用于分析结构不同的复杂脂质的方法、组合物和试剂盒与流程

相关申请的交叉引用

本申请要求美国临时申请号为62/031099、申请日为2014年7月30日专利的优先权，将其公开的全部内容以引用的方式合并。

当前公开的主题涉及脂质合成的方法、组合物和试剂盒以及使用复合脂质的混合物作为内标，用于分析生物样品和其它含有复合脂质的样品。

背景技术：

使用内标校准样品中目标物的浓度是一种公认的定量方法。简而言之，一种化合物加入到没有出现过的待测样品中，满足两个条件：（1）内标的作用类似于目标化合物在样品制备的所有阶段（例如萃取、色谱等等）和（2）通过选择的检测方法区别于目标化合物。因此，如果知道加到样品中的内标的浓度，和检测相关的目标化合物与内标的反应（例如，峰面积），就可计算出起初样品中目标化合物的量。

生物样品中的脂质的通过内标来定量仍然存在问题，因为甚至在已经给出的脂质种类中，脂质也具有不同的化学属性。脂质还具有组合复杂性，例如，许多潜在的脂肪酸中的几种被酰化到十几个骨架之一上。所以，少量的内标不能满足上述两个条件中的第一个。一般来说，分析师使用少量内部标准化合物，并且通常仅选择单一化合物来代表用作大类脂质（例如磷脂，中性脂质）的内标。对于广泛的标准的选择，历史上更多地涉及生物样品中化合物的缺乏以及合成化合物的合成的容易性，而不是标准与目标分析物的化学性质的相似性。大部分的脂质内标是从单一的奇数链或者短链脂肪酸（例如pc12:0/12:0或tag17:0/17:0/17:0）中选择的。大部分的内标混合物对每个脂质大类采用单一内标。然而，目前开发内标的方法有限，因为：1）短链脂肪酸或者完全饱和脂肪酸内标在测定中不像靶化合物那样起作用；2）使用简单的内标策略难以表示脂质的组合复杂性。

需要结构上不同的一组标准，其具有用于每个脂质类的适当的化学性质以用作内标。这样一组内标提供了广泛的化学多样性，从而更好地覆盖分析。

概要

本发明描述的是质谱分析中用到的内标的组分物、试剂盒以及使用方法。复合脂质是具有与其连接的多种脂肪酸阵列的脂质类。本文提供了合成和使用组合物和试剂盒的方法，所述组合物和试剂盒包括具有足够不同组成的脂质分子作为内标的混合物，以有效地表示本发明所提供的感兴趣样品中的复合脂质类的脂肪酸。合成的内标包含本发明所描述的特征。合成的内标可以包装成试剂盒供脂质分析用。

本发明所述的脂质内标可用于任何应用，包括例如质谱法。

在本发明公开的一个实施例中，提供了一种用于合成脂质分子的一种或多种混合物的方法，该脂质分子代表存在于感兴趣样品中的一种或多种相应脂质类中的脂质分子种类的组成，所述方法包括：通过具有至少两个酰基的脂质类的酰化反应在脂质主链的第一位点连接同位素标记的脂肪酸；通过酰化反应将至少两种不同脂肪酸的混合物连接到脂质主链上的不同位点，其中所述脂肪酸混合物代表存在于感兴趣样品中的相应脂质类中的脂肪酸，所述脂肪酸混合物中的每种脂肪酸以代表存在于感兴趣样品中的相应脂质类中的脂质分子种类中脂肪酸的存在比例的比例存在。

在本发明公开的一个实施例中，提供了一种用于合成脂质分子的一种或多种混合物的方法，该脂质分子代表存在于感兴趣样品中的一种或多种相应脂质类中的脂质分子种类的组成，所述方法包括：通过具有至少一个酰基的脂质类的酰化反应将至少两种不同脂肪酸的混合物连接到同位素标记的脂质主链上的单个位点上，其中所述脂肪酸混合物代表存在于感兴趣样品中的相应脂质类中的脂肪酸，所述脂肪酸混合物中的每种脂肪酸以代表存在于感兴趣样品中的相应脂质类中的脂质分子种类中脂肪酸的存在比例的比例存在。

在本发明公开的一个实施例中，提供了一种用作内标的组合物，其包含代表存在于感兴趣样品中的一种或多种相应脂质类中的脂质分子种类组成的脂质分子的一种或多种混合物，每种脂质分子混合物包含：在脂质主链的第一位点具有同位素标记的脂肪酸的脂质主链，所述脂质主链用于具有至少两个酰基的脂质类；和存在于脂质主链上的不同位点的至少两种不同脂肪酸的混合物，所述脂肪酸的混合物代表存在于感兴趣样品中的脂质类中的脂肪酸，所述脂肪酸混合物中的每种脂肪酸以代表存在于感兴趣样品中的相应脂质类中的脂质分子种类中脂肪酸的存在比例的比例存在。

在本发明公开的一个实施例中，提供了一种用作内标的组合物，其包含代表存在于感兴趣样品中的一种或多种相应脂质类中的脂质分子种类组成的脂质分子的一种或多种混合物，每种脂质分子混合物包含：具有一个或多个同位素标记的脂质主链，其中所述脂质主链用于具有至少一个酰基的脂质类；和存在于脂质主链上的单个位点的至少两种不同脂肪酸的混合物，所述脂肪酸的混合物代表存在于感兴趣样品中的脂质类中的脂肪酸，所述脂肪酸混合物中的每种脂肪酸以代表存在于感兴趣样品中的相应脂质类中的脂质分子种类中脂肪酸的存在比例的比例存在。

在本发明公开的一个实施例中，提供一种试剂盒，包括：ⅰ）用作内标的一种或多种脂质分子的混合物，其中，每种脂质分子混合物都代表存在于感兴趣样品中的一种或多种相应脂质类的每一种中的脂质分子种类的组成，每种脂质分子混合物包含：在脂质主链上的第一位点处具有同位素标记的脂肪酸的脂质主链和在脂质主链上的不同位点存在的至少两种不同脂肪酸的混合物，其中脂质主链用于至少具有两个酰基的脂质类，或具有一个或多个同位素标记的脂质主链，和存在于脂质主链上单个位点的至少两种不同脂肪酸的混合物，其中脂质主链用于至少具有一个酰基的脂质类，其中所述脂肪酸混合物代表存在于感兴趣样品中的相应脂质类中的脂肪酸，并且，脂肪酸混合物中的每种脂肪酸以代表存在于感兴趣样品中的脂质类中的脂质分子种类中脂肪酸的存在比例的比例存在；ⅱ）使用所述一种或多种脂质分子混合物作为内标物用于检测和定量存在于感兴趣样品中的相应脂质类中的脂质分子种类的说明书。

在本发明公开的一个实施例中，提供一种用于检测和定量存在于样品中的脂质分子的方法，包含：向感兴趣的样品中加入已知量的具有一种或多种脂质分子混合物的组合物，所述混合物代表存在于感兴趣样品中的一种或多种相应脂质类中的脂质分子种类组成，其中，每种脂质分子混合物包含ⅰ）在脂质主链的第一位点具有同位素标记的脂肪酸的脂质主链，所述脂质主链用于具有至少两个酰基的脂质类，和ⅱ）存在于脂质主链上的不同位点的至少两种不同脂肪酸的混合物，所述脂肪酸的混合物代表存在于感兴趣样品中的相应脂质类中的脂肪酸，所述脂肪酸混合物中的每种脂肪酸以代表存在于感兴趣样品中的相应脂质类中的脂质分子种类中脂肪酸的存在比例的比例存在；通过使用脂质分子的代表性混合物作为内标，检测和定量存在于目标样品中的相应脂质类中的脂质分子种类。

在本发明公开的一个实施例中，提供一种用于检测和定量存在于样品中的脂质分子的方法，包含：向感兴趣的样品中加入已知量的具有一种或多种脂质分子混合物的组合物，所述混合物代表存在于感兴趣样品中的一种或多种相应脂质类中的脂质分子种类组成，其中，每种脂质分子混合物包含ⅰ）具有一个或多个同位素标记的脂质主链，其中所述脂质主链用于具有至少一个酰基的脂质类；和ⅱ）存在于脂质主链上的单个位点的至少两种不同脂肪酸的混合物，所述脂肪酸的混合物代表存在于感兴趣样品中的脂质类中的脂肪酸，所述脂肪酸混合物中的每种脂肪酸以代表存在于感兴趣样品中的相应脂质类中的脂质分子种类中脂肪酸的存在比例的比例存在；通过使用脂质分子的代表性混合物作为内标，检测和定量存在于目标样品中的相应脂质类中的脂质分子种类。

在本发明公开的一个实施例中，提供了一种用于合成一种或多种脂质分子混合物的方法，其用作代表存在于感兴趣样品中的一种或多种相应脂质类中的脂质分子种类的组成的内标，所述方法包括以下一种或多种：通过具有至少一个酰基的脂质类的酰化反应将至少两种不同的同位素标记的脂肪酸的混合物连接到脂质主链上的单个位点；通过具有至少一个酰基的脂质类的酰化反应将至少两种不同脂肪酸的混合物连接到同位素标记的脂质主链上；或者通过具有至少两种脂肪酸的脂质类的酰化反应将单一同位素标记的脂肪酸连接到脂质主链的第一位点，并通过酰化反应将至少两种不同脂肪酸的混合物连接到脂质主链上的不同位点，其中，所述至少两种不同脂肪酸的混合物代表在感兴趣样品中的相应脂质类中出现的脂肪酸，并且，混合物中的每种脂肪酸以代表存在于感兴趣样品中的相应脂质类中的脂质分子种类中脂肪酸的存在比例的比例存在。

在本发明公开的一个实施例中，提供了用作内标的组合物，其包含代表存在于感兴趣样品中的一种或多种相应脂质类中的脂质分子种类组成的脂质分子的一种或多种混合物，每种脂质分子的混合物包含以下一种或多种：在脂质主链上的单个位点处具有至少两种不同的同位素标记的脂肪酸的混合物的脂质主链，其中脂质主链用于具有至少一个酰基的脂质类；在脂质主链上的单个位点处具有至少两种不同脂肪酸的混合物的同位素标记的脂质主链，其中所述脂质主链用于具有至少一个酰基的脂质类；或者在脂质主链的第一位点处具有单一同位素标记的脂肪酸的脂质主链，并且在脂质主链的不同位点具有至少两种不同脂肪酸的混合物，其中所述脂质主链用于具有至少两种脂肪酸的脂质类，所述的具有至少两种不同脂肪酸的混合物代表存在于感兴趣样品中的相应脂质类中的脂肪酸，混合物中的每种脂肪酸以代表存在于感兴趣样品中的相应脂质类中的脂质分子种类中的脂肪酸的存在比例的比例存在。

在本发明公开的一个实施例中，提供一种试剂盒，包括ⅰ）用作内标的一种或多种脂质分子的混合物，其中，每种一种或多种脂质分子混合物都代表存在于感兴趣样品中的一种或多种相应脂质类的每一种中的脂质分子种类的组成，每种脂质分子混合物包含一种或多种：在脂质主链的单个位点具有至少两种不同的同位素标记的脂肪酸的混合物的脂质主链，其中脂质主链用于具有至少一个酰基的脂质类；在脂质主链上的单个位点处具有至少两种不同脂肪酸的混合物的同位素标记的脂质主链，其中所述脂质主链用于具有至少一个酰基的脂质类；或者在脂质主链的第一位点处具有单一同位素标记的脂肪酸的脂质主链，并且在脂质主链的不同位点具有至少两种不同脂肪酸的混合物，其中所述脂质主链用于具有至少两种脂肪酸的脂质类，所述的具有至少两种不同脂肪酸的混合物代表存在于感兴趣样品中的相应脂质类中的脂肪酸，混合物中的每种脂肪酸以代表存在于感兴趣样品中的相应脂质类中的脂质分子种类中的脂肪酸的存在比例的比例存在；和ⅱ）使用所述一种或多种脂质分子混合物作为内标物用于检测和定量存在于感兴趣样品中的相应脂质类中的脂质分子种类的说明书。

