过遗传工程方法诸如缺失、插入和/或核苷酸交换选择性地产生。通过这些突变获得经修饰的细胞。特别优选的酶突变体还特别是不再可被反馈、产物或底物抑制的那些酶，或至少与野生型酶相比以降低的程度抑制的那些酶。如果通过酶合成的增加来实现酶活性的增加，则相应基因的拷贝数会增加，或者位于结构基因上游的启动子和调控区或核糖体结合位点发生突变。整合到结构基因上游的表达盒以相同的方式起作用。另外可能通过诱导型启动子在任何所需的时间点增加表达。但是，此外，还可以将“增强子”分配给酶基因作为调节序列，其同样通过rna聚合酶和dna之间改善的相互作用而导致增加的基因表达。作为延长mrna寿命的措施的结果，同样改善表达。此外，通过防止酶蛋白的降解，同样增加酶活性。在这里，基因或基因构建体存在于具有不同拷贝数的质粒中，或者整合在染色体中并在其中扩增。可替换地，还可以通过改变培养基组成和培养管理来实现相关基因的过表达。本领域技术人员尤其是在以下文献中找到这方面的指导：martin等人(bio/technology5,137-146(1987)),guerrero等人(genes138,35-41(1994)),tsuchiya和morinaga(bio/technology6,428-430(1988)),eikmanns等人(genes102,93-98(1991)),ep-a-0472869,us4,601,893,schwarzer和pühler(bio/technology9,84-87(1991)),reinscheid等人(appliedandenvironmentalmicrobiology60,126-132(1994)),labarre等人(journalofbacteriology175,1001-1007(1993)),wo-a-96/15246,malumbres等人(genes134,15-24(1993)),jp-a-10-229891,jensen和hammer(biotechnologyandbioengineering58,191-195(1998))，以及遗传学和分子生物学的已知教科书。与突变一样，上述措施同样导致遗传修饰的细胞。例如，使用附加型质粒来增加各个基因的表达。合适的质粒或载体原则上是本领域技术人员可用于该目的的所有实施方案。这样的质粒和载体可以例如得自公司novagen、promega、newenglandbiolabs、clontech或gibcobrl的宣传材料。其它优选的质粒和载体可以在以下文献中找到：glover,d.m.(1985)dnacloning:apracticalapproach,第i-iii卷,irlpressltd.,oxford;rodriguez,r.l.和denhardt,d.t(编)(1988)vectors:asurveyofmolecularcloningvectorsandtheiruses,179-204,butterworth,stoneham;goeddel,d.v.(1990)systemsforheterologousgeneexpression,methodsenzymol.185,3-7;sambrook,j.;fritsch,e.f.和maniatis,t.(1989),molecularcloning:alaboratorymanual,第2版,coldspringharborlaboratorypress,newyork。然后通过缀合或转化将包含待扩增基因的质粒载体转化成所需菌株。例如，在schäfer等人,appliedandenvironmentalmicrobiology60:756-759(1994)中描述了缀合方法。例如在thierbach等人,appliedmicrobiologyandbiotechnology29:356-362(1988),dunican和shivnan,bio/technology7:1067-1070(1989)和tauch等人,femsmicrobiologylet-ters123:343-347(1994)中描述了转化方法。通过“交叉”事件进行同源重组后，所得菌株含有有关基因的至少两个拷贝。根据本发明的任何方面，可以对细胞进行遗传修饰，使得在限定的时间间隔内，在2小时内，特别是在8小时或24小时内，它形成比野生型细胞多至少2倍、特别是至少10倍、至少100倍、至少1000倍或至少10000倍的通式i或ii的脂质。可以如下确定产物形成的增加：例如，通过在相同条件（相同细胞密度，相同营养培养基，相同培养条件）下在合适的营养培养基中分别单独培养根据本发明的任何方面的细胞和野生型细胞指定的时间间隔，并然后确定营养培养基中的目标产物（具有通式ii或i的脂质）的量。给定多肽序列的氨基酸残基的改变（其不会导致给定多肽的特性和功能的明显改变）是本领域技术人员已知的。因此，例如，“保守氨基酸”可以相互交换；此类合适的氨基酸置换的例子是：ala置换ser；arg置换lys；asn置换gln或his；asp置换glu；cys置换ser；gln置换asn；glu置换asp；gly置换pro；his置换asn或gln；ile置换leu或val；leu置换met或val；lys置换arg或gln或glu；met置换leu或ile；phe置换met或leu或tyr；ser置换thr；thr置换ser；trp置换tyr；tyr置换trp或phe；val置换ile或leu。同样已知的是，特别是在多肽的n-或c-末端的变化，例如以氨基酸插入或缺失的形式，经常对多肽的功能没有显著影响。通过以本领域技术人员已知的方式破坏含有这种活性的细胞，例如借助于球磨机、弗氏压碎器或超声分解仪，随后通过在13,000rpm和4℃离心10分钟分离出细胞、细胞碎片和破裂助剂（例如，玻璃珠），可以确定酶的活性。使用所得的无细胞粗提取物，然后可以进行产物的酶测定和随后的lc-esi-ms检测。可替换地，通过色谱方法(诸如镍-次氮基三乙酸亲和色谱法、抗生蛋白链菌素亲和色谱法、凝胶过滤色谱法或离子交换色谱法)，可以以本领域技术人员已知的方式富集酶，或者纯化至同质。在一个实施例中，用于确定酶e2的活性的方法包括首先以本领域技术人员已知的方式，例如借助于球磨机、弗氏压碎器或超声分解仪，破坏含有该活性的细胞（即，根据本发明的任何方面的细胞），随后通过在16,100g在4℃离心10分钟分离出细胞、细胞碎片和破裂助剂（例如，玻璃珠）。使用所得的无细胞粗提取物，可以进行产物的酶测定和随后的lc-esi-ms检测。作为一个替代方案，通过色谱方法(诸如镍/次氮基三乙酸亲和色谱法、抗生蛋白链菌素亲和色谱法、凝胶过滤色谱法或离子交换色谱法)，可以以本领域技术人员已知的方式富集酶，或者纯化至同质。然后可以将该样品用于测量酶e2的活性。具体地，可以使用标准测定确定酶e2的活性，该标准测定可以由185µl10mmtris-hcl(ph7.5)、10µlmmndp-葡萄糖和50µl蛋白粗提取物(约1mg总蛋白)或在溶液中的纯化的蛋白(5µg纯化的蛋白)组成。通过加入10µl的3-羟基十四烷酰基-3-羟基癸酸或3-羟基十六酰基-3-羟基癸酸的mm乙醇溶液，可以开始反应，并在摇动（600rpm）下在30℃温育1h。随后，可以用1ml丙酮处理反应物。可以通过离心(16,100g,5min室温)沉淀未溶解的组分，然后可以借助于lc-esi-ms分析样品。然后可以通过分析相应的质量迹线和ms2波谱来进行产物的鉴定。该方法可以用于测量e2的活性。在另一个实施例中，用于确定酶e1的活性的方法包括首先以本领域技术人员已知的方式破坏包含该活性的细胞（即，根据本发明的任何方面的细胞），并随后通过在16,100g在4℃离心10min分离出细胞、细胞碎片和破裂助剂（例如，玻璃珠）。使用所得的无细胞粗提取物，可以进行产物的酶测定和随后的lc-esi-ms检测。作为一个替代方案，通过色谱方法(诸如镍/次氮基三乙酸亲和色谱法、抗生蛋白链菌素亲和色谱法、凝胶过滤色谱法或离子交换色谱法)，可以以本领域技术人员已知的方式富集酶，或者纯化至同质。