在本发明公开的一个实施例中，提供一种用于检测和定量存在于样品中的脂质分子的方法，包含：ⅰ）向感兴趣的样品中加入已知量的具有一种或多种脂质分子混合物的组合物，所述混合物代表存在于感兴趣样品中的一种或多种相应脂质类中的脂质分子种类组成，所述组合物包含以下的一种或多种：a）在脂质主链上的单个位点处具有至少两种不同的同位素标记的脂肪酸的混合物的脂质主链，其中脂质主链用于具有至少一个酰基的脂质类；b）在脂质主链上的单个位点处具有至少两种不同脂肪酸的混合物的同位素标记的脂质主链，其中所述脂质主链用于具有至少一个酰基的脂质类；或者c）在脂质主链的第一位点处具有单一同位素标记的脂肪酸的脂质主链，并且在脂质主链的不同位点具有至少两种不同脂肪酸的混合物，其中所述脂质主链用于具有至少两种脂肪酸的脂质类，所述的具有至少两种不同脂肪酸的混合物代表存在于感兴趣样品中的脂质类中的脂肪酸，混合物中的每种脂肪酸以代表存在于感兴趣样品中的相应脂质类中的脂质分子种类中的脂肪酸的存在比例的比例存在；和ⅱ）通过使用具有一种或多种脂质分子的代表性混合物的组合物作为内标物来检测和定量存在于感兴趣样品中的一种或多种相应脂质类的每一种中的脂质分子种类。

附图说明

图1为磷脂示意图，显示了根据本发明的一个或多个实施例合成磷脂内标物的总体战略。

图2a-2c为本发明的一个或多个实施例中的磷脂酰胆碱（pc）内标物结构图。（a）氘化棕榈酸酯（16：0）位于sn-1位点，“r”位于sn-2位点，（b）典例脂肪酸油酸酯(18：ln9)位于sn-2位点，（c）可以酰化至sn-2位点的8种典例脂肪酸。

图3为本发明的一种或多种实施例中的溶血磷脂酰胆碱(lpc)内标物的结构图。

图4a-4c为本发明的一个或多个实施例中的磷脂酰乙醇胺（pe）内标物的结构图。（a）氘化硬脂酸(18：0)位于sn-1位点，脂肪酸“r”位于sn-2位点，（b）典例脂肪酸油酸酯(18：ln9)位于sn-2位点，（c）可以酰化至sn-2位点的8种典例脂肪酸。

图5为本发明的一种或多种实施例中的溶血磷脂酰乙醇胺内标物的结构图。

图6a-6c为本发明的一个或多个实施例中的鞘磷脂内标物的结构图。（a）氘化鞘氨醇位于第一位点，脂肪酸“r”位于sn-2位点，（b）典例脂肪酸棕榈酸盐(16：0)位于sn-2位点，（c）可以酰化至sn-2位点的4种典例脂肪酸。

图7a-7c为本发明的一个或多个实施例中的三酰基甘油内标物的结构图。（a）氘标记棕榈酸盐(16：0)位于sn-1位点，油酸酯(18：ln9)位于sn-2位点，（b）典例脂肪酸棕榈酸盐(16：0)位于sn-3位点，（c）可以酰化至sn-3位点的8种典例脂肪酸。

图8a-8c为本发明的一个或多个实施例中的二酰基甘油内标物的结构图。（a）氘标记棕榈酸盐(16：0)位于sn-1位点，脂肪酸“r”位于sn-2位点，（b）典例脂肪酸棕榈酸盐(16：0)位于sn-2位点，（c）可以酰化至sn-2位点的8种典例脂肪酸

图9a-9c为本发明的一个或多个实施例中的胆固醇酯内标物的结构图。（a）氘标记n6位点，脂肪酸“r”酰化至羟基，（b）典例脂肪酸亚油酸酯(18：2n6)酰化至羟基，（c）可以酰化至羟基的8种典例脂肪酸

图10a-10b为本发明的一个或多个实施例中的典例游离脂肪酸内标物的结构图。（a）氘标记棕榈酸盐，（b）内标混合物中的17：ln7。

图11为本发明的一个或多个实施例中未标记内标混合试样中的指示磷脂酰胆碱种类的实际浓度与使用传统内标（is）pcl7：0/17：0和典例is混合物计算浓度相比较图。浓度显示为组合物的摩尔%。

图12为本发明的一个或多个实施例中使用内标混合物的计算浓度和通过15份人体血清样品计算得到的精准度（%cv）示意图。

图13为本发明的一个或多个实施例中通过15份人体血清样品测量三次，使用内标混合物计算得到的胆固醇酯（ce）脂质类整个浓度的箱线图。

图14为本发明的一个或多个实施例中通过15份人体血清样品测量三次，使用内标混合物计算得到的三酰基甘油（tag）脂质类整个浓度的箱线图。

图15为本发明的一个或多个实施例中通过单个内标物和多个内标物计算得到(a)胆固醇酯（ce）的浓度示意图;(b)磷脂酰胆碱（pc）的浓度示意图;(c)磷脂酰乙醇胺（pe）脂质类的浓度示意图。

图16为本发明的一个或多个实施例中使用单个内标物和多个内标物计算出胆固醇酯（ce）脂质类中22种脂肪酸相对含量示意图。

图17a-17d为本发明的一个或多个实施例中使用单个内标物和多个内标物计算出磷脂酰胆碱（pc）或胆固醇酯（ce）脂质类中典例多不饱和脂肪酸的浓度示意图。(a)pc20：5；(b)pc22：6；(c)ce40：4以及(d)ce20：5。

详细说明

为了对本发明的原理进行更好的理解，作出优选实施例，并使用特定的语言来描述优选实施例。但本发明并不限于这些实施例，本发明所属技术领域的技术人员可以对本发明公开内容进行变更和进一步的修改。

使用内标物定量脂质时会遇到一些问题，原因在于即使在已经给出的脂质类中，脂质也具有不同的化学属性。脂质还具有组合复杂性，例如，许多脂肪酸中的若干个可以被酰化到十几骨架之一上。因而少量的内标物不能满足上述两个条件中第一个条件。需要的是合成一组内标物的方法（1）代表复杂脂质的化学多样性和（2）创建具有相对含量的标准物混合物，代表样品中预期脂质成分，使得这些混合物可以作为内标使用。本发明公开的主题是提供能够代表复杂脂质化学多样性内标物的组分和合成方法。

本文所描述的试剂和试剂盒由一组结构不同的脂质标准物组成，这些脂质标准物对于每一种脂质类具有适当的化学性质和/或分析性质。关于本文使用的脂肪酸“脂质代谢产物”（或者在本文的其它地方提及的“脂质分子”）的命名法，标有前缀“ce”、“dg”、“fa”、“pc”、“pe”、“lpc”、“lpe”、“o-pc”、“p-pe”、“sm”、“tg”或“cer”的脂肪酸代表着指示脂肪酸，这些前缀分别代表胆固醇酯、甘油二酯(双甘酯)、游离脂肪酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、1-醚连接的磷脂酰胆碱、1-乙烯醚连接的磷脂酰乙醇胺(缩醛磷脂)、鞘磷脂、三酰基甘油（甘油三酯)和神经酰胺。在一些实施例中，这些指示脂肪酸成分定量为占前缀脂质类中整个脂肪酸的比例。没有特定脂质类前缀或者其它标记的脂肪酸通常表明这些脂肪酸存在于样品的整个脂质中。前缀“ce”、“dg”、“fa”、“pc”、“pe”、“lpc”、“lpe”、“o-pc”、“p-pe”、“sm”、“tg”或“cer”之后的“lc”是指被前缀整个脂质类的含量（例如，这类脂质的浓度表示为纳摩尔每克血清或血浆）。例如，在一些对血浆或血清进行测量的实施例中，缩写“pc18：2n6”表示由亚油酸酯(18：2n6)组成的血浆或血清磷脂酰胆碱百分数，“tglc”表示血浆或血清中甘油三酯绝对量（如纳摩尔每克）。“mufa”、“pupa”和“sfa”分别代表单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸。

在本文中使用的“脂质主链”指的是脂质分子除去脂肪酸基团或酰基的那部分。在此使用的术语“脂肪酸基团”和“酰基”二者可交换使用。在此使用的“脂质分子种类”或“分子种类”指的是由特定脂肪酸或酰基连接于特定脂质主链组成的脂质分子（如pc18：2n6、ce16：ln6等）。

在此使用的“同位素标记的”指的是内标或内标任何部分使用任何合适的一部分（例如，氘（2h、¹³c、¹⁵n））标记用于测量。任何内标原子或任意数量的内标原子可以用同位素进行标记。例如，同位素可以是氘，内标可以含有9个氘原子。在另一个实例中，同位素可以是氘，内标可以包含11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31个氘原子。

本文所述方法的一种使用是校准或协助校准质谱或多级串联质谱（即“平台”）。在一个实例中，需要两种类型的校准物，一种校准脂质类浓度，一种校准脂质类中的脂肪酸组分。该平台校准的结果可能通过使用对照样品或对获得的定量数据进行比较来计算校准。

本文所述的合成内标混合物的方法可用于任何脂质或者脂质类。术语“脂质类”表示一类脂质，例如甘油三酯、甘油二酯、胆固醇酯、游离脂肪酸、磷脂酰胆碱、o-磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、p-磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、双磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、血磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、溶血磷脂酰甘油、磷脂酸、溶血磷脂酸、cdp-甘油二酯、溶血cdp-甘油二酯、神经酰胺、乳糖基神经酰胺、葡糖基神经酰胺、植物神经酰胺、6-羟基神经酰胺、脑苷脂、神经节苷脂、蜡酯、蜡二酯、1-单酰甘油。甘油三酯、甘油二酯、胆固醇酯、游离脂肪酸为中性脂质。磷脂酰胆碱、o-磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、p-磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、双磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、血磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、溶血磷脂酰甘油、磷脂酸、溶血磷脂酸、cdp-甘油二酯、溶血cdp-甘油二酯为磷脂。

内标混合物可以包括磷脂，每个磷脂头部基团（如pc、pe、se）包含：a)一个同位素标记的脂肪酸，该同位素标记的脂肪酸位于sn-1或sn-2位点；和b)脂肪酸的酰化混合物，该脂肪酸酰化混合物位于不同的位点（即这个位点没有被同位素标记的脂肪酸所占），且该脂肪酸酰化混合物近似为目标复杂脂质中的脂肪酸浓度。

在一个实例中，同位素标记的脂肪酸是饱和脂肪酸，脂肪酸酰化混合物是不饱和脂肪酸的和多不饱和脂肪酸的预先混合物。在一个实例中，同位素标记的饱和脂肪酸是位于sn-1位点的棕榈酸盐（16：0），不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸的酰化混合物是预先混合物，位于sn-2位点。在一个实例中，酰化混合物由不饱和脂肪酸组成。在一个实例中，磷脂是溶血磷脂酰胆碱，磷脂头部基团含有位于sn-1位点的同位素标记的棕榈酸盐（16：0）。在另一实例中，磷脂是溶血磷脂酰乙醇胺，并且磷脂头部基团含有同位素标记的硬脂酸酯（18：0）位于sn-1位点。制备脂肪酸混合物的方法如下：1)测定给定样品类型中的脂肪酸浓度，此浓度事先已知或者通过脂肪酸组分分析测定；2）选定一个或多个具有代表性不饱和度（如单烯、二烯、三烯、四烯、五烯、己烯等）的脂肪酸，其中脂质类中含量丰富的脂肪酸被选定；3）根据上述给定样品类型中的脂肪酸浓度，分配混合物中各个脂肪酸高含量或低含量；4）根据高含量和低含量分配混合物中相应脂肪酸的百分比值（如具有高含量的脂肪酸占混合物的20%，具有低含量的脂肪酸占混合物的5%）；5）确定不饱和脂肪酸中含量最高的脂肪酸，如上述分配高含量或低含量，作为混合物中其余的百分数成分，从而形成整个混合物。

内标混合物可以包括磷脂，每个磷脂头部基团（如pc、pe、sm）包含：a)没有标记的脂肪酸，该无标记的脂肪酸位于sn-1或sn-2位点；和b)mufa或pupa，该mufa或pupa位于无标记脂肪酸没有占有的位点。在一个实例中，头部基团包括a)没有标记的奇数链饱和脂肪酸，该没有标记的奇数链饱和脂肪酸位于sn-1位点；b)奇数链mufa或pupa，该奇数链mufa或pupa位于sn-2位点。

内标混合物可以包括中性脂质，其中中性脂质包含同位素标记的mufa或奇数链mufa（如17：1，19：1等）。

在一些实施例中，定量脂肪酸分析测定内标混合物的具体成分。在磷脂的一个实例中，每个磷脂头部基团的sn-1位点被单个氘化的饱和脂肪酸（如dl6：0）完全标记，因此剩余的脂肪酸位于sn-2位点。公式如下：1=a/x+b/x+c/x等，其中x是在混合物中的单个氘化的饱和脂肪酸的百分比；其中a、b、c等是该混合物中的脂肪酸；脂肪酸a、b、c等在内标混合物的百分比相对于x是已知的。并且其中脂肪酸a在内部标准混合物中的百分比。进一步，a/x=由a组成的混合物含量。例如，pc内标混合物的组成通过fame分析测定为：dl6：0-50%，18：ln9-10%，18：2n6-20%，和20：4n6-20%，然后1=(0.1/0.5)+(0.2/0.5)+(0.2/0.5)以及0.1/0.5=0.2；0.2/0.5=0.4；以及0.2/0.5=0.4，混合物包括20%的pcdl16：0/18：ln9，40%的pdl6：0/18：2n6以及40%的pcdl6：0/20：4n6。

游离脂肪酸是中性脂质的一种类型，可组成内标混合物。游离脂肪酸可以为任意游离脂肪酸，包括，例如单奇数链脂肪酸（如17：1、17：2、17：0等）和/或同位素标记的脂肪酸（如16：0、16：1、17：0等）。游离脂肪酸也可以为mufa或者脂肪酸可以为pupa。

胆固醇酯是中性脂质的一种类型，可组成内标混合物。胆固醇酯可以为任何胆固醇酯，包括，例如标记的胆固醇分子酯化到脂肪酸混合物形成的胆固醇酯，代表在样品中胆固醇酯的预期成分（见表1）。

二酰基甘油是中性脂质的一种类型，可组成内标混合物。二酰基甘油可以为任何二酰基甘油，包括，例如单奇数链脂肪酸或同位素标记的脂肪酸。二酰基甘油的脂肪酸链包括：a)同位素标记的脂肪酸，其中同位素标记的脂肪酸位于sn-1或sn-2位点（第一位点）；b)脂肪酸的酰化混合物，其中脂肪酸酰化混合物位于不同的位点（即这个位点没有被同位素标记的脂肪酸所占）。在一个实例中，同位素标记的脂肪酸为饱和脂肪酸。在一个实例中，同位素标记的脂肪酸为棕榈酸盐（16：0）位于第一位点，脂肪酸酰化混合物位于不同的位点，该脂肪酸酰化混合物包括16：0、18：0、18：ln9、18：2n6、18：3n3、20：4n6、20：5n3和22：6n3。在一个实例中，同位素标记的脂肪酸是棕榈酸盐（16：0）位于第一位点，位于不同位点的脂肪酸酰化混合物为不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸的混合物。在另一个实例中，内标混合物中的二酰基甘油的脂肪酸链包括：a)未标记的奇数链饱和脂肪酸，其中未标记的奇数链饱和脂肪酸位于第一位点；b)奇数链mufa或pufa，其中奇数链mufa或pufa位于不同位点。内标混合物中二酰基甘油可以为多个同质内标物（例如dg17：0/17：0和dg17：1/17：1等）。

三酰基甘油是中性脂质的一种类型，可以组成内标混合物。三酰基甘油可以为任何三酰基甘油，包括，例如奇数链脂肪酸和/或同位素标记的脂肪酸按照混合标准形成的混合物。三酰基甘油的脂肪酸链包括：a)标记的脂肪酸位于一个位点；b)未标记的脂肪酸位于不同的位点；c)脂肪酸的酰化混合物位于另外一个不同的位点。在一个实例中，标记的脂肪酸为饱和脂肪酸，未标记的脂肪酸为不饱和脂肪酸。在一个实例中，标记为氘标。在一个实例中，内部混合物中的三酰基甘油的脂肪酸链包括：a)同位素标记的棕榈酸盐（16：0）位于一个位点（如位于sn-1位点）；b)油酸酯（18：ln9）位于不同或第二个位点（如位于sn-2位点）；c)脂肪酸的酰化混合物位于另外一个不同或第三个位点（如位于sn-3位点）。位于第三个位点（如sn-3）的脂肪酸酰化混合物包括，例如16：0、18：0、18：ln9、18：2n6、18：3n3、20：3n6、20：4n6和22：6n3。

内标混合物可包括：a）磷脂酰胆碱脂质类，其中同位素标记的棕榈酸盐（16：0）位于sn-1位点，mufa和pufa混合物位于sn-2位点；b)磷脂酰乙醇胺脂质类，其中同位素标记的棕榈酸盐（16：0）或硬脂酸（18：0）位于sn-1位点，mufa和pufa混合物位于sn-2位点；c)溶血磷脂酰胆碱脂质类，其中同位素标记的棕榈酸盐（16：0）位于sn-1位点；d)溶血磷脂酰乙醇胺脂质类，其中同位素标记的棕榈酸盐（16：0）或硬脂酸（18：0）位于sn-1位点；e)鞘磷脂脂质类，其中同位素标记的鞘氨醇类骨架和脂肪酸混合物位于sn-2位点；f)甘油三酯脂质类，其中同位素标记的棕榈酸盐位于sn-1位点，未标记的油酸酯（或其它脂肪酸）位于sn-2位点，脂肪酸的混合物位于sn-3位点；g)胆固醇酯脂质类，由同位素标记的胆固醇头基团与脂肪酸混合物酰化获得；h)二酰基甘油脂质类，其中同位素标记的棕榈酸盐（16：0）位于sn-1位点，脂肪酸混合物位于sn-2位点；i)游离脂肪酸脂质类，包括有同位素标记的脂肪酸或同位素标记的15：1或同位素标记的17：1；和/或j）神经酰胺脂质类，同位素标记的神经鞘脂类骨架和脂肪酸混合物适量混合形成神经酰胺类。

在一个实例中，神经酰胺脂质类包括以下神经鞘脂类骨架：鞘氨醇、二氢神经鞘氨醇、植物鞘氨醇或6一羟基鞘氨醇。

本文中描述的试剂可被组合形成制品，例如，试剂盒。

复杂脂质根据不同种类分类：每个种类由脂质头部基团定义（如pc含有磷酸胆碱头部基团，ce含有胆固醇头部基团）。脂质类中，有许多分子种类由连接至头部基团的脂肪酸定义。因为脂肪酸具有化学结构多样性，每个脂质类含有大量的不同成分从而导致差异化的脂质分子种类。为了定量脂质类，必须定量每种分子种类，并准确求和。

与传统的对于范围较宽的脂质（例如磷脂）通常使用一种内标物的脂类组学战略不同，本文提供包括脂肪酸混合物（每种脂质类最多有10个脂肪酸）的内标物的合成方法。本方法中，内标混合物（is混合物）中的脂肪酸选择可以代表分析样品中脂质类的化学结构（脂质分子种类）多样性。表1为根据本发明方法测量的对应于每种脂质类各脂肪酸的浓度值，每种脂质类剩余的脂肪酸归属于最接近的内标物类似物，并赋予测量值；每种脂质类的总浓度通过该脂质类中所有分子种类值（测量和赋值的）相加而得。

在一个实施例中，表1为对应10种脂质类内标物其相应的脂肪酸组成。内标物的脂质类如表1第一行所示，脂肪酸“r”列于表1第一列。表1中，“d”代表加入有氘标记。例如，16：0-d9表示含有9个氘原子的棕榈酸盐。

表1.合成的脂质内标物中脂肪酸混合物组分

在一个实施例中，提供了磷脂酰胆碱和o-磷脂酰胆碱的典型的内标物组分，这些内标物的sn-2位点脂肪酸（sn-2脂肪酸）的组成如表2所示。磷脂酰胆碱和sn-2脂肪酸组成的混合物结构如图2所示。含有位于sn-1位点的氘标记棕榈酸盐（16：0）以及位于sn-2位点的以“r”脂肪酸来指示的磷脂酰胆碱结构如图2a所示。含有位于sn-1位点的氘标记棕榈酸盐（16：0）以及位于sn-2位点的作为典例脂肪酸的油酸酯（18：ln9）的磷脂酰胆碱结构如图2b所示。脂肪酸混合物中酰化至磷脂酰胆碱sn-2位点的十种脂肪酸（16：ln7、18：ln9、18：2n6、18：3n3、20：3n6、20：4n6、20：5n3、22：4n6、22：5n3和22：6n3）结构如图2c所示。

表2.磷脂酰胆碱和o-磷脂酰胆碱内标物的sn-2位点脂肪酸组成

在一个实施例中，作为溶血磷脂酰胆碱内标物的典型内标物及其结构如图3所示。

对于磷脂酰乙醇胺和p-磷脂酰乙醇胺内标物，其sn-2位点脂肪酸的组分如表3所示。磷脂酰乙醇胺和sn-2位点脂肪酸组成的混合物结构如图4所示。含有位于sn-1位点的氘标记硬脂酸（18：0）以及位于sn-2位点的以“r”脂肪酸来指示的磷脂酰乙醇胺结构如图4a所示。含有位于sn-1位点的氘标记硬脂酸（18：0）以及位于sn-2位点作为典例脂肪酸的油酸酯（18：ln9）的磷脂酰乙醇胺结构如图4b所示。脂肪酸混合物中酰化至磷脂酰乙醇胺sn-2位点的八种脂肪酸（18：ln9、18：2n6、18：3n3、20：3n6、20：4n6、20：5n3、22：5n3和22：6n3）结构如图4c所示。

表3磷脂酰乙醇胺和p-磷脂酰乙醇胺内标物的sn-2位点脂肪酸组成

在一个实施例中，作为溶血磷脂酰乙醇胺的典例内标物的结构如图5所示。

在一个实施例中，提供作为鞘磷脂的典例内标物，其脂肪酸组分如表4所示。鞘磷脂和sn-2位点脂肪酸组成的混合物结构如图6所示。含有位于第一位点的氘标记鞘氨醇以及位于sn-2位点的的“r”脂肪酸的鞘磷脂结构如图6a所示。含有位于第一位点的氘标记鞘氨醇以及位于sn-2位点作为典例脂肪酸的棕榈酸盐（16：0）的鞘磷脂结构如图6b所示。脂肪酸混合物中连接在鞘磷脂sn-2位点的四种脂肪酸（16：0、18：ln9、24：0和24：ln9）结构如图6c所示。

表4鞘磷脂内标物的脂肪酸组分

在一个实施方案中，提供三酰基甘油的典例内标物，其sn-3位点脂肪酸的组分如表5所示。三酰基甘油和sn-3位点脂肪酸组成的混合物结构如图7所示。含有位于sn-1位点的氘标记棕榈酸盐（16：0）、位于sn-2位点的油酸酯（18：ln9）以及位于sn-3位点的“r”脂肪酸指示的三酰基甘油结构如图7a所示。含有位于sn-1位点的氘标记棕榈酸盐（16：0）、位于sn-2位点的油酸酯（18：ln9）以及位于sn-3位点作为典例脂肪酸的棕榈酸盐（16：0）的三酰基甘油结构如图7b所示。脂肪酸混合物中连接在三酰基甘油sn-3位点的八种脂肪酸（16：0、18：0、18：ln9、18：2n6、18：3n3、20：3n6、20：4n6和22：6n3）结构如图7c所示。

表5三酰基甘油内标物sn-3位点脂肪酸组成

在一个实施方案中，提供二酰基甘油的典例内标物。其sn-2位点脂肪酸的组分如表6所示。二酰基甘油和sn-2位点脂肪酸组成的混合物结构如图8所示。含有位于sn-1位点的氘标记棕榈酸盐（16：0）以及位于sn-2位点的以“r”脂肪酸指示的二酰基甘油结构如图8a所示。含有位于sn-1位点的氘标记棕榈酸盐（16：0）以及位于sn-2位点作为典例脂肪酸的棕榈酸盐（16：0）的二酰基甘油结构如图8b所示。脂肪酸混合物中连接在二酰基甘油sn-2位点的八种脂肪酸（16：0、18：0、18：ln9、18：2n6、18：3n3、20：4n6、20：5n3和22：6n3）结构如图8c所示。