然后可以将该样品用于测量酶e1的活性。具体地，可以使用标准测定确定酶e1的活性，该标准测定可以含有100µm大肠杆菌acp、1mmβ-巯基乙醇、200µm丙二酰基-辅酶a、40µm辛酰基-辅酶a和40µm十二烷酰基-辅酶a或40µm辛酰基-辅酶a和40mm十四烷酰基-辅酶a、100µmnadph、2µg大肠杆菌fabd、2µg结核分枝杆菌fabh、1µg大肠杆菌fabg、0.1m磷酸钠缓冲液(ph7.0)和5µg酶e1，终体积为120µl。可以将acp、β-巯基乙醇和磷酸钠缓冲液在37℃预温育30min以完全还原acp。可以通过添加酶e1来开始该反应。可以使用2ml水终止反应，所述水已经用hcl酸化至ph2.0，随后用2ml氯仿/甲醇(2:1(v:v))萃取两次。可以通过离心(16,100g,5min，室温)进行相分离。可以将较低的有机相除去，在真空离心机中完全蒸发，然后可以将沉淀物溶解于50µl甲醇中。未溶解的组分可以通过离心(16,100g,5min室温)进行沉淀，并可以借助于lc-esi-ms分析样品。可以通过分析相应的质量迹线和ms2波谱来进行产物的鉴定。根据本发明的任何方面使用的酶可以是重组的。本文中使用的术语“重组的”表示一种分子或由这样的分子编码，特别是多肽或核酸，其因而不会天然地存在，而是基因工程的结果，或表示包含重组分子的细胞。例如，如果核酸分子包含这样的启动子，则核酸分子是重组的：所述启动子在功能上与编码催化活性多肽的序列连接，且所述启动子已经经过工程改造，使得所述催化活性多肽与包含原始的未改变的核酸分子的对应野生型细胞中的多肽水平相比过表达。根据本发明的任何方面使用的细胞也可以是非致病性细胞。非致病性细胞表示不会引起对另一种生物的疾病、伤害或死亡的细胞。根据本发明的任何方面的细胞可以是任何非致病性原核生物或真核生物。这些可以是哺乳动物细胞（例如，来自人的细胞）、植物细胞或微生物，诸如酵母、真菌或细菌，其中微生物尤其是细菌和酵母是优选的。合适的细菌、酵母或真菌尤其是作为细菌、酵母或真菌菌株保藏在deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturen(德国微生物和细胞培养物保藏中心)gmbh(dsmz),brunswick,germany的那些细菌、酵母或真菌。根据本发明合适的细菌属于以下所列的属：http://www.dsmz.de/species/bacteria.htm，根据本发明合适的酵母属于以下所列的属：http://www.dsmz.de/species/yeasts.htm且根据本发明合适的真菌是在下面列出的那些：http://www.dsmz.de/species/fungi.htm。具体地，所述细胞可以选自以下属：曲霉菌属（aspergillus）、棒杆菌属（corynebacterium）、短杆菌属（brevibacterium）、芽孢杆菌属（bacillus）、不动杆菌属（acinetobacter）、产碱菌属（alcaligenes）、乳杆菌属（lactobacillus）、副球菌属（paracoccus）、乳球菌属（lactococcus）、假丝酵母属（candida）、毕赤酵母属（pichia）、汉逊酵母属（hansenula）、克鲁维酵母属（kluyveromyces）、酵母属（saccharomyces）、埃希氏菌属（escherichia）、发酵单胞菌属（zymomonas）、子囊菌酵母属（yarrowia）、甲基杆菌属（methylobacterium）、罗尔斯通氏菌属（ralstonia）、假单胞菌属（pseudomonas）、红螺菌属（rhodospirillum）、红细菌属（rhodobacter）、伯克霍尔德氏菌属（burkholderia）、梭菌属（clostridium）和贪铜菌属（cupriavidus）。更具体地，所述细胞可以选自构巢曲霉(aspergillusnidulans)、黑曲霉(aspergillusniger)、广泛产碱菌(alcaligeneslatus)、巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、黄色短杆菌(brevibacteriumflavum)、乳糖发酵短杆菌(brevibacteriumlactofermentum)、须芒草伯克霍尔德氏菌(burkholderiaandropogonis)、b.brasilensis、b.caledonica、b.caribensis、b.caryophylli、b.fungorum、b.gladioli、b.glathei、b.glumae、布氏白粉菌(b.graminis)、b.hospita、b.kururiensis、b.phenazinium、肿块伯克霍尔德氏菌(b.phymatum)、b.phytofirmans、b.plantarii、b.sacchari、b.singaporensis、b.sordidicola、b.terricola、b.tropica、b.tuberum、b.ubonensis、b.unamae、b.xenovorans、b.anthina、b.pyrrocinia、泰国伯克霍尔德氏菌(b.thailandensis)、candidablankii、皱褶假丝酵母(candidarugosa)、谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)、corynebacteriumefficiens、大肠杆菌(escherichiacoli)、多形汉逊酵母(hansenulapolymorpha)、乳酸克鲁维酵母(kluveromyceslactis)、扭脱甲基杆菌(methylobacteriumextorquens)、paracoccusversutus、pseudomonasargentinensis、p.borbori、p.citronellolis、p.flavescens、p.mendocina、p.nitroreducens、p.oleovorans、p.pseudoalcaligenes、p.resinovorans、p.straminea、p.aurantiaca、p.aureofaciens、p.chlororaphis、p.fragi、p.lundensis、p.taetrolens、p.antarctica、p.azotoformans、'p.blatchfordae'、p.brassicacearum、p.brenneri、p.cedrina、p.corrugata、p.fluorescens、p.gessardii、p.libanensis、p.mandelii、p.marginalis、p.mediterranea、p.meridiana、p.migulae、p.mucidolens、p.orientalis、p.panacis、p.proteolytica、p.rhodesiae、p.synxantha、p.thivervalensis、p.tolaasii、p.veronii、p.denitrificans、p.pertucinogena、p.cremoricolorata、p.fulva、p.monteilii、p.mosselii、p.parafulva、恶臭假单胞菌(p.putida)、p.balearica、p.stutzeri、p.amygdali、p.avellanae、p.caricapapayae、p.cichorii、p.coronafaciens、p.ficuserectae、'p.helianthi'、p.meliae、p.savastanoi、丁香假单胞菌(p.syringae)、p.tomato、p.viridiflava、p.abietaniphila、p.acidophila、p.agarici、p.alcaliphila、p.alkanolytica