表6二酰基甘油内标物sn-2位点脂肪酸组成

在一个实施方案中，提供胆固醇酯的典例内标物，其脂肪酸组分如表7所示。胆固醇酯和脂肪酸组成的混合物结构如图9所示。含有位于n6位点的氘标记物以及酰化至羟基的“r”脂肪酸的胆固醇酯结构如图9a所示。含有位于n6位点的氘标记物的胆固醇酯和酰化至羟基的作为典例脂肪酸的亚油酸酯（18：2n6）的结构如图9b所示。用来酰化至胆固醇酯羟基的脂肪酸混合物中的八种脂肪酸（16：0、16：ln7、18：ln9、18：2n6、20：3n6、20：4n6、20：5n3和22：6n3）结构如图9c所示。

表7胆固醇酯内标物的脂肪酸组成

在一个实施方案中，提供游离脂肪酸的典例内标物，其脂肪酸组分如表8所示。游离脂肪酸组成的混合物结构如图10所示。含有氘标记的游离脂肪酸棕榈酸盐（16：0）结构如图10a所示。游离脂肪酸17：ln7的结构如图10b所示。

表8游离脂肪酸内标物组分

制备脂质内标物的方法

在本发明的一个实施例中，合成脂质分子的一种或多种混合物作为内标物，该脂质分子代表存在于感兴趣样品内一种或多种对应的脂质类的脂质分子种类组分，本制备方法包括一个或多个：通过与具有至少一个酰基的脂质类发生酰化反应，连接至少含有两种同位素标记脂肪酸的混合物于脂质主链，该同位素标记脂肪酸位于单个位点；通过与具有至少一个酰基的脂质类发生酰胺化反应，连接至少含有两种脂肪酸的混合物于同位素标记的脂质主链，该脂肪酸位于单个位点；或者通过与具有至少含有两种脂肪酸的脂质类发生酰胺化反应，连接一个同位素标记脂肪酸于脂质主链，该同位素标记脂肪酸位于第一位点，然后通过酰胺化反应，连接至少含有两种脂肪酸的混合物于脂质主链的不同位点，其中至少含有两种脂肪酸的混合物代表存在于感兴趣样品内对应脂质类的脂肪酸，其中混合物中的每种脂肪酸以代表存在于感兴趣样品中的相应脂质类别中的脂质分子种类中脂肪酸的存在比例的比例存在。相应的脂质类包括三酰基甘油、二酰基甘油、1-单酰甘油、磷脂、磷脂酰胆碱、o-磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、p-磷脂酰乙醇胺、胆固醇酯、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰丝氨、溶血酸磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰甘油、溶血磷脂酸、溶血cdp-二酰基甘油、cdp-二酰基甘油、鞘磷脂、心磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、神经酰胺、乳糖基神经酰胺、葡糖基神经酰胺、植物神经酰胺、6-羟基神经酰胺、脑苷脂、神经节苷脂、蜡酯、蜡二酯中的一种或多种。位于脂质分子的一种或多种混合物中的每一种脂肪酸的一种或多种混合物可以包括表1、表2、表3、表4、表5、表6或表7中所列的脂质分子种类的一种或多种混合物。位于一种或多种脂质分子中的一种或多种脂肪酸可以由表1、表2、表3、表4、表5、表6或表7中所列的脂质分子种类的一种或多种混合物组成。

在本发明的一个实施例中，公开一种合成一种或多种脂质分子混合物作为内标物，代表存在于感兴趣样品内一种或多种对应的脂质类的脂质分子种类组分，本制备方法包括：通过与具有至少两个酰基的脂质类发生酰胺化反应，连接一个同位素标记脂肪酸于脂质主链第一位点；然后通过酰胺化反应，连接至少含有两种脂肪酸的混合物于脂质主链的不同位点，其中脂肪酸的混合物代表存在于感兴趣样品内对应的脂质类的脂肪酸，其中混合物中的每种脂肪酸以代表存在于感兴趣样品中的相应脂质类别中的脂质分子种类中脂肪酸的存在比例的比例存在。本方法中，一种或多种含有至少两个酰基的脂质类包括三酰基甘油、二酰基甘油、磷脂、磷脂酰胆碱、o-磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、p-磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、心磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、cdp-二酰基甘油、神经酰胺、乳糖基神经酰胺、葡糖基神经酰胺、植物神经酰胺、6-羟基神经酰胺、脑苷脂、神经节苷脂或蜡二酯。位于脂质分子的一种或多种混合物中的每一种脂肪酸的一种或多种混合物可以包括表1、表2、表3、表4、表5或表6中所列的脂质分子种类的一种或多种混合物。位于一种或多种脂质分子中的一种或多种脂肪酸可以由表1、表2、表3、表4、表5或表6中所列的脂质分子种类的一种或多种混合物组成。

在本发明的一个实施例中，合成一种或多种脂质分子混合物作为内标物，代表存在于感兴趣样品内一种或多种对应的脂质类的脂质分子种类组分，本制备方法：通过与具有至少一个酰基的脂质类发生酰胺化反应，连接至少含有两种脂肪酸的混合物于同位素标记的脂质主链，脂肪酸位于单个位点，其中脂肪酸的混合物代表存在于感兴趣样品内对应的脂质类的脂肪酸，其中混合物中的每种脂肪酸以代表存在于感兴趣样品中的相应脂质类别中的脂质分子种类中脂肪酸的存在比例的比例存在。本方法中，一种或多种含有至少一个酰基的脂质类包括三酰基甘油、二酰基甘油、1-单酰甘油、磷脂、磷脂酰胆碱、o-磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、p-磷脂酰乙醇胺、胆固醇酯、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰丝氨、溶血酸磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰甘油、溶血磷脂酸、溶血cdp-二酰基甘油、cdp-二酰基甘油、鞘磷脂、心磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、神经酰胺、乳糖基神经酰胺、葡糖基神经酰胺、植物神经酰胺、6-羟基神经酰胺、脑苷脂、神经节苷脂、蜡酯、蜡二酯。位于脂质分子的一种或多种混合物中的每一种脂肪酸的一种或多种混合物可以包括表1、表2、表3、表4、表5、表6或表7中所列的脂质分子种类的一种或多种混合物。位于一种或多种脂质分子中的一种或多种脂肪酸可以由表1、表2、表3、表4、表5、表6或表7中所列的脂质分子种类的一种或多种混合物组成。

上述方法中，感兴趣的样品可以为复杂混合物包括脂质分子、生物样品如植物样品或动物样品。动物样品可来自哺乳动物，如人、老鼠、非人类灵长类动物、兔子或者其它哺乳动物，或者非哺乳动物，如斑马鱼样品等。感兴趣的生物样品包括血液、血浆、血清、分离脂蛋白、唾液、尿液、淋巴液以及脑脊液，组织样品，细胞样品或皮肤样品。

上述方法中，该方法可以进一步包括脂肪酸定量分析，对混合物中每个脂肪酸进行定量测定。

上述方法中，脂肪酸可以为饱和脂肪酸。

上述方法中，同位素标记物可以为任何同位素标记物，包括²h、¹³c或¹⁵n。

在所述方法的一个实施例中，脂质主链的第一位点可以为sn-1位点。脂质主链的第一位点可以为sn-1位点，脂质主链的不同位点可以为sn-2位点或sn-3位点。在一个替代实施方案中，脂质主链的第一位点可以为sn-2位点。脂质主链的第一位点可以为sn-2位点，脂质主链的不同位点可以为sn-1位点或sn-3位点。在另一个实施例中，脂质主链的第一位点可以为sn-3位点。脂质主链的第一位点可以为sn-3位点，脂质主链的不同位点可以为sn-1位点或sn-2位点。

上述方法中，一种或多种具有至少两个酰基的脂质类可以由磷脂酰胆碱或o-磷脂酰胆碱组成，其中第一位点可以为sn-1位点，不同位点可以为sn-2位点，或者其中第一位点可以为sn-2位点，不同位点可以为sn-1位点，其中氘标记的十六烷酰基-d9(16：0-d9)可以位于第一位点，其中位于不同位点的脂肪酸混合物包括9z-十六碳烯酰基(16：ln7)、9z-十八碳烯酰基(18：ln9)、9z，12z-十八碳二烯酰基(18：2n6)、9z，12z，15z-十八碳三烯酰基(l8：3n3)、8z，11z，14z-二十碳三烯酰基(20：3n6)、5z，8z，11z，14z-二十碳四烯酰基(20：4n6)、5z，8z，11z，14z，17z-二十碳五烯酰基(20：5n3)、7z，10z，13z，16z-二十二碳四烯酰基(22：4n6)、7z，10z，13z，16z，19z-二十二碳五烯酰基(22：5n3)、4z，7z，10z，13z，16z，19z二十二碳六烯酰基(22：6n3)。位于sn-2位点的脂肪酸混合物各比例如表2所示。

上述方法中，一种或多种具有至少两个酰基的脂质类可以由磷脂酰乙醇胺和p-磷脂酰乙醇胺组成，其中第一位点为sn-1位点，不同位点可以为sn-2位点，或其中第一位点可以为sn-2位点，不同位点可以为sn-1位点，其中氘标记的十八烷酰基-d9(18：0-d9)可以位于第一位点，其中位于不同位点的脂肪酸混合物包括9z-十八碳烯酰基(18：ln9)、9z，12z-十八碳二烯酰基(18：2n6)、9z，12z，15z-十八碳三烯酰基(18：3n3)、8z，11z，14z二十碳三烯酰基(20：3n6)、5z，8z，11z，14z-二十碳四烯酰基(20：4n6)、5z，8z，11z，14z，17z二十碳五烯酰基(20：5n3)、7z，10z，13z，16z，19z-二十二碳五烯基酰(22：5n3)和4z，7z，10z，13z，16z，19z二十二碳六烯酰基(22：6n3)。位于不同位点的脂肪酸混合物各比例如表3所示。

上述方法中，一种或多种具有至少两个酰基的脂质类可以由鞘磷脂组成，其中氘标记的鞘氨醇位于第一位点，其中脂肪酸混合物位于不同位点包括十六烷酰基(16：0)、9z-十八碳烯酰基(18：ln9)、二十四烷酰基(24：0)、15z-二十四碳烯酰基(24：ln9)。位于不同位点的脂肪酸混合物各比例如表4所示。

上述方法中，一种或多种具有至少两个酰基的脂质类可以由三酰基甘油组成，其中第一位点可以为sn-1位点，不同位点可以为sn-2位点或sn-3位点，或其中第一位点可以为sn-2位点，不同位点可以为sn-1位点或sn-3位点，或其中第一位点可以为sn-3位点，不同位点可以为sn-1位点或sn-2位点，其中氘标记的棕榈酸盐(16：0-d9)可以位于第一位点，油酸酯（18：ln9）位于其中一个不同位点，位于另外一个不同位点的脂肪酸混合物包括十六烷酰基(16：0)、十八烷酰基(18：0)、9z-十八碳烯酰基(18：ln9)、9z，12z-十八碳二烯酰基(18：2n6)、9z，12z，15z-十八碳三烯酰基(18：3n3)、5z，8z，11z，14z-二十碳四烯酰基(20：4n6)和4z，7z，10z，13z，16z，19z二十二碳六烯酰基(22：6n3)。位于不同位点的脂肪酸混合物各比例如表6所示。

上述方法中，一种或多种具有至少两个酰基的脂质类可以由甘油二酯组成，其中第一位点可以为sn-1位点，不同位点可以为sn-2位点，或其中第一位点可以为sn-2位点，不同位点可以为sn-1位点，其中氘标记的棕榈酸盐(16：0-d9)可以位于第一位点，其中位于不同位点的脂肪酸混合物包括十六烷酰基(16：0)、十八烷酰基(18：0)、9z-十八碳烯酰基(18：ln9)、9z，12z-十八碳二烯酰基(18：2n6)、9z，12z，15z-十八碳三烯酰基(18：3n3)、8z，11z，14z-二十碳三烯酰基(20：3n6)、5z，8z，11z，14z-二十碳四烯酰基(20：4n6)、5z，8z，11z，14z，17z二十碳五烯酰基(20：5n3)和4z，7z，10z，13z，16z，19z二十二碳六烯酰基(22：6n3)。位于不同位点的脂肪酸混合物各比例如表5所示。

上述方法中，一种或多种具有至少一个酰基的脂质类可以由胆固醇酯组成，其中单个位点为羟基，其中连接于羟基的脂肪酸混合物包括十六烷酰基(16：0)、9z-十六碳烯酰基(16：ln7)、9z-十八烷酰基(18：ln9)、9z，12z-十八碳二烯酰基(18：2n6)、8z，11z，14z-二十碳三烯酰基(20：3n6)、5z，8z，11z，14z-二十碳四烯酰基(20：4n6)、5z，8z，11z，14z，17z二十碳五烯酰基(20：5n3)和4z，7z，10z，13z，16z，19z二十二碳六烯酰基(22：6n3)。位于羟基的脂肪酸混合物各比例如表7所示。

作为内标物使用的组合物

本发明的一个实施例中，提供一种组合物，该组合物作为内标物使用，包含一种或多种脂质分子混合物，代表存在于感兴趣样品内一种或多种相对应的脂质类中的脂质分子种类组成，每种脂质分子混合物包括一种或多种：脂质主链具有至少有两种同位素标记的脂肪酸混合物，该同位素标记的脂肪酸混合物位于脂质主链的单个位点，其中脂质主链用于至少具有一个酰基的脂类；一种同位素标记的脂质主链具有至少两种脂肪酸的混合物，该脂肪酸混合物位于脂质主链的单个位点，其中脂质主链用于至少具有一个酰基的脂类；或者脂质主链具有一种同位素标记的脂肪酸，该同位素标记的脂肪酸位于脂质主链的第一个位点，并且具有至少有两种不同脂肪酸的混合物，该脂肪酸位于脂质主链的不同位点，其中脂质主链用于至少具有两种脂肪酸的脂类，其中至少有两种不同脂肪酸的混合物代表感兴趣样品内相应脂类中的脂肪酸，其中混合物中的每种脂肪酸以代表存在于感兴趣样品中的相应脂质类别中的脂质分子种类中脂肪酸的存在比例的比例存在。脂质类包括三酰基甘油、二酰基甘油、1-单酰甘油、磷脂、磷脂酰胆碱、o-磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、p-磷脂酰乙醇胺、胆固醇酯、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰丝氨、溶血酸磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰甘油、溶血磷脂酸、溶血cdp-二酰基甘油、cdp-二酰基甘油、鞘磷脂、心磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、神经酰胺、乳糖基神经酰胺、葡糖基神经酰胺、植物神经酰胺、6-羟基神经酰胺、脑苷脂、神经节苷脂、蜡酯、蜡二酯中一种或多种。位于脂质分子的一种或多种混合物中的每一种脂肪酸的一种或多种混合物可以包括表1、表2、表3、表4、表5、表6或表7中所列的脂质分子种类的一种或多种混合物。位于一种或多种脂质分子中的一种或多种脂肪酸可以由表1、表2、表3、表4、表5、表6或表7中所列的脂质分子种类的一种或多种混合物组成。

本发明的一个实施例中，提供一种组合物，该组合物作为内标物使用，包含一种或多种脂质分子混合物，代表存在于感兴趣样品内一种或多种相对应的脂质类中的脂质分子种类组成，每种脂质分子混合物包括：脂质主链具有一种同位素标记的脂肪酸，该同位素标记的脂肪酸位于脂质主链的第一个位点，其中脂质主链用于至少具有两个酰基的脂类；至少有两种不同脂肪酸的混合物位于脂质主链的不同位点，其中脂肪酸混合物代表感兴趣样品内相应脂类中的脂肪酸，其中混合物中的每种脂肪酸以代表存在于感兴趣样品中的相应脂质类别中的脂质分子种类中脂肪酸的存在比例的比例存在。在这个组合物中，脂质类包括三酰基甘油、二酰基甘油、磷脂、磷脂酰胆碱、o-磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、p-磷脂酰乙醇胺、心磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、cdp-二酰基甘油、鞘磷脂、神经酰胺、乳糖基神经酰胺、葡糖基神经酰胺、植物神经酰胺、6-羟基神经酰胺、脑苷脂、神经节苷脂、蜡二酯中一种或多种。位于脂质分子的一种或多种混合物中的每一种脂肪酸的一种或多种混合物可以包括表1、表2、表3、表4、表5、或表6中所列的脂质分子种类的一种或多种混合物。位于一种或多种脂质分子中的一种或多种脂肪酸可以由表1、表2、表3、表4、表5、或表6中所列的脂质分子种类的一种或多种混合物组成。

本发明的一个实施例中，提供一种组合物，该组合物作为内标物使用，包含一种或多种脂质分子混合物，代表存在于感兴趣样品内一种或多种相对应的脂质类中的脂质分子种类组成，每种脂质分子混合物包括：脂质主链具有一个或多个同位素标记物，其中脂质主链用于至少具有一个酰基的脂类；至少有两种不同脂肪酸的混合物位于脂质主链的单个位点，其中脂肪酸混合物代表感兴趣样品内相应脂类中的脂肪酸，其中混合物中的每种脂肪酸以代表存在于感兴趣样品中的相应脂质类别中的脂质分子种类中脂肪酸的存在比例的比例存在。本组合物中，脂质类包括三酰基甘油、二酰基甘油、1-单酰甘油、磷脂、磷脂酰胆碱、o-磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、p-磷脂酰乙醇胺、胆固醇酯、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰丝氨、溶血酸磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰甘油、溶血磷脂酸、溶血cdp-二酰基甘油、cdp-二酰基甘油、鞘磷脂、心磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、神经酰胺、乳糖基神经酰胺、葡糖基神经酰胺、植物神经酰胺、6-羟基神经酰胺、脑苷脂、神经节苷脂、蜡酯、蜡二酯中一种或多种。位于脂质分子的一种或多种混合物中的每一种脂肪酸的一种或多种混合物可以包括表1、表2、表3、表4、表5、表6或表7中所列的脂质分子种类的一种或多种混合物。位于一种或多种脂质分子中的一种或多种脂肪酸可以由表1、表2、表3、表4、表5、表6或表7中所列的脂质分子种类的一种或多种混合物组成。

在上面所述的组合物中，感兴趣的样品可以为复杂混合物包括脂质分子、生物样品如植物样品或动物样品。动物样品可来自哺乳动物，如人、老鼠、非人类灵长类动物、兔子或者其它哺乳动物，或者非哺乳动物，如斑马鱼样品等。感兴趣的生物样品包括血液、血浆、血清、分离脂蛋白、唾液、尿液、淋巴液以及脑脊液，组织样品，细胞样品或皮肤样品。

在上面所述的组合物中，同位素标记物可以为任何同位素标记物，包括²h、¹³c或¹⁵n。

在上面所述的组合物中，脂肪酸可以为饱和脂肪酸。

在上面所述的组合物中，脂质主链的第一位点可以为sn-1位点。脂质主链的第一位点可以为sn-1位点，脂质主链的不同位点可以为sn-2位点或sn-3位点。在一个替代实施方案中，脂质主链的第一位点可以为sn-2位点。脂质主链的第一位点可以为sn-2位点，脂质主链的不同位点可以为sn-1位点或sn-3位点。在另一个实施例中，脂质主链的第一位点可以为sn-3位点。脂质主链的第一位点可以为sn-3位点，脂质主链的不同位点可以为sn-1位点或sn-2位点。

在上面所述的组合物中，一种脂质类可以由磷脂酰胆碱或o-磷脂酰胆碱组成，其中第一位点可以为sn-1位点，不同位点可以为sn-2位点，或者其中第一位点可以为sn-2位点，不同位点可以为sn-1位点，其中氘标记的十六烷酰基-d9(16：0-d9)可以位于第一位点，其中位于不同位点的脂肪酸混合物包括9z-十六碳烯酰基(16：ln7)、9z-十八碳烯酰基(18：ln9)、9z，12z-十八碳二烯酰基(18：2n6)、9z，12z，15z-十八碳三烯酰基(l8：3n3)、8z，11z，14z-二十碳三烯酰基(20：3n6)、5z，8z，11z，14z-二十碳四烯酰基(20：4n6)、5z，8z，11z，14z，17z-二十碳五烯酰基(20：5n3)、7z，10z，13z，16z-二十二碳四烯酰基(22：4n6)、7z，10z，13z，16z，19z-二十二碳五烯酰基(22：5n3)、4z，7z，10z，13z，16z，19z二十二碳六烯酰基(22：6n3)。位于不同位点的脂肪酸混合物各比例如表2所示。

在上面所述的组合物中，一种脂质类可以由磷脂酰乙醇胺和p-磷脂酰乙醇胺组成，其中第一位点为sn-1位点，不同位点可以为sn-2位点，或其中第一位点可以为sn-2位点，不同位点可以为sn-1位点，其中氘标记的十八烷酰基-d9(18：0-d9)可以位于第一位点，其中位于不同位点的脂肪酸混合物包括9z-十八碳烯酰基(18：ln9)、9z，12z-十八碳二烯酰基(18：2n6)、9z，12z，15z-十八碳三烯酰基(18：3n3)、8z，11z，14z二十碳三烯酰基(20：3n6)、5z，8z，11z，14z-二十碳四烯酰基(20：4n6)、5z，8z，11z，14z，17z二十碳五烯酰基(20：5n3)、7z，10z，13z，16z，19z-二十二碳五烯酰基(22：5n3)和4z，7z，10z，13z，16z，19z二十二碳六烯酰基(22：6n3)。位于不同位点的脂肪酸混合物各比例如表3所示。

在上面所述的组合物中，一种脂质类可以由鞘磷脂组成，其中氘标记的鞘氨醇位于第一位点，其中脂肪酸混合物位于不同位点包括十六烷酰基(16：0)、9z-十八碳烯酰基(18：ln9)、二十四烷酰基(24：0)、15z-二十四碳烯酰基(24：ln9)。位于不同位点的脂肪酸混合物各比例如表4所示。

在上面所述的组合物中，一种脂质类可以由甘油二酯组成，其中第一位点可以为sn-1位点，不同位点可以为sn-2位点，或其中第一位点可以为sn-2位点，不同位点可以为sn-1位点，其中氘标记的棕榈酸盐(16：0-d9)可以位于第一位点，其中位于不同位点的脂肪酸混合物包括十六烷酰基(16：0)、十八烷酰基(18：0)、9z-十八碳烯酰基(18：ln9)、9z，12z-十八碳二烯酰基(18：2n6)、9z，12z，15z-十八碳三烯酰基(18：3n3)、8z，11z，14z-二十碳三烯酰基(20：3n6)、5z，8z，11z，14z-二十碳四烯酰基(20：4n6)、5z，8z，11z，14z，17z二十碳五烯酰基(20：5n3)和4z，7z，10z，13z，16z，19z二十二碳六烯酰基(22：6n3)。位于不同位点的脂肪酸混合物各比例如表6所示。

在上面所述的组合物中，一种脂质类可以由三酰基甘油组成，其中第一位点可以为sn-1位点，不同位点可以为sn-2位点或sn-3位点，或其中第一位点可以为sn-2位点，不同位点可以为sn-1位点或sn-3位点，或其中第一位点可以为sn-3位点，不同位点可以为sn-1位点或sn-2位点，其中氘标记的棕榈酸盐(16：0-d9)可以位于第一位点，油酸酯(18：ln9)位于sn-2位点，位于不同位点的脂肪酸混合物包括十六烷酰基(16：0)、十八烷酰基(18：0)、9z-十八碳烯酰基(18：ln9)、9z，12z-十八碳二烯酰基(18：2n6)、9z，12z，15z-十八碳三烯酰基(18：3n3)、5z，8z，11z，14z-二十碳四烯酰基(20：4n6)和4z，7z，10z，13z，16z，19z二十二碳六烯酰基(22：6n3)。位于不同位点的脂肪酸混合物各比例如表5所示。

在上面所述的组合物中，脂质类中的一种可以由胆固醇酯组成，其中单个位点为羟基，其中连接于羟基的脂肪酸混合物包括十六烷酰基(16：0)、9z-十六碳烯酰基(16：ln7)、9z-十八碳烯酰基(18：ln9)、9z，12z-十八碳二烯酰基(18：2n6)、8z，11z，14z-二十碳三烯酰基(20：3n6)、5z，8z，11z，14z-二十碳四烯酰基(20：4n6)、5z，8z，11z，14z，17z二十碳五烯酰基(20：5n3)和4z，7z，10z，13z，16z，19z二十二碳六烯酰基(22：6n3)。位于羟基的脂肪酸混合物各比例如表7所示。