、p.amyloderamosa、p.asplenii、p.azotifigens、p.cannabina、p.coenobios、p.congelans、p.costantinii、p.cruciviae、p.delhiensis、p.excibis、p.extremorientalis、p.frederiksbergensis、褐鞘假单胞菌(p.fuscovaginae)、p.gelidicola、p.grimontii、p.indica、p.jessenii、p.jinjuensis、p.kilonensis、克氏假单胞菌(p.knackmussii)、p.koreensis、p.lini、p.lutea、p.moraviensis、p.otitidis、p.pachastrellae、p.palleroniana、p.papaveris、p.peli、p.perolens、p.poae、p.pohangensis、p.psychrophila、p.psychrotolerans、p.rathonis、p.reptilivora、p.resiniphila、p.rhizosphaerae、p.rubescens、p.salomonii、p.segitis、p.septica、p.simiae、p.suis、p.thermotolerans、铜绿假单孢菌(p.aeruginosa)、p.tremae、p.trivialis、p.turbinellae、p.tuticorinensis、p.umsongensis、p.vancouverensis、p.vranovensis、p.xanthomarina、富养罗尔斯通氏菌(ralstoniaeutropha)、深红红螺菌(rhodospirillumrubrum)、球形红细菌(rhodobactersphaeroides)、酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)、解脂耶氏酵母（yarrowialipolytica）和移动发酵单胞菌（zymomonasmobile）。更具体地，所述细胞可以是选自以下的细菌细胞：不动杆菌属种（acinetobactersp.）、芽孢杆菌属种（bacillussp.）、短杆菌属种（brevibacteriumsp.）、伯克霍尔德氏菌属种（burkholderiasp.）、小球藻属种（chlorellasp.）、梭菌属种（clostridiumsp.）、棒杆菌属种（corynebacteriumsp.）、蓝细菌（cyanobakterien）、埃希氏菌属种（escherichiasp.）、假单胞菌属种（pseudomonassp.）、克雷伯氏菌属种（klebsiellasp.）、沙门氏菌属种（salmonellasp.）、根瘤菌属种（rhizobiumsp.）、酵母属种（saccharomycessp.）、毕赤酵母属种（pichiasp.）和念珠蓝细菌属种(nostocsp.)。甚至更具体地，所述细胞可以选自枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）、泰国伯克霍尔德氏菌（burkholderiathailandensis）、谷氨酸棒杆菌（corynebacteriumglutamicum）、大肠杆菌（e.coli）、产酸克雷伯氏菌（klebsiellaoxytoca）、荧光假单胞菌（pseudomonasfluorescens）、恶臭假单胞菌（pseudomonasputida）、施氏假单胞菌（pseudomonasstutzeri）、苜蓿根瘤菌（rhizobiummeliloti）、酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）和巴斯德毕赤酵母（pichiapastoris）。在一个实施例中，根据本发明的任何方面的细胞可以是这样的细胞，其经过遗传修饰以增加包含seqidno:4的酶e2或其变体的表达以及包含seqidno:2的酶e1或其变体的表达。根据本发明的任何方面的细胞可以是非致病性细胞，其经过遗传修饰以相对于野生型细胞增加酶(e2)和酶(e1)的异源表达，所述酶(e2)能够将3-羟基烷酰基-3-羟基烷酰基辅酶a/acp和/或3-(3-羟基烷酰氧基)链烷酸(haa)转化成β-d-吡喃葡萄糖基-3-羟基烷酰基-3-羟基链烷酸酯，其中e2是糖基转移酶(ec2.4)；所述酶(e1)能够将3-羟基烷酰基辅酶a/acp转化成3-羟基烷酰基-3-羟基烷酰基辅酶a/acp和进一步转化成3-(3-羟基烷酰氧基)链烷酸(haa)，其中e1是3-(3-羟基烷酰氧基)链烷酸(haa)合酶。根据本发明的另一个方面的细胞可以是非致病性细胞，其经过遗传修饰以相对于野生型细胞增加酶(e2)和酶(e1)的异源表达，所述酶(e2)能够将3-羟基烷酰基-3-羟基烷酰基辅酶a/acp或haa转化成β-d-吡喃葡萄糖基-3-羟基烷酰基-3-羟基链烷酸酯，其中e2是包含seqidno:4的糖基转移酶(ec2.4)；所述酶(e1)能够将3-羟基烷酰基辅酶a/acp转化成3-羟基烷酰基-3-羟基烷酰基辅酶a/acp和进一步转化成3-(3-羟基烷酰氧基)链烷酸(haa)，其中e1是包含seqidno:2的3-(3-羟基烷酰氧基)链烷酸(haa)合酶。根据本发明的任何方面的细胞可以是非致病性细胞，其经过遗传修饰以相对于野生型细胞增加酶(e2)和酶(e1)的异源表达，所述酶(e2)能够将3-羟基烷酰基-3-羟基烷酰基辅酶a/acp或3-(3-羟基烷酰氧基)链烷酸(haa)转化成β-d-吡喃葡萄糖基-3-羟基烷酰基-3-羟基链烷酸酯，其中e2是糖基转移酶(ec2.4)；所述酶(e1)能够将3-羟基烷酰基辅酶a/acp转化成3-羟基烷酰基-3-羟基烷酰基辅酶a/acp和进一步转化成haa，其中e1是包含seqidno:6的3-(3-羟基烷酰氧基)链烷酸(haa)合酶。根据本发明的一个其它方面的细胞可以是非致病性细胞，其经过遗传修饰以相对于野生型细胞增加酶(e2)和酶(e1)的异源表达，所述酶(e2)能够将3-羟基烷酰基-3-羟基烷酰基辅酶a/acp或haa转化成β-d-吡喃葡萄糖基-3-羟基烷酰基-3-羟基链烷酸酯，其中e2是糖基转移酶(ec2.4)；所述酶(e1)能够将3-羟基烷酰基辅酶a/acp转化成3-羟基烷酰基-3-羟基烷酰基辅酶a/acp和进一步转化成3-(3-羟基烷酰氧基)链烷酸(haa)，其中e1是包含seqidno:8的3-(3-羟基烷酰氧基)链烷酸(haa)合酶。根据本发明的另一个方面的细胞可以是非致病性细胞，其经过遗传修饰以相对于野生型细胞增加酶(e2)和酶(e1)的异源表达，所述酶(e2)能够将3-羟基烷酰基-3-羟基烷酰基辅酶a/acp或haa转化成β-d-吡喃葡萄糖基-3-羟基烷酰基-3-羟基链烷酸酯，其中e2是糖基转移酶(ec2.4)；所述酶(e1)能够将3-羟基烷酰基辅酶a/acp转化成3-羟基烷酰基-3-羟基烷酰基辅酶a/acp和进一步转化成3-(3-羟基烷酰氧基)链烷酸(haa)，其中e1是包含seqidno:10的3-(3-羟基烷酰氧基)链烷酸(haa)合酶。根据本发明的另一个方面的细胞可以是非致病性细胞，其经过遗传修饰以相对于野生型细胞增加酶(e2)和酶(e1)的异源表达，所述酶(e2)能够将3-羟基烷酰基-3-羟基烷酰基辅酶a/acp或haa转化成β-d-吡喃葡萄糖基-3-羟基烷酰基-3-羟基链烷酸酯，其中e2是包含seqidno:4的糖基转移酶(ec2.4)；所述酶(e1)能够将3-羟基烷酰基辅酶a/acp转化成3-羟基烷酰基-3-羟基烷酰基辅酶a/acp和进一步转化成3-(3-羟基烷酰氧基)链烷酸(haa)，其中e1是包含seqidno:12的3-(3-羟基烷酰氧基)链烷酸(haa)合酶。根据本发明的另一个方面的细胞可以是非致病性细胞，其经过遗传修饰以相对于野生型细胞增加酶(e2)和酶(e1)的异源表达，所述酶(e2)能够将3-羟基烷酰基-3-羟基烷酰基辅酶a/acp或haa转化成β-d-吡喃葡萄糖基-3-羟基烷酰基-3-羟基链烷酸酯，其中e2是包含seqidno:4的糖基转移酶(ec2.4)；所述酶(e1)能够将3-羟基烷酰基辅酶a/acp转化成3-羟基烷酰基-3-羟基烷酰基辅酶a/acp和进一步转化成3-(3-羟基烷酰氧基)链烷酸(haa)，其中e1是包含seqidno:14的3-(3-羟基烷酰氧基)链烷酸(haa)合酶。根据本发明的任何方面的细胞可以用于从碳底物生产根据通式i和/或ii的脂质：通式i通式ii其中在通式i或ii中的r1和r2彼此独立地是具有5-13个碳原子的相同或不同的烷基。具体地，所述烷基可以是饱和的或不饱和的。更具体地，r1和/或r2的烷基可以是单不饱和的烷基残基。甚至更具体地，r1和/或r2可以选自戊烯基、庚烯基、壬烯基、十一烯基、十三烯基和(ch2)n-ch3，其中n=4-12。形成的脂质可以是在单个反应过程中可产生的具有不同r基团的通式i和ii的脂质的组合。为了生产上述产物的目的，可以在分批过程（分批培养）中或在补料分批过程（补料过程）或重复的补料分批过程（重复补料过程）中使根据本发明的遗传修饰的细胞连续地或不连续地与营养培养基接触，并如此培养。如gb-a-1009370中所述，也可以考虑半连续过程。在chmiel的教科书(“bioprozesstechnik1.einführungindiebioverfahrenstechnik”[生物过程技术1.生物过程技术的介绍](gustavfischerverlag,斯图加特,1991))中或在storhas的教科书(“bioreaktorenundperiphereeinrichtungen”[生物反应器和周围装置],viewegverlag,brunswick/wiesbaden,1994)中，描述了已知的培养方法的总结。要使用的培养基必须以合适的方式满足各菌株的需求。例如，在“nonconventionalyeastinbiotechnology（生物技术中的非常规酵母）”（klauswolf编,springer-verlagberlin,1996）中包含了不同酵母菌株的培养基的描述。根据本发明的任何方面用作底物的碳源可以选自碳水化合物，例如，葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、木糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉、纤维素和半纤维素，植物和动物油和脂肪，例如，大豆油、红花油、花生油、大麻籽油、麻风树油、椰子脂肪、葫芦油、亚麻籽油、玉米油、罂粟籽油、月见草油、橄榄油、棕榈仁油、棕榈油、油菜籽油、芝麻油、葵花籽油、葡萄籽油、胡桃油、小麦胚芽油和椰子油，脂肪酸，例如，辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、花生四烯酸、山嵛酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、γ-亚麻酸和它的甲基或乙基酯以及脂肪酸混合物，含有刚刚提及的脂肪酸的甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯，醇，例如，甘油、乙醇和甲醇，烃诸如甲烷、乙烷、丙烷或丁烷含碳气体和气体混合物，诸如co、co2、合成气或烟道气，氨基酸诸如l-谷氨酸盐或l-缬氨酸，或有机酸例如乙酸。这些物质可以单独使用或作为混合物使用。如在us6,136,576中所述，使用碳水化合物、尤其是单糖、寡糖或多糖作为碳源，以及使用烃，尤其是烷烃、烯烃和炔烃。具体地，碳源可以选自葡萄糖、右旋糖、蔗糖、多糖诸如纤维素或半纤维素、植物油、动物脂肪、脂肪酸、脂肪酸酯、含碳气体、烷烃、甘油、乙酸盐、乙醇和甲醇。更具体地，所述碳源可以选自葡萄糖、蔗糖、甘油、植物油、甲烷、乙烷和丁烷。本发明的一个很大优点是，根据本发明的细胞能够从最简单的碳源例如葡萄糖、蔗糖或甘油形成具有通式i和/或ii的脂质，从而使得在根据本发明的任何方面的方法期间不必在培养基中提供长链c源。根据本发明的一个方面提供了生产至少一种具有通式ii的脂质的方法：通式ii其中r1和r2彼此独立地是具有5-13个碳原子的相同或不同的烷基，且其中所述方法包括使至少一个根据本发明的任何方面的细胞与至少一种碳源接触的步骤。具体地，r1和/或r2的烷基可以是饱和的或不饱和的。更具体地，r1和/或r2的烷基可以是单不饱和的烷基残基。甚至更具体地，r1和/或r2可以选自戊烯基、庚烯基、壬烯基、十一烯基、十三烯基和(ch2)n-ch3，其中n=4-12。根据本发明的任何方面的方法也可以用于从碳底物生产具有通式i的另外脂质，通式i其中r1和r2彼此独立地是具有5-13个碳原子的相同或不同的烷基。具体地，r1和/或r2的烷基可以是饱和的或不饱和的。更具体地，r1和/或r2的烷基可以是单不饱和的烷基残基。甚至更具体地，r1和/或r2可以选自戊烯基、庚烯基、壬烯基、十一烯基、十三烯基和(ch2)n-ch3，其中n=4-12。根据本发明的任何方面的方法可以用于生产脂质的混合物，其包含通式i和ii中的脂质。具体地，以1:100、1:90、1:80、1:70、1:60、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1或100:1的比率生产通式i和ii的脂质。更特别地，式i和ii的脂质可以具有在r亚基中同时存在的不同长度的烷基。根据本发明的另一个方面，提供了根据本发明的任何方面的细胞用于生产至少一种具有通式i和/或ii的脂质的用途：通式i通式ii其中r1和r2彼此独立地是具有5-13个碳原子的相同或不同的烷基。具体地，r1和/或r2的烷基可以是饱和的或不饱和的。更具体地，r1和/或r2的烷基可以是单不饱和的烷基残基。甚至更具体地，r1和/或r2可以选自戊烯基、庚烯基、壬烯基、十一烯基、十三烯基和(ch2)n-ch3，其中n=4-12。实施例前面描述了优选的实施方案，其如本领域技术人员将理解的，可以进行设计、构造或运行方面的变化或修改，而不脱离权利要求的范围。例如，这些变化意图被权利要求的范围涵盖。实施例1深红沙雷氏菌基因rbwab的表达载体的构建为了从深红沙雷氏菌异源表达基因rbwa(seqidno.1)作为酶e1和rbwb(seqidno.3)作为酶e2，构建了质粒pacyc_rbwab_srub。将由分别编码3-(3’-羟基烷酰氧基)链烷酸(haa)合酶(rbwa,seqidno:2)和葡萄糖基转移酶(rbwb,seqidno:4)的rbwab_srub(seqidno:15)组成的合成操纵子在鼠李糖诱导型启动子prha的控制下克隆进载体pacycath-5中，其基于paycy184(newenglandbiolabs,frankfurt/main,德国)。终止子序列位于合成操纵子的下游。通过pcr从深红沙雷氏菌(s.rubidaea)的基因组dna扩增所述基因。从大肠杆菌k12基因组dna扩增prha启动子盒(seqidno:16)和终止子序列(seqidno:17)。质粒pacycath-5携带用于大肠杆菌的p15a复制起点和用于在恶臭假单胞菌kt2440中复制的pvs1复制起点。pvs1来源来自假单胞菌质粒pvs1(itohy,等人.plasmid1984,11(3),206-20)。rbwa和rbwb通过交叉pcr融合以生成经优化的操纵子。为了扩增，根据生产商的手册使用了来自newenglandbiolabs(frankfurt/main,德国)的phusiontm高保真度主混合物（high-fidelitymastermix）。在下一步中，使用限制位点apai/pspxi将融合构建体克隆进载体pacycath-5。将连接的产物转化进化学感受态的大肠杆菌dh5α细胞(newenglandbiolabs,frankfurt/main,德国)。根据生产商的手册进行pcr纯化、克隆和转化的规程。