检测和定量感兴趣样品中脂质分子的方法

本发明的一个实施例中，提供一种检测和定量存在于感兴趣样品中脂质分子的方法，此方法包括：i)加入一定量的组合物于感兴趣样品中，组合物具有一种或多种脂质分子混合物，代表着存在于感兴趣样品内一种或多种对应的脂质类的脂质分子种类组分，组合物包括以下的一种或多种：a）脂质主链具有至少有两种不同同位素标记脂肪酸的混合物，同位素标记脂肪酸位于脂质主链的单个位点，其中脂质主链用于至少具有一个酰基的脂质类；b)一种同位素标记的脂质主链具有至少两种脂肪酸的混合物，该脂肪酸位于脂质主链的单个位点，其中脂质主链用于至少具有一个酰基的脂类；或者c)或者脂质主链具有一种同位素标记的脂肪酸，该同位素标记的脂肪酸位于脂质主链的第一个位点，并且具有至少有两种不同脂肪酸的混合物，该脂肪酸位于脂质主链的不同位点，其中脂质主链用于至少具有两种脂肪酸的脂类，其中至少有两种不同脂肪酸的混合物代表感兴趣样品内相应脂类中的脂肪酸，其中混合物中的每种脂肪酸以代表存在于感兴趣样品中的相应脂质类别中的脂质分子种类中脂肪酸的存在比例的比例存在；ii)使用含有一种或多种代表脂质分子混合物的组合物作为内标，来检测和定量感兴趣样品内一种或多种相应脂质类的每种脂质类中的脂质分子种类。

本发明的一个实施例中，提供一种检测和定量存在于感兴趣样品中脂质分子的方法，此方法包括：加入一定量的组合物于感兴趣样品中，组合物具有一种或多种脂质分子混合物代表着感兴趣样品内一种或多种相应的脂质类中的脂质分子种类组分，其中每种脂质分子混合物包括：i）脂质主链具有一个同位素标记的脂肪酸，同位素标记脂肪酸位于脂质主链的第一位点，其中脂质主链用于至少具有两个酰基的脂类；ii)至少含有两种不同脂肪酸的混合物，位于脂质主链的不同位点，其中脂肪酸混合物代表着感兴趣样品内相应脂类中的脂肪酸，其中混合物中每种脂肪酸代表着存在于感兴趣样品内相应的脂质类的脂质分子种类中的脂肪酸比例；使用含有一种或多种代表脂质分子混合物的组合物作为内标，来检测和定量感兴趣样品内一种或多种相应脂质类的每种脂质类中的脂质分子种类。

本发明的一个实施例中，提供一种检测和定量存在于感兴趣样品中脂质分子的方法，此方法包括：加入一定量的组合物于感兴趣样品中，组合物具有一种或多种脂质分子混合物代表着存在于感兴趣样品内一种或多种对应的脂质类的脂质分子种类组分，其中每种脂质分子混合物包括：i）脂质主链具有一个或多个同位素标记物，其中脂质主链用于至少具有一个酰基的脂类；ii)至少含有两种不同脂肪酸的混合物，位于脂质主链的单个位点，其中脂肪酸混合物代表着感兴趣样品内相应脂类中的脂肪酸，其中混合物中每种脂肪酸代表着存在于感兴趣样品内相应的脂质类的脂质分子种类中的脂肪酸比例；使用含有一种或多种代表脂质分子混合物的组合物作为内标，来检测和定量感兴趣样品内一种或多种相应脂质类的每种脂质类中的脂质分子种类。

检测和/或定量存在感兴趣样品中脂质分子种类的方法包括质谱（ms）、高效液相色谱（hplc）、等度hplc、梯度洗脱hplc、正相色谱、反相hplc、尺寸排阻色谱、离子交换色谱、毛细管电泳、微流体、色谱、气相色谱（gc）、薄层色谱(tlc)中的一种或几种结合。检测和/或定量存在于生物样品的脂质分子种类的方法包括质谱（ms）的使用。

在检测和/或定量存在于感兴趣样品内脂质分子种类的方法中，感兴趣样品可以为复杂混合物包括脂质分子、生物样品如植物样品或动物样品。动物样品可来自哺乳动物，如人、老鼠、非人类灵长类动物、兔子或者其它哺乳动物，或者非哺乳动物，如斑马鱼样品等。感兴趣的生物样品包括血液、血浆、血清、分离脂蛋白、唾液、尿液、淋巴液以及脑脊液，组织样品，细胞样品或皮肤样品。

在检测和/或定量存在于感兴趣样品内脂质分子种类的方法中，位于脂质分子的一种或多种混合物中的每一种脂肪酸的一种或多种混合物可以包括表1、表2、表3、表4、表5、表6或表7中所列的脂质分子种类的一种或多种混合物。位于一种或多种脂质分子中的一种或多种脂肪酸可以由表1、表2、表3、表4、表5、表6或表7中所列的脂质分子种类的一种或多种混合物组成。

试剂盒

一般来说，本发明的试剂盒包括一种或多种内标物以及使用内标物来检测和/或定量感兴趣样品中脂质的说明书。试剂盒可进一步包括一种或多种对照样品和样品收集容器。试剂盒内的内标物组分以一种或多种脂质类相互结合包装在一起或包装成单个的小瓶或容器。一个试剂盒可能包括标签和/或关于制备和使用指示的包装说明书、样本收集容器、一个运输容器、和/或一个运输的邮包。独立包装试剂盒的其它成分包括缓冲剂和其它试剂，用于检测和/或定量感兴趣样品中的脂质。

所述试剂盒包括一种或多种内标混合物。在一个实施例中，试剂盒包含一内标混合物，该内标混合物包括同位素标记的脂肪酸，其中感兴趣样品内每种脂质类至少含有一个同位素标记脂肪酸。在一个实施例中，试剂盒包含一系列内标混合物，该系列内标混合物包括表1中列出的脂质类和同位素标记的脂肪酸。在又一实施例中，系列内标物中同位素标记脂肪酸的比例如表1所示。

所述试剂盒进一步包括一具有体积的容器。该容器可以为能够容纳液体样品的任一容器（如一个杯子、瓶子、微量离心管、微量滴定板等）。该容器可选择地性地包含体积测量功能，用来测量得到样品或其它试剂的理想体积。该容器可以由任何材料（如塑料、铝合金、不锈钢等）制成。该容器的内容量跟收集的样品类型有关。该容器可包括一杯体和一杯盖。在一些实施例中，内标物材料粘附于杯盖。在一些实施例中，内标物材料涂覆于容器杯体的内表面。

在一些实施例中，会根据收集样品的类型格外配置该容器，并用于样品的收集。另一方面，样品收集容器单独位于试剂盒中，可以为杯子、瓶子、微量离心管。

所述试剂盒可以选择性地包含一运输容器。该运输容器可以为任何适用于样品运输的结构。该容器被配置为使得样品材料可以塞进容器中，容器可以是密封的。

所述试剂盒可任选地包括一种萃取溶液。

本发明的一个实施例中，提供的试剂盒包括：i)一种或多种脂质分子混合物作为内标物，其中一种或多种脂质分子混合物中的每种代表着感兴趣样品内一种或多种相应脂质类的脂质分子种类的组成，每种脂质分子混合物包括一种或多种：脂质主链具有至少有两种同位素标记的脂肪酸的混合物，该同位素标记的脂肪酸位于脂质主链的单个位点，其中脂质主链用于至少具有一个酰基的脂类；一种同位素标记的脂质主链具有至少两种脂肪酸的混合物，该脂肪酸位于脂质主链的单个位点，其中脂质主链用于至少具有一个酰基的脂类；或者脂质主链具有一种同位素标记的脂肪酸，该同位素标记的脂肪酸位于脂质主链的第一个位点，并且具有至少有两种不同脂肪酸的混合物，该脂肪酸位于脂质主链的不同位点，其中脂质主链用于至少具有两个酰基的脂类，其中至少有两种不同脂肪酸的混合物代表感兴趣样品内相应脂类中的脂肪酸，其中混合物中的每种脂肪酸以代表存在于感兴趣样品中的相应脂质类别中的脂质分子种类中脂肪酸的存在比例的比例存在；ii)一种或多种脂质分子混合物作为内标物来检测和定量感兴趣样品内脂质类的脂质分子种类的使用说明。该脂质类包括三酰基甘油、二酰基甘油、1-单酰甘油、磷脂、磷脂酰胆碱、o-磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、p-磷脂酰乙醇胺、胆固醇酯、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰丝氨、溶血酸磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰甘油、溶血磷脂酸、溶血cdp-二酰基甘油、cdp-二酰基甘油、鞘磷脂、心磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、神经酰胺、乳糖基神经酰胺、葡糖基神经酰胺、植物神经酰胺、6-羟基神经酰胺、脑苷脂、神经节苷脂、蜡酯、蜡二酯中一种或多种。

本发明的一个实施例中，提供的试剂盒包括：i)一种或多种脂质分子混合物作为内标物，其中一种或多种脂质分子混合物中的每种代表着感兴趣样品内一种或多种相应脂质类的脂质分子种类的组成，每种脂质分子混合物包括：脂肪骨架具有一同位素标记脂肪酸位于脂质主链的第一位点，和至少有两种不同脂肪酸的混合物位于脂质主链的不同位点，其中脂质主链用于至少具有两个酰基的脂类，或者一脂质主链具有一种或多种同位素标记物，和至少有两种不同脂肪酸的混合物位于脂质主链的单个位点，其中脂质主链用于至少具有一个酰基的脂类，其中脂肪酸混合物代表着感兴趣样品内相应脂类中的脂肪酸，其中混合物中的每种脂肪酸以代表存在于感兴趣样品中的相应脂质类别中的脂质分子种类中脂肪酸的存在比例的比例存在。具有至少两种酰基的脂质类包括三酰基甘油、二酰基甘油、磷脂、磷脂酰胆碱、o-磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、p-磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、心磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、cdp-二酰基甘油、神经酰胺、乳糖基神经酰胺、葡糖基神经酰胺、植物神经酰胺、6-羟基神经酰胺、脑苷脂、神经节苷脂、蜡二酯中一种或多种。

所述试剂盒包括两种或多种脂质分子混合物代表着感兴趣样品内两种或多种脂质分子混合物的脂质分子种类的组成。两种或多种脂质分子混合物可以包装成一个组份。两种或多种脂质分子混合物可以分别包装成单独组分。

所述试剂盒可以进一步包括用于检测和定量的试剂。

所述试剂盒可以进一步包括一对照样品，该对照样品具有已知浓度的脂质分子种类组分。

所述试剂盒可以进一步包括游离脂肪酸混合物作为内标物，代表着感兴趣样品内游离脂肪酸成分。用于试剂盒的游离脂肪酸可包括如表8所示的游离脂肪酸。

所述试剂盒中，感兴趣样品可以为复杂混合物包括脂质分子、生物样品如植物样品或动物样品。动物样品可来自哺乳动物，如人、老鼠、非人类灵长类动物、兔子或者其它哺乳动物，或者非哺乳动物，如斑马鱼样品等。感兴趣的生物样品包括血液、血浆、血清、分离脂蛋白、唾液、尿液、淋巴液以及脑脊液，组织样品，细胞样品或皮肤样品。

所述试剂盒中，脂肪酸可以为饱和脂肪酸。

所述试剂盒中，同位素标记物包括²h、¹³c或¹⁵n。

所述试剂盒中，位于一种或多种脂质分子混合物的每种脂质分子中的脂肪酸混合物可以包括如表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7或表8所示的脂质分子种类混合物的一种或多种。所述试剂盒中，位于一种或多种脂质分子混合物的每种脂质分子中的脂肪酸混合物可以由如表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7或表8所示的脂质分子种类混合物的一种或多种组成。

所述试剂盒中，脂质主链的第一位点可以为sn-1位点。脂质主链的第一位点可以为sn-1位点，脂质主链的不同位点可以为sn-2位点或sn-3位点。

所述试剂盒中，脂质类的一种由磷脂酰胆碱或o-磷脂酰胆碱组成，其中第一位点可以为sn-1位点，不同位点可以为sn-2位点，或者其中第一位点可以为sn-2位点，不同位点可以为sn-1位点，其中氘标记的十六烷酰基-d9(16：0-d9)可以位于第一位点，其中位于不同位点的脂肪酸混合物包括9z-十六碳烯酰基(16：ln7)、9z-十八碳烯酰基(18：ln9)、9z，12z-十八碳二烯酰基(18：2n6)、9z，12z，15z-十八碳三烯酰基(l8：3n3)、8z，11z，14z-二十碳三烯酰基(20：3n6)、5z，8z，11z，14z-二十碳四烯酰基(20：4n6)、5z，8z，11z，14z，17z-二十碳五烯酰基(20：5n3)、7z，10z，13z，16z-二十二碳四烯酰基(22：4n6)、7z，10z，13z，16z，19z-二十二碳五烯酰基(22：5n3)、4z，7z，10z，13z，16z，19z二十二碳六烯酰基(22：6n3)。位于不同位点的脂肪酸混合物各比例如表2所示。