通过限制性分析检查靶基因的正确插入，并通过dna测序验证引入的dna片段的真实性。所得质粒命名为pacyc_rbwab_srub(seqidno:18)。借助于电穿孔(iwasakik,等人,biosci.biotech.biochem.1994.58(5):851-854))用质粒pacyc_rbwab_srub转化恶臭假单胞菌菌株kt2440，并铺板在补充了卡那霉素(50µg/ml)的lb-琼脂平板上。通过质粒制备和分析限制性分析检查转化体中是否存在正确的质粒。所得菌株命名为bs-pp-360(恶臭假单胞菌kt2440pacyc_rbwab_srub)。实施例2深红沙雷氏菌基因rbwa的表达载体的构建为了从深红沙雷氏菌异源表达基因rbwa(seqidno:1)，构建了质粒pacyc_rbwa_srub。关于该方案，用限制性酶nsii和xhoi切割质粒pacyc_rbwab_srub(参见实施例1)以消除rbwb。为了重新连接经修饰的载体，用t4dna聚合酶(newenglandbiolabs,frankfurt/main,德国)处理质粒，以便除去3’突出端和填充5’突出端以形成平头末端。将重新连接的产物转化进化学感受态的大肠杆菌dh5α细胞(newenglandbiolabs,frankfurt/main,德国)中。根据生产商的手册进行pcr纯化、克隆和转化的规程。通过限制性分析检查靶基因的正确插入，并通过dna测序验证引入的dna片段的真实性。所得质粒命名为pacyc_rbwa_srub(seqidno:19)。借助于电穿孔(iwasakik,等人.biosci.biotech.biochem.1994.58(5):851-854)用质粒pacyc_rbwa_srub转化恶臭假单胞菌菌株kt2440，并铺板在补充了卡那霉素(50µg/ml)的lb-琼脂平板上。通过质粒制备和分析限制性分析检查转化体中是否存在正确的质粒。所得菌株命名为bs-pp-433(恶臭假单胞菌kt2440pacyc_rbwa_srub)。实施例3铜绿假单孢菌基因rhla和深红沙雷氏菌基因rbwb的表达载体的构建为了来自铜绿假单孢菌的基因rhla(seqidno:5)和来自深红沙雷氏菌的rbwb(seqidno:3)的异源表达，构建了质粒pacyc_rhla_parbwb_srub。将由分别编码3-(3-羟基烷酰氧基)链烷酸(haa)合酶(rhla,seqidno:6)和葡萄糖基转移酶(rbwb,seqidno:4)的rhla_pa(seqidno:20)组成的合成操纵子在鼠李糖诱导型启动子prha的控制下克隆进载体pacycath-5中。终止子序列位于合成操纵子的下游。通过pcr分别从铜绿假单孢菌和深红沙雷氏菌的基因组dna扩增所述基因。从大肠杆菌k12基因组dna扩增prha启动子盒(seqidno:16)和终止子序列(seqidno:17)。所述载体是基于pacyc184(newenglandbiolabs,frankfurt/main,德国)，并携带用于大肠杆菌的p15a复制起点和用于在恶臭假单胞菌kt2440中复制的pvs1复制起点。pvs1来源来自假单胞菌属质粒pvs1(itohy,watsonjm,haasd,leisingert,plasmid1984,11(3),206-20)。rhla和rbwb通过交叉pcr融合以生成经优化的操纵子。为了扩增，根据生产商的手册使用了来自newenglandbiolabs(frankfurt/main,德国)的phusiontm高保真度主混合物。在下一步中，使用限制位点apai/pspxi将融合构建体克隆进载体pacycath-5。将连接的产物转化进化学感受态的大肠杆菌dh5α细胞(newenglandbiolabs,frankfurt/main,德国)。根据生产商的手册进行pcr纯化、克隆和转化的规程。通过限制性分析检查靶基因的正确插入，并通过dna测序验证引入的dna片段的真实性。所得质粒命名为pacyc_rhla_parbwb_srub(seqidno:21)。借助于电穿孔(iwasakik,等人,biosci.biotech.biochem.1994.58(5):851-854))用质粒pacyc_rhla_parbwb_srub转化恶臭假单胞菌菌株kt2440，并铺板在补充了卡那霉素(50µg/ml)的lb-琼脂平板上。通过质粒制备和分析限制性分析检查转化体中是否存在正确的质粒。所得菌株命名为bs-pp-368(恶臭假单胞菌kt2440pacyc_rhla_parbwb_srub)。实施例4用菌株bs-pp-433(恶臭假单胞菌kt2440pacyc_rbwa_srub)生产脂质r1为了生产脂质r1，使用来自eppendorf（德国汉堡）的dasgip®平行生物反应器系统。使用1l反应器进行发酵。在线测量ph和po2以进行过程监测。otr/ctr测量尤其用于估计代谢活性和细胞适应性。根据dasgip的技术说明中的规定，使用ph4.0和ph7.0的标准溶液通过两点校准对ph电极进行校准。给反应器配备了技术说明中指定的必要传感器和连接，并装有搅拌器轴。然后给反应器填充300ml水，并在121℃高压灭菌20min以确保无菌。将po2电极连接到测量放大器，并极化过夜（至少6小时）。此后，在洁净台下除去水，并用发酵培养基(2.2g/l(nh4)2so4,0.02g/lnacl,0.4g/lmgso4x7h2o,0.04g/lcacl2x2h2o,单独灭菌:2g/lkh2po4,8.51g/lkh2po4,20g/l葡萄糖,10ml/l痕量元素溶液m12(无菌过滤:0.2g/lznso4x7h2o,0.1g/lmncl2x4h2o,1.5g/lna3-citratx2h2o,0.1g/lcuso4x5h2o,0.002g/lnicl2x6h2o,0.003g/lna2moo4x2h2o,0.03g/lh3bo3,1g/lfeso4x7h2o)替换。此后，通过单点校准将po2电极校准至100％(搅拌器:600rpm/通气，10sl/h空气)，并按技术说明的规定通过“就地清洁”来清洁进料、校正剂和诱导剂管线。为此目的，将管道首先用70％乙醇冲洗，然后用1mnaoh冲洗，然后用无菌的完全脱矿质水冲洗，最后用相应的介质填充。使用bs-pp-433(恶臭假单胞菌菌株kt2440pacyc_rbwa_srub)，给在有挡板的摇瓶中的25ml补充了卡那霉素(50µg/ml)的lb1培养基(10g/l胰蛋白胨,5g/l酵母浸出物,1g/lnacl,ph7.0)接种100µl甘油储备溶液，并在30℃和200rpm温育约18h过夜。第一次预培养物用于接种在500ml有挡板的摇瓶中的50ml种子培养基(高压灭菌：4.4g/lna2hpo4*2h2o,1.5g/lkh2po4,1g/lnh4cl,10g/l酵母浸出物,单独灭菌:20g/l葡萄糖,0.2g/lmgso4*7h2o,0.006g/lfecl3,0.015g/lcacl2,1ml/l痕量元素溶液sl6(无菌过滤:0.3g/lh3bo3,0.2g/lcocl2x6h2o,0.1g/lznso4x7h2o,0.03g/lmncl2x4h2o,0.01g/lcucl2x2h2o,0.03g/lna2moo4x2h2o,0.02g/lnicl2x6h2o)(开始od6000.2)。将培养物在200rpm和30℃温育约7h。为了以0.7的光密度接种反应器，测量第二预培养阶段的od600并计算接种所需的培养物的量。在30ml注射器的帮助下，穿过隔膜将所需量的培养物加入热处理过并通气的反应器中。使用表1中所示的标准程序：a)b)c)脚本触发器启动31%do(1/60h)温度37℃诱导鼠李糖进料开始以后3h补料触发器50%do补料速率1.5[ml/h]表1.加热并通气的反应器使用的标准程序。用12.5%浓度的氨溶液将ph单向调节至ph7.0。在生长期和生物转化过程中，通过搅拌器速度和通气速率将培养物中的溶解氧(po2或do)调至至少30％。接种后，do从100％降至这些30%，在其余的发酵过程中，do一直保持不变。发酵以补料分批进行。进料从2.5g/l*h葡萄糖进料开始，其由500g/l葡萄糖组成，并通过指示分批阶段结束的do峰触发。进料开始以后3h，用0.2%(w/v)鼠李糖诱导脂质r1产生的表达。诱导物浓度表示在发酵开始时的体积。脂质r1的产生从诱导开始。在指定的时间点，从发酵罐中取样，以确定所产生的脂质r1的浓度。与具有空质粒的参照菌株相比，菌株bs-pp-433产生了更多的3-(3-羟基烷酰氧基)链烷酸(haa)。实施例5用菌株bs-pp-360(恶臭假单胞菌kt2440pacyc_rbwab_srub)生产rubiwettinrg1为了生产rubiwettinrg1，使用了来自eppendorf（德国汉堡）的dasgip®平行生物反应器系统。使用1l反应器进行发酵。在线测量ph和po2以进行过程监测。otr/ctr测量尤其用于估计代谢活性和细胞适应性。根据dasgip的技术说明中的规定，使用ph4.0和ph7.0的标准溶液通过两点校准对ph电极进行校准。给反应器配备了技术说明中指定的必要传感器和连接，并装有搅拌器轴。然后给反应器填充300ml水，并在121℃高压灭菌20min以确保无菌。将po2电极连接到测量放大器，并极化过夜（至少6小时）。此后，在洁净台下除去水，并用发酵培养基(2.2g/l(nh4)2so4,0.02g/lnacl,0.4g/lmgso4x7h2o,0.04g/lcacl2x2h2o,单独灭菌:2g/lkh2po4,8.51g/lkh2po4,20g/l葡萄糖,10ml/l痕量元素溶液m12(无菌过滤:0.2g/lznso4x7h2o,0.1g/lmncl2x4h2o,1.5g/lna3-citratx2h2o,0.1g/lcuso4x5h2o,0.002g/lnicl2x6h2o,0.003g/lna2moo4x2h2o,0.03g/lh3bo3,1g/lfeso4x7h2o)替换。此后，通过单点校准将po2电极校准至100％(搅拌器:600rpm/通气，10sl/h空气)，并按技术说明的规定通过“就地清洁”来清洁进料、校正剂和诱导剂管线。为此目的，将管道首先用70％乙醇冲洗，然后用1mnaoh冲洗，然后用无菌的完全脱矿质水冲洗，最后用相应的介质填充。使用恶臭假单胞菌菌株bs-pp-360，给在有挡板的摇瓶中的25ml补充了卡那霉素(50µg/ml)的lb1培养基(10g/l胰蛋白胨,5g/l酵母浸出物,1g/lnacl,ph7.0)接种100µl甘油储备溶液，并在30℃和200rpm温育约18h过夜。第一次预培养物用于接种在500ml有挡板的摇瓶中的50ml种子培养基(高压灭菌：4.4g/lna2hpo4*2h2o,1.5g/lkh2po4,1g/lnh4cl,10g/l酵母浸出物,单独灭菌:20g/l葡萄糖,0.2g/lmgso4*7h2o,0.006g/lfecl3,0.015g/lcacl2,1ml/l痕量元素溶液sl6(无菌过滤:0.3g/lh3bo3,0.2g/lcocl2x6h2o,0.1g/lznso4x7h2o,0.03g/lmncl2x4h2o,0.01g/lcucl2x2h2o,0.03g/lna2moo4x2h2o,0.02g/lnicl2x6h2o)(开始od6000.2)。将培养物在200rpm和30℃温育约7h。为了以0.7的光密度接种反应器，测量第二预培养阶段的od600并计算接种所需的培养物的量。在30ml注射器的帮助下，穿过隔膜将所需量的培养物加入热处理过并通气的反应器中。使用实施例4的表1中所示的标准程序。用12.5%浓度的氨溶液将ph单向调节至ph7.0。在生长期和生物转化过程中，通过搅拌器速度和通气速率将培养物中的溶解氧(po2或do)调至至少30％。接种后，do从100％降至这些30%，do在其余的发酵过程中保持稳定。发酵以补料分批进行。进料从2.5g/l*h葡萄糖进料开始，其由500g/l葡萄糖组成，并通过指示分批阶段结束的do峰触发。进料开始以后3h，用0.2%(w/v)鼠李糖诱导rubiwettin产生的表达。诱导物浓度表示在发酵开始时的体积。对于两种糖，使用220g/l的储备溶液。rubiwettinrg1的产生从诱导开始。在指定的时间点，从发酵罐中取样，以确定所产生的rubiwettin的浓度。发酵65h以后，生产了0.53g/lrubiwettinrg1。实施例6用菌株bs-pp-368(恶臭假单胞菌kt2440pacyc_rhla_parbwb_srub)生产rubiwettinrg1为了生产rubiwettinrg1，使用了来自eppendorf(德国汉堡)的dasgip®平行生物反应器系统。使用1l反应器进行发酵。在线测量ph和po2以进行过程监测。otr/ctr测量尤其用于估计代谢活性和细胞适应性。根据dasgip的技术说明中的规定，使用ph4.0和ph7.0的标准溶液通过两点校准对ph电极进行校准。给反应器配备了技术说明中指定的必要传感器和连接，并装有搅拌器轴。然后给反应器填充300ml水，并在121℃高压灭菌20min以确保无菌。将po2电极连接到测量放大器，并极化过夜（至少6小时）。此后，在洁净台下除去水，并用发酵培养基(2.2g/l(nh4)2so4,0.02g/lnacl,0.4g/lmgso4x7h2o,0.04g/lcacl2x2h2o,单独灭菌:2g/lkh2po4,8.51g/lkh2po4,20g/l葡萄糖,10ml/l痕量元素溶液m12(无菌过滤:0.2g/lznso4x7h2o,0.1g/lmncl2x4h2o,1.5g/lna3-citratx2h2o,0.1g/lcuso4x5h2o,0.002g/lnicl2x6h2o,0.003g/lna2moo4x2h2o,0.03g/lh3bo3,1g/lfeso4x7h2o)替换。此后，通过单点校准将po2电极校准至100％(搅拌器:600rpm/通气10sl/h空气)，并按技术说明的规定通过“就地清洁”来清洁进料、校正剂和诱导剂管线。为此目的，将管道首先用70％乙醇冲洗，然后用1mnaoh冲洗，然后用无菌的完全脱矿质水冲洗，最后用相应的介质填充。使用恶臭假单胞菌菌株bs-pp-368，给在有挡板的摇瓶中的25ml补充了卡那霉素(50µg/ml)的lb1培养基(10g/l胰蛋白胨,5g/l酵母浸出物,1g/lnacl,ph7.0)接种100µl甘油储备溶液，并在30℃和200rpm温育约18h过夜。第一次预培养物用于接种在500ml有挡板的摇瓶中的50ml种子培养基(高压灭菌：4.4g/lna2hpo4*2h2o,1.5g/lkh2po4,1g/lnh4cl,10g/l酵母浸出物,单独灭菌:20g/l葡萄糖,0.2g/lmgso4*7h2o,0.006g/lfecl3,0.015g/lcacl2,1ml/l痕量元素溶液sl6(无菌过滤:0.3g/lh3bo3,0.2g/lcocl2x6h2o,0.1g/lznso4x7h2o,0.03g/lmncl2x4h2o,0.01g/lcucl2x2h2o,0.03g/lna2moo4x2h2o,0.02g/lnicl2x6h2o)(开始od6000.2)。将培养物在200rpm和30℃温育约7h。为了以0.7的光密度接种反应器，测量第二预培养阶段的od600并计算接种所需的培养物的量。在30ml注射器的帮助下，穿过隔膜将所需量的培养物加入热处理过并通气的反应器中。加热并通气的反应器使用实施例4的表1中所示的标准程序。用12.5%浓度的氨溶液将ph单向调节至ph7.0。在生长期和生物转化过程中，通过搅拌器速度和通气速率将培养物中的溶解氧(po2或do)调至至少30％。接种后，do从100％降至这些30%，do在其余的发酵过程中保持稳定。发酵以补料分批进行。进料从2.5g/l*h葡萄糖进料开始，其由500g/l葡萄糖组成，并通过指示分批阶段结束的do峰触发。进料开始以后3h，用0.2%(w/v)鼠李糖诱导rubiwettin产生的表达。