所述试剂盒中，脂质类的一种由磷脂酰乙醇胺和磷脂酰乙醇胺组成，其中第一位点为sn-1位点，不同位点可以为sn-2位点，或其中第一位点可以为sn-2位点，不同位点可以为sn-1位点，其中氘标记的十八烷酰基-d9(18：0-d9)可以位于第一位点，其中位于不同位点的脂肪酸混合物包括9z-十八碳烯酰基(18：ln9)、9z，12z-十八碳二烯酰基(18：2n6)、9z，12z，15z-十八碳三烯基酰(18：3n3)、8z，11z，14z二十碳三烯酰基(20：3n6)、5z，8z，11z，14z-二十碳四烯酰基(20：4n6)、5z，8z，11z，14z，17z二十碳五烯酰基(20：5n3)、7z，10z，13z，16z，19z-二十二碳五烯酰基(22：5n3)和4z，7z，10z，13z，16z，19z二十二碳六烯酰基(22：6n3)。位于不同位点的脂肪酸混合物各比例如表3所示。

所述试剂盒中，脂质类的一种由鞘磷脂组成，其中氘标记的鞘氨醇位于第一位点，其中脂肪酸混合物位于不同位点包括十六烷酰基(16：0)、9z-十八碳烯酰基(18：ln9)、二十四烷酰基(24：0)、15z-二十四碳烯酰基(24：ln9)。位于不同位点的脂肪酸混合物各比例如表4所示。

所述试剂盒中，脂质类的一种由甘油二酯组成，其中第一位点可以为sn-1位点，不同位点可以为sn-2位点，或其中第一位点可以为sn-2位点，不同位点可以为sn-1位点，其中氘标记的棕榈酸盐(16：0-d9)可以位于第一位点，其中位于不同位点的脂肪酸混合物包括十六烷酰基(16：0)、十八烷酰基(18：0)、9z-十八碳烯酰基(18：ln9)、9z，12z-十八碳二烯酰基(18：2n6)、9z，12z，15z-十八碳三烯酰基(18：3n3)、8z，11z，14z-二十碳三烯酰基(20：3n6)、5z，8z，11z，14z-二十碳四烯酰基(20：4n6)、5z，8z，11z，14z，17z二十碳五烯酰基(20：5n3)和4z，7z，10z，13z，16z，19z二十二碳六烯酰基(22：6n3)。位于不同位点的脂肪酸混合物各比例如表6所示。

所述试剂盒中，脂质类的一种可以由三酰基甘油组成，其中第一位点可以为sn-1位点，不同位点可以为sn-2位点或sn-3位点，或其中第一位点可以为sn-2位点，不同位点可以为sn-1位点或sn-3位点，或其中第一位点可以为sn-3位点，不同位点可以为sn-1位点或sn-2位点，其中氘标记的棕榈酸盐(16：0-d9)可以位于第一位点，油酸酯（(18：ln9)）位于其中一个不同的位点，位于另外一个不同位点的脂肪酸混合物包括十六烷酰基(16：0)、十八烷酰基(18：0)、9z-十八碳烯酰基(18：ln9)、9z，12z-十八碳二烯酰基(18：2n6)、9z，12z，15z-十八碳三烯酰基(18：3n3)、5z，8z，11z，14z-二十碳四烯酰基(20：4n6)和4z，7z，10z，13z，16z，19z二十二碳六烯酰基(22：6n3)。位于不同位点的脂肪酸混合物各比例如表5所示。

所述试剂盒中，脂质类的一种可以包括胆固醇酯、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰丝氨、溶血酸磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰甘油、溶血磷脂酸、溶血cdp-二酰基甘油、蜡酯或1-单酰甘油。

所述试剂盒中，脂质类的一种可以由胆固醇酯组成，其中单个位点为羟基，其中连接于羟基的脂肪酸混合物包括十六烷酰基(16：0)、9z-十六碳烯酰基(16：ln7)、9z-十八碳烯酰基(18：ln9)、9z，12z-十八碳二烯酰基(18：2n6)、8z，11z，14z-二十碳三烯酰基(20：3n6)、5z，8z，11z，14z-二十碳四烯酰基(20：4n6)、5z，8z，11z，14z，17z二十碳五烯酰基(20：5n3)和4z，7z，10z，13z，16z，19z二十二碳六烯酰基(22：6n3)。位于羟基的脂肪酸混合物各比例如表7所示。

测量脂质分子的方法

脂质代谢物或脂质分子含量测定适用于任何样品类型，如体液样品（例如，血液，血浆，尿液，脑脊髓液（csp）、组织样品、细胞样品、皮肤样品、溶液、复杂混合物、体外培养细胞和细胞培养介质。在一些实施例中，脂质分子含量的测定样品选自包含脂质、血液、血浆、血清、分离脂蛋白、唾液、尿液、淋巴液以及脑脊液等复杂混合物。在一些实施例中，脂质分子含量的测定样品选自全血、血浆、血清或分离脂蛋白。在一些实施例中，样品是血浆或血清。

在一些实施方案中，多个不同的脂质分子在同一样品中进行测量。在其他实施方案中，多个不同的脂质分子的每种于不同样品中进行测量。如果使用到多种样品，这些样品可以来自受试者相同或不同体液。

脂质分子和其它生物标志物可以容易地通过本领域技术人员已知的方法进行分离和/或定量，这些方法包括但不限于：质谱（ms）、高效液相色谱（hplc）、等度hplc、梯度洗脱hplc、正相色谱、反相hplc、尺寸排阻色谱、离子交换色谱、毛细管电泳、微流体、色谱、气相色谱（gc）、薄层色谱（(tlc)）、固定金属离子亲和层析（imac）、亲和层析、免疫分析和/或比色测定。在一些实施例中，使用ms来确定脂质分子含量。

脂肪酸甲基酯（fame）分析，脂质通过使用folch等(生物化学226：497-509)公开的氯仿：甲醇（2：1v/v）的方法提取获得。中性脂质通过固相色谱法从极性脂质中分离。极性脂质通过安捷伦公司的1100lc分离成单个脂质类，单个脂质类收集用于脂肪酸分析。中性脂质通过薄层色谱法使用包括：石油醚/乙醚/乙酸（80：20：1）的有机系统分离成单个脂质类，然后脂质类收集用于脂肪酸分析。每个脂质类在1%硫酸的甲醇溶液中进行酯交换，于密闭小瓶内氮保护气氛下在100°c反应45min。所得脂肪酸甲基酯从混合物中用含有0.05％丁基化羟基甲苯的己烷溶液萃取，在氮气下密封己烷提取物用于gc分析制备。脂肪酸甲基酯通过装配有30m的db88毛细管壁（安捷伦公司）以及火焰离子化检测器的毛细管gc(安捷伦6890gc）进行分离和定量。

对于本领域的技术人员公知的各种分析方法，进一步在下面文件中描述，并给出这些方法的全部引用出处：质谱：cyrd，等.gcims验证的羊水和血浆中琥珀酰丙酮的纳摩尔范围测定方法：i型酪氨酸血症的分析工具.生物医学与生命科学中的色谱b分析技术学报.2006年2月17;832(1)：24-9;vogeserm.摘要液相色谱-串联质谱法-在临床实验室中的应用.临床化学，2003年二月;41(2)：117-26.高效液相色谱：khalilpn等.验证和应用高效液相色谱法测定红细胞中5'单磷酸脱氢酶肌苷的活性.生物医学与生命科学中的色谱b分析技术学报.2006年5月23日;fouassierm等；通过hplc和elisa测定血清素从血小板中的释放在肝素诱导的血小板减少症的诊断中：与通过（c）-血清素释放测定的参考方法比较;血栓形成和血管造影，2006年5月;4(5)：1136-9;badious等，通过荧光衍生化和反相液相色谱分离测定血浆氨基酸.临实验室床，2004;50(3-4)：153-8;brunellit等，总同型半胱氨酸血浆测定的三种方法的比较.临实验室床，2001;47(7-8)：393-7.毛细管电泳：zinellua等，通过毛细管电泳同时测定血浆和尿液中的胍基乙酸，肌酸酐和肌酸的测定uv-检测.分离科学杂志，2006年三月;29(5)：704-8;jabeenr等，毛细管电泳和临床实验室.电泳，2006年5月23日;gaop等，通过单克隆抗体包被的乳胶和毛细管电泳的组合快速检测金黄色葡萄球菌，电泳2006年5月;27(9)：1784-9.微流体：johannessenea等，一种用于超低体积生物分析的悬浮膜纳米光度计.ieee纳米生物学学报.2002三月;l(l)：29-36;herrmannm，等.酶联产生的荧光检测微通道与内部磁混合的平行微流体elisa的发展.芯片实验室.2006四月;6(4)：555-60.电子版2006三月3;yangs，等.使用流速控制的微流体通道中的血浆分离.美国人工内脏器官协会杂志.2005九月-十月;51(5)：585-90;dupuyam，等.蛋白生物芯片系统临床实验室.临床化学和实验室医学.2005;43(12)：1291-302.色谱：patersons，等.确定用于检测非法海洛因用于治疗阿片类药物依赖的药物海洛因的技术.成瘾.2005十二月;100(12)：1832-9;bottcherm，等.使用来自替代治疗患者的尿样，对丁丙诺啡cedia测定与gc-ms和elisa的评价.分析毒理学杂志.2005十一月-十二月;29(8)：769-76;julakj.血培养，渗出物和支气管肺泡灌洗液的细菌学诊断中的色谱分析.布拉格医学报告.2005;106(2)：175-94;boettcherm，等.利用abuscreen在线测定法在日立917上进行的对尿液中滥用药物的筛查与其他免疫化学测试和gc/ms的精度和可比性。临床实验室.2000;46(l-2)：49-52.免疫分析：boettcherm，等.利用abuscreen在线测定法在日立917上进行的对尿液中滥用药物的筛查与其他免疫化学测试和gc/ms的精度和可比性.临床实验室.2000;46(l-2)：49-52;westermannj，等.与hplc方法相比，通过非竞争性酶免疫简单，快速和灵敏地测定尿液和血浆中的肾上腺素和去甲肾上腺素.临床实验室.2002;48(1-2)：61-71;aoyagik，等.在丙型肝炎感染的早期阶段对丙型肝炎病毒核心抗原的常规酶免疫测定的执行.临床实验室.2001;47(3-4)：119-27;hubiw，等.不同ca15-3免疫测定的多中心质量控制研究.临床实验室.2005;51(11-12)：641-5;hallerca，等.在临床实验室中对尿液羟考酮测试的自动化和即时免疫测定与gc-ms的比较.分析毒理学杂志.2006三月;30(2)：106-11;bayerm，等.用于测定新蝶呤的新的酶联免疫吸附测定的评价.临床实验室.2005;51(9-10)：495-504;groched，等.根据新的ifcc参考方法标准化两种免疫hba1c常规测定.临床实验室.2003;49(11-12)：657-61;;ivano，等，德国研究所，近期建立的血清胰岛素样生长因子i的参考值的适用性：两种测定的比较-（自动）化学发光免疫测定和酶联免疫吸附测定，临床实验室，2005;51(7-8)：381-7。色度分析：kramerka，等，在培养的皮肤成纤维细胞中线粒体呼吸链复合酶活性的自动分光光度分析，临床化学，2005年11月;51(11)：2110-6；groched，等，根据新的ifcc参考方法标准化两种免疫hba1c常规测定，.临床实验室，2003;49(11-12)：657-61；wolfpl，诊断酶学的历史：重大调查的回顾，，临床化学，2006年3月24日。