诱导物浓度表示在发酵开始时的体积。对于两种糖，使用220g/l的储备溶液。rubiwettinrg1的产生从诱导开始。在指定的时间点，从发酵罐中取样，以确定所产生的rubiwettin的浓度。发酵65h以后，生产了11.1g/lrubiwettinrg1。实施例7基于hplc的rubiwettin定量通过hplc进行脂质r1和rg1的定量。使用位移移液器(combitip)，将900µl的70%(v/v)正丙醇引入2ml反应容器中，并立即关闭反应容器以减少蒸发。随后添加100µl发酵液。在retsch研磨机中以30hz的频率振摇1min后，将得到的粗提取混合物在13,000rpm离心5min，然后将800µl澄清上清液转移进hplc瓶。在55%(v/v)丙醇中进行细胞液体培养物的进一步稀释。在测量之前在-20℃储存样品。为了检测和定量脂质，使用了蒸发光散射检测器(sedexlt-elsdmodel85lt)。借助于agilenttechnologies1200series(santaclara,calif.)和zorbaxsb-c8rapidresolutioncolumn(4,6x150mm,3,5µm,agilent)进行测量。注射体积为5.0µl，运行时间为20min。流动相a:0.1%tfa水溶液(三氟乙酸,溶液)；流动相b:甲醇。柱温度为40℃。elsd(检测器温度60℃)和dad(二极管阵列,210nm)用作检测器。梯度:t[min]流速[1ml/min]0.0070%1.0015.00100%1.0015.0170%1.0020.0070%1.00表2.a和b的流动相随时间的梯度。所用的梯度在15分钟内从70％b在a中的溶液到100％b，流速为1ml/min，然后用70％b在a中的溶液重新平衡5分钟(参见表2)。使用了参考材料，通过hplc-ms/ms和nmr检查其身份和纯度。实施例8用于生产rubiwettinr1和rubiwettinrg1的根癌土壤杆菌菌株的构建为了显示用另一种微生物物种根癌土壤杆菌生产rubiwettin，我们制备了根癌土壤杆菌lba4404的电感受态细胞，并用质粒pacyc_rbwa_srub(seqidno:19)、pacyc_rbwab_srub(seqidno:18)和pacyc_rhla_parbwb_srub(seqidno:21)转化它。为此目的，将新鲜生长的根癌土壤杆菌lba4404的细胞（1-2天龄）铺在lb琼脂平板(直径90mm,10g/l胰蛋白胨,5g/l酵母浸出物,5g/lnacl,和15g/l琼脂，补充了50μg/ml利福平)上，并在27℃温育过夜(约16h)以产生完全覆盖平板表面的细菌性草坪。用4ml冰冷的10%(v/v)无菌甘油将细菌细胞从平板小心地洗掉。用接种环刮去生长在平板表面上的细胞，避免损坏琼脂培养基，并悬浮在甘油溶液中。然后将细菌悬浮液转移进两个无菌的2ml离心管中。将两个试管中的悬浮液在4℃在14,000rpm(18,000g)离心1min；丢弃上清液。将1ml冰冷的10%(v/v)无菌甘油添加到每个装有细菌沉淀物的试管中。此后将试管彻底涡旋以重新悬浮细胞，并将该洗涤步骤再重复一次。两个离心步骤后，将上清液移出并再次丢弃，并将两个试管中的细菌沉淀物各重新悬浮于200μl冰冷的10%(v/v)无菌甘油中，并合并在一个试管中（共产生400μl）。将含有土壤杆菌细胞悬浮液的试管保持在冰上直至电穿孔。为了电穿孔，在无菌离心管中将70-80μl的电感受态细菌细胞的冰冷悬浮液与1-3μl质粒dna(1-100ng)混合。将该混合物装入冷却的电穿孔容器（间隙=2mm）中，并放入容器架中。用以下参数使用电穿孔仪(genepulserxcell™microbialelectroporationsystems;bio-rad)：2.5kv，25μf电容，和400ohm电阻。立即将1mlsoc培养基(20mm葡萄糖,20g/l胰蛋白胨,5g/l酵母浸出物,10mmnacl,2.5mmmgcl2,和10mmmgso4)添加到电穿孔容器中，并将得到的细菌悬浮液转移进15ml离心管，并将该管在旋转下在27℃温育1h。温育后，将每份电穿孔细胞悬浮液中的100μl分散在补充了卡那霉素(50μg/ml)的lb平板上。将板在27℃温育2天，并通过质粒分离和分析限制酶切消化证实成功转化的菌落。产生了以下菌株：用于生产rubiwettinr1的根癌土壤杆菌lba4404pacyc_rbwa_srub用于生产rubiwettinrg1的根癌土壤杆菌lba4404pacyc_rbwab_srub用于生产rubiwettinrg1的根癌土壤杆菌lba4404pacyc_rhla_parbwb_srub。实施例9用根癌土壤杆菌lba4404pacyc_rbwa_srub生产rubiwettinr1以及用根癌土壤杆菌lba4404pacyc_rbwab_srub和根癌土壤杆菌lba4404pacyc_rhla_parbwb_srub生产rubiwettinrg1为了生产rubiwettinr1和rg1，使用了来自eppendorf(德国汉堡)的dasgip®平行生物反应器系统。使用1l反应器进行发酵。在线测量ph和po2以进行过程监测。otr/ctr测量尤其用于估计代谢活性和细胞适应性。根据dasgip的技术参考，使用ph4.0和ph7.0的测量溶液通过两点校准对ph探头进行校准。根据技术参考给反应器提供了需要的传感器和连接，并安装搅拌器轴。然后给反应器填充300ml水，并在121℃高压灭菌20min以确保无菌。将po2探头连接到测量放大器后极化过夜（至少6小时）。然后在洁净台下除去水，并用高细胞密度培养基替换，所述高细胞密度培养基由(nh4)2so41.76g/l、k2hpo419.08g/l、kh2po412.5g/l、酵母浸出物6.66g/l、柠檬酸三钠二水合物11.2g/l、17ml/l的过滤除菌的1%浓度的柠檬酸铁铵溶液和5ml/l的过滤除菌的痕量元素储备溶液(由hcl(37%)36.50g/l、mncl2*4h2o1.91g/l、znso4*7h2o1.87g/l、乙二胺四乙酸二水合物0.84g/l、h3bo30.30g/l、na2moo4*2h2o0.25g/l、cacl2*2h2o4.70g/l、feso4*7h2o17.80g/l、cucl2*2h2o0.15g/l组成)组成，其含有15g/l葡萄糖作为碳源(通过计量添加30ml/l的由500g/l葡萄糖、1%(w/v)mgso4*7h2o和2.2%(w/v)nh4cl组成的无菌补料溶液而加入)和50mg/l卡那霉素。随后，使用单点校准(搅拌器:600rpm/通气:10sl/h空气)将po2探头校准至100％，并根据技术参考通过就地清洁来清洁进料、校正剂和诱导剂管线。为此，将管线首先用70%乙醇冲洗，然后用1mnaoh冲洗，然后用无菌的脱矿质水冲洗，最后用相应的介质填充。为了用根癌土壤杆菌lba4404pacyc_rbwa_srub生产rubiwettinr1以及用根癌土壤杆菌lba4404pacyc_rbwab_srub和根癌土壤杆菌lba4404pacyc_rhla_parbwb_srub生产rubiwettinrg1，首先从含有50mg/l卡那霉素的lb培养基(25ml在100ml带有挡板的摇瓶中)的冷冻培养物在28℃和200rpm培养三株菌株过夜约18h。然后，将2ml此培养物转移至第二个预培养阶段，转移到在100ml摇瓶中的25ml高细胞密度培养基中，该培养基由(nh4)2so41.76g/l、k2hpo419.08g/l、kh2po412.5g/l、酵母浸出物6.66g/l、柠檬酸三钠二水合物11.2g/l、17ml/l的过滤除菌的1%浓度的柠檬酸铁铵溶液和5ml/l的过滤除菌的痕量元素储备溶液(由hcl(37%)36.50g/l、mncl2*4h2o1.91g/l、znso4*7h2o1.87g/l、乙二胺四乙酸二水合物0.84g/l、h3bo30.30g/l.na2moo4*2h2o0.25g/l、cacl2*2h2o4.70g/l、feso4*7h2o17.80g/l、cucl2*2h2o0.15g/l组成)组成，含有15g/l葡萄糖作为碳源(通过计量添加30ml/l的由500g/l葡萄糖、1%(w/v)mgso4*7h2o和2.2%(w/v)nh4cl组成的无菌补料溶液而加入)，含有已经描述的抗生素，并在28℃/200rpm温育另外6h。