真实质量分析平台也可用于本发明的检测方法中，真实质量是一种分析平台可以从含有大概400个代谢物包括结构和能量脂质代谢物如甘油三酯、胆固醇酯和磷脂代谢物的样品中获得定量数据。这个平台可用来分析疾病，因为结构和能量脂质作为新陈代谢的中央组件，几乎与个体的每个生物过程融为一体。来自如血浆、血清或其它生物样品的一组数据，包括游离胆固醇以及下述脂肪酸的定量测量，这些脂肪酸为磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰胆碱、甘油三酯、甘油二酯、游离脂肪酸和胆固醇酯：14：0、15：0、16：0、18：0、20：0、22：0、24：0、14：ln5、16：ln7、t16：ln7、18：ln9、t18：ln9、18：ln7、18：2n6、t18：2n6、18：3n6、18：3n3、18：4n3、20：ln9、20：2n6、20：3n9、20：3n6、20：4n6、20：3n3、20：4n3、20：5n3、22：1n9、22：2n6、22：4n6、22：5n3、22：6n3、24：1n9、24：6n3以及16：0、18：0、18：ln9和18：1n7的缩醛磷脂衍生物。使用真值的方法是本领域的技术人员公知常识，也在下面文件中描述，并给出这些方法的全部引用出处：美国专利申请号：11/296，829（申请时间2005/12/06）;mutchdm等，整合代谢方法将硬脂酰辅酶a去饱和酶鉴定为富含花生四烯酸酯的饮食的靶标，美国实验生物学学会联合会杂志，2005年4月；19(6)：599-601.电子版2005年1月24日;stonesj等，dgat2缺陷小鼠中的脂蛋白和皮肤屏障异常.生物化学杂志，2004年3月19日;279(12)：11767-76;watkinssm等，磷脂酰乙醇胺-n-甲基转移酶活性和膳食胆碱调节小鼠肝脏血浆脂质通量和必需脂肪酸代谢，营养学杂志，2003年11月;133(11)：3386-91;watkinssm等，pparγ激动剂罗格列酮的脂质代谢组效应.脂质研究杂志，2002年11月;43(11)：1809-17。

以下实施例为进一步提供说明，不用于限制目的。

实施例

实施例1内标混合物的合成组分

与传统的对于范围较宽的脂质（例如磷脂）通常使用一种内标物的脂类组学战略相比，在此提供包括脂肪酸混合物（每种脂质类最高有10个脂肪酸）内标物的合成方法。本方法中，内标混合物（is混合物）中的脂肪酸选择可以代表分析样品中脂质类的化学结构（脂质分子种类）多样性。表1为根据本发明方法测量的对应于每种脂质类各脂肪酸的浓度值，每种脂质类剩余的脂肪酸归属于最接近的内标物类似物，并赋予测量值；每种脂质类的总浓度通过该脂质类所有分子种类值（测量和赋值的）相加而得。

这10种脂质类的每种内标物根据表1的脂肪酸组分合成。内标物的脂质类如表1第一行所示，脂肪酸“r”列于表1第一列。表1中，“d”代表加入有氘标记。例如，16：0-d9表示含有9个氘原子的棕榈酸盐。

实施例2内标物及其混合物的合成和描述

磷脂酰胆碱、o-磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和p-磷脂酰乙醇胺的典例磷脂内标物，合成开始于磷酸甘油头部基团，酰化氘标记棕榈酸盐（16：0）于sn-1位点；然后酰化不饱和脂肪酸混合物于sn-2位点。磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺的标记特征如表1所示。

对于磷脂酰胆碱和o-磷脂酰胆碱典例内标物，位于sn-2位点的脂肪酸（sn-2脂肪酸）的组分如表2所示。磷脂酰胆碱和sn-2脂肪酸组成的混合物结构如图2所示。含有位于sn-1位点的氘标记棕榈酸盐（16：0）以及位于sn-2位点的的“r”脂肪酸的磷脂酰胆碱结构如图2a所示。含有位于sn-1位点的氘标记棕榈酸盐（16：0）以及位于sn-2位点的作为典例脂肪酸的油酸酯（18：ln9）的磷脂酰胆碱结构如图2a所示。脂肪酸混合物中酰化至磷脂酰胆碱sn-2位点的十种脂肪酸（16：ln7、18：ln9、18：2n6、18：3n3、20：3n6、20：4n6、20：5n3、22：4n6、22：5n3和22：6n3）结构如图2c所示。

典例溶血磷脂酰胆碱内标物的合成开始于磷脂头部基团，然后酰化氘标记棕榈酸盐（16：0）。结构如图3所示。

对于磷脂酰乙醇胺和p-磷脂酰乙醇胺内标物，其sn-2位点脂肪酸的组分如表3所示。磷脂酰乙醇胺和sn-2位点脂肪酸组成的混合物结构如图4所示。含有位于sn-1位点的氘标记硬脂酸（18：0）以及位于sn-2位点的以“r”脂肪酸指示的磷脂酰乙醇胺结构如图4a所示。含有位于sn-1位点的氘标记硬脂酸（18：0）以及位于sn-2位点作为典例脂肪酸的油酸酯（18：ln9）的磷脂酰乙醇胺结构如图4b所示。脂肪酸混合物中酰化至磷脂酰乙醇胺sn-2位点的八种脂肪酸（18：ln9、18：2n6、18：3n3、20：3n6、20：4n6、20：5n3、22：5n3和22：6n3）结构如图4c所示。

溶血磷脂酰乙醇胺内标物的合成开始于磷脂头部基团，然后酰化氘标记硬脂酸（18：0）。结构如图5所示。

鞘磷脂内标物的合成开始于磷酸胆碱头部基团，然后将氘标记鞘氨醇酰化于sn-1位点，酰化脂肪酸混合物于sn-2位点。位于sn-2位点的脂肪酸酰化混合物包括，例如，16：0，18：ln9，24：0和24：ln9。

对于典例内标物鞘磷脂，其脂肪酸组分如表4所示。鞘磷脂和sn-2位点脂肪酸组成的混合物结构如图6所示。含有位于第一位点的氘标记鞘氨醇以及位于sn-2位点的以“r”脂肪酸指示的鞘磷脂结构如图6a所示。含有位于第一位点的氘标记鞘氨醇以及位于sn-2位点作为典例脂肪酸的棕榈酸盐（16：0）的鞘磷脂结构如图6b所示。脂肪酸混合物中连接在鞘磷脂sn-2位点的四种脂肪酸（16：0、18：ln9、24：0和24：ln9）结构如图6c所示。

三酰基甘油内标物的合成，开始于甘油二酯骨架，酰化氘标记棕榈酸盐(16：0)于sn-1位点，酰化油酸酯（18：ln9）位于sn-2位点，酰化脂肪酸混合物于sn-3位点。位于sn-3位点的酰化脂肪酸混合物可以包括，例如，16：0、18：0、18：ln9、18：2n6、18：3n3、20：3n6、20：4n6和22：6n3。

对于典例内标物三酰基甘油，其sn-3位点脂肪酸的组分如表5所示。三酰基甘油和sn-3位点脂肪酸组成的混合物结构如图7所示。含有位于sn-1位点的氘标记棕榈酸盐（16：0）、位于sn-2位点的油酸酯（18：ln9）以及位于sn-3位点的“r”脂肪酸的三酰基甘油结构如图7a所示。含有位于sn-1位点的氘标记棕榈酸盐（16：0）、位于sn-2位点的油酸酯（18：ln9）以及位于sn-3位点作为典例脂肪酸的棕榈酸盐（16：0）的三酰基甘油结构如图7b所示。脂肪酸混合物中连接在三酰基甘油sn-3位点的八种脂肪酸（16：0、18：0、18：ln9、18：2n6、18：3n3、20：3n6、20：4n6和22：6n3）结构如图7c所示。

典例内标物二酰基甘油的合成，开始于甘油骨架，酰化氘标记棕榈酸盐(16：0)于sn-1位点，酰化脂肪酸混合物于sn-2位点。位于sn-2位点的酰化脂肪酸混合物可以包括，例如16：0、18：0、18：ln9、18：2n6、18：3n3、20：4n6、20：5n3和22：6n3。

例如，对于二酰基甘油，其sn-2位点脂肪酸的组分如表6所示。二酰基甘油和sn-2位点脂肪酸组成的混合物结构如图8所示。含有位于sn-1位点的氘标记棕榈酸盐（16：0）以及位于sn-2位点的的“r”脂肪酸的二酰基甘油结构如图8a所示。含有位于sn-1位点的氘标记棕榈酸盐（16：0）以及位于sn-2位点作为典例脂肪酸的棕榈酸盐（16：0）的二酰基甘油结构如图8b所示。脂肪酸混合物中连接在二酰基甘油sn-2位点的八种脂肪酸（16：0、18：0、18：ln9、18：2n6、18：3n3、20：4n6、20：5n3和22：6n3）结构如图8c所示。

典例内标物胆固醇酯的合成，开始于胆固醇骨架，在骨架n6位点上加入氘标记物，酰化脂肪酸混合物于羟基基团。酰化至羟基的酰化脂肪酸混合物可以包括，例如，16：0、16：ln7、18：ln9、18：2n6、20：3n6、20：4n6、20：5n3和22：6n3。

例如，对于胆固醇酯，其脂肪酸组分如表7所示。胆固醇酯和脂肪酸组成的混合物结构如图9所示。含有位于n6位点的氘标记物以及酰化至羟基的“r”脂肪酸指示的胆固醇酯结构如图9a所示。含有位于n6位点的氘标记物以及酰化至羟基的作为典例脂肪酸的亚油酸酯（18：2n6）的胆固醇酯结构如图9b所示。脂肪酸混合物中用来酰化至胆固醇酯羟基的八种脂肪酸（16：0、16：ln7、18：ln9、18：2n6、20：3n6、20：4n6、20：5n3和22：6n3）结构如图9c所示。

游离脂肪酸内标物由50：50混合物合成，包含50%氘标记脂肪酸和50%单奇数链脂肪酸。氘标记脂肪酸可以为，例如棕榈酸盐（16：0），单奇数链脂肪酸，例如17：ln7。

例如，对于游离脂肪酸，其脂肪酸组分如表8所示。游离脂肪酸组成的混合物结构如图10所示。含有氘标记的游离脂肪酸棕榈酸盐（16：0）结构如图10a所示。游离脂肪酸17：ln7的结构如图10b所示。

实施例3脂质内标混合物的验证和性能评估

脂质使用甲醇：二氯甲烷从样品中萃取，含有内标物的二氯甲烷：甲醇（50：50）溶液加入到萃取溶液中，随后进行一系列的离心和底层再离心步骤。整合的底层通过氮气浓缩，然后溶解于0.25ml的10mm醋酸铵二氯甲烷：甲醇（50：50）溶液中。萃取物转移到小瓶中使用infusion-ms进行分析，infusion-ms分析在具有纳米聚醚醚酮管的岛津lc结合sciex公司的selexlon和5500qtrap上进行。样品通过正离子和负离子模式电喷雾进行分析。5500qtrap扫描在mrm模式下执行，总共有+1100mrm，包括内部标准。

组合成了一种典例内标混合物，该内标混合物包括表9中的成分，将合成的内标混合物进行评价，以检测混合物的浓度和纯度。标记和未标记的标准混合物浓度为10.3mgs/ml。混合物中内标物的实际浓度使用nmr分析和定量脂肪酸分析确定；这两个分析的结果相差2%。表9的第2栏为混合物中每种内标物成分的目标浓度，表9的第3栏和第4栏为每种成分的实际浓度。第3栏为标记标准物的浓度，第4栏为未标记标准物的浓度。样品的完整脂肪酸分析确定内标物混合物纯度＞99%。

表9一种典例内标混合物的组分

对标记和未标记的内标混合物的性能进行评估，以确定标记物的存在是否会引起色谱保留时间的转变。与未标记的标准物对比，标记的标准物基本上不会引起保留时间的转变。

对标记和未标记的内标混合物的定量性能进行评估，在未标记标准物溶液和血清中进行实验。脂质分别从未标记内标混合物样品和血清样品中萃取，每种都在有标记内标混合物和pcl7：0/17：0（一种传统的脂质组学内标物）中萃取。样品提取五次以产生10种样品（5种血清和5种未标记标准混合物）。从样品中提取的脂质使用描述的方法进行分析。每种磷脂酰胆碱种类的浓度计算为纳摩尔每毫升材料。浓度使用内标混合物和传统的内标物pcl7：0/17：0计算。在血清中，精确度通过计算分析cv得到，传统pcl7：0/17：0内标物和内标物混合物得到的精确值分别为20%和11%。在未标记的内标混合物样品中，精确度通过计算分析cv（变异系数）得到，传统pcl7：0/17：0内标物和内标物混合物得到的精确值分别为11%和3%。

使用is混合物和传统is计算脂肪酸组份摩尔%含量，