为了以0.1的光密度接种反应器，测量第二预培养阶段的od600，并计算接种所需的培养物的量。在5ml注射器的帮助下，穿过隔膜将所需量的培养物添加到热处理过并通气的反应器中。表3中显示了使用的标准程序：脚本触发器启动31%do(1/60h)诱导鼠李糖进料开始以后3h补料触发器50%do补料速率1[ml/h]表3.用土壤杆菌菌株生产rubiwettin的标准程序。用12.5%浓度的氨溶液将ph单向调节至6.8。在培养和生物转化过程中，通过搅拌器速度和通气速率将培养物中的溶解氧(po2或do)调节至至少30%。接种后，do从100％下降到该30％，在其余发酵过程中do保持稳定。温度保持稳定在28℃。发酵以补料分批进行，其中以1.5g/l*h葡萄糖进料触发进料开始作为向补料阶段的递送，所述葡萄糖进料由500g/l葡萄糖、1%(w/v)mgso4*7h2o和2.2%(w/v)nh4cl组成，通过do峰诱导分批阶段的结束。进料开始以后3h，用0.2%(w/v)鼠李糖诱导了rubiwettin产生。诱导物浓度表示在发酵开始时的体积。使用220g/l的鼠李糖储备溶液。如实施例7中所述进行rubiwettinr1和rg1的形成的定量。证实了根癌土壤杆菌lba4404pacyc_rbwa_srub生成rubiwettinr1。还证实了根癌土壤杆菌lba4404pacyc_rbwab_srub和根癌土壤杆菌lba4404pacyc_rhla_parbwb_srub都生成rubiwettinrg1。实施例10用于生产rubiwettinr1和rubiwettinrg1的大肠杆菌菌株的构建通过电穿孔将质粒pacyc_rbwa_srub(seqidno:19)、pacyc_rbwab_srub(seqidno:18)和pacyc_rhla_parbwb_srub(seqidno:21)转化进大肠杆菌w3110中，并铺板到含有卡那霉素(50µg/ml)的lb琼脂平板上。通过质粒制备和限制酶切消化分析来筛选转化体中质粒的存在和真实性。产生了以下菌株：用于生产rubiwettinr1的大肠杆菌w3110pacyc_rbwa_srub用于生产rubiwettinrg1的大肠杆菌w3110pacyc_rbwab_srub用于生产rubiwettinrg1的大肠杆菌w3110pacyc_rhla_parbwb_srub。实施例11用大肠杆菌w3110pacyc_rbwa_srub生产rubiwettinr1以及用大肠杆菌w3110pacyc_rbwab_srub和大肠杆菌w3110pacyc_rhla_parbwb_srub生产rubiwettinrg1为了生产rubiwettinr1和rg1，使用来自eppendorf(德国汉堡)的dasgip®平行生物反应器系统。使用1l反应器进行发酵。在线测量ph和po2以进行过程监测。otr/ctr测量尤其用于估计代谢活性和细胞适应性。根据dasgip的技术参考，使用ph4.0和ph7.0的测量溶液通过两点校准对ph探头进行校准。根据技术参考给反应器提供了需要的传感器和连接，并安装搅拌器轴。然后给反应器填充300ml水，并在121℃高压灭菌20min以确保无菌。将po2探头连接到测量放大器后极化过夜（至少6小时）。然后在洁净台下除去水，并用高细胞密度培养基替换，所述高细胞密度培养基由(nh4)2so41.76g/l、k2hpo419.08g/l、kh2po412.5g/l、酵母浸出物6.66g/l、柠檬酸三钠二水合物11.2g/l、17ml/l的过滤除菌的1%浓度的柠檬酸铁铵溶液和5ml/l的过滤除菌的痕量元素储备溶液(由hcl(37%)36.50g/l、mncl2*4h2o1.91g/l、znso4*7h2o1.87g/l、乙二胺四乙酸二水合物0.84g/l、h3bo30.30g/l、na2moo4*2h2o0.25g/l、cacl2*2h2o4.70g/l、feso4*7h2o17.80g/l、cucl2*2h2o0.15g/l组成)组成，含有15g/l葡萄糖作为碳源(通过计量添加30ml/l的由500g/l葡萄糖、1%(w/v)mgso4*7h2o和2.2%(w/v)nh4cl组成的无菌补料溶液而加入)和50mg/l卡那霉素。随后，使用单点校准(搅拌器:600rpm/通气:10sl/h空气)将po2探头校准至100％，并根据技术参考通过就地清洁来清洁进料、校正剂和诱导剂管线。为此，将管线首先用70%乙醇冲洗，然后用1mnaoh冲洗，然后用无菌的脱矿质水冲洗，最后用相应的介质填充。为了用大肠杆菌w3110pacyc_rbwa_srub生产rubiwettinr1以及用大肠杆菌w3110pacyc_rbwab_srub和大肠杆菌w3110pacyc_rhla_parbwb_srub生产rubiwettinrg1，首先从含有50mg/l卡那霉素的lb培养基(25ml在100ml带有挡板的摇瓶中)的冷冻培养物在37℃和200rpm培养三株菌株过夜约18h。然后，将2ml此培养物转移至第二个预培养阶段，转移到在100ml摇瓶中的25ml高细胞密度培养基中，该培养基由(nh4)2so41.76g/l、k2hpo419.08g/l、kh2po412.5g/l、酵母浸出物6.66g/l、柠檬酸三钠二水合物11.2g/l、17ml/l的过滤除菌的1%浓度的柠檬酸铁铵溶液和5ml/l的过滤除菌的痕量元素储备溶液(由hcl(37%)36.50g/l、mncl2*4h2o1.91g/l、znso4*7h2o1.87g/l、乙二胺四乙酸二水合物0.84g/l、h3bo30.30g/l.na2moo4*2h2o0.25g/l、cacl2*2h2o4.70g/l、feso4*7h2o17.80g/l、cucl2*2h2o0.15g/l组成)组成，含有15g/l葡萄糖作为碳源(通过计量添加30ml/l的由500g/l葡萄糖、1%(w/v)mgso4*7h2o和2.2%(w/v)nh4cl组成的无菌补料溶液而加入)，并含有已经描述的抗生素，并在37℃/200rpm温育另外6h。为了以0.1的光密度接种反应器，测量第二预培养阶段的od600，并计算接种所需的培养物的量。在5ml注射器的帮助下，穿过隔膜将所需量的培养物添加到热处理过并通气的反应器中。在表4中显示了使用的标准程序：脚本触发器启动31%do(1/60h)诱导鼠李糖进料开始以后3h补料触发器50%do补料速率3[ml/h]表4.用大肠杆菌菌株生产rubiwettin的标准程序。用12.5%浓度的氨溶液将ph单向调节至ph6.8。在培养和生物转化过程中，通过搅拌器速度和通气速率将培养物中的溶解氧(po2或do)调至至少30％。接种后，do从100％下降到该30％，在其余发酵过程中do保持稳定。温度保持稳定在37℃。发酵以补料分批进行，其中以5g/l*h葡萄糖进料触发进料开始作为向补料阶段的递送，所述葡萄糖进料由500g/l葡萄糖、1%(w/v)mgso4*7h2o和2.2%(w/v)nh4cl组成，通过do峰诱导分批阶段的结束。进料开始以后3h，用0.2%(w/v)鼠李糖诱导了rubiwettin产生。诱导物浓度表示在发酵开始时的体积。使用220g/l的鼠李糖储备溶液。如在实施例7中所述进行rubiwettinr1和rg1的形成的定量。证实了大肠杆菌w3110pacyc_rbwa_srub生成rubiwettinr1。还证实了大肠杆菌w3110pacyc_rbwab_srub和大肠杆菌w3110pacyc_rhla_parbwb_srub都生成rubiwettinrg1。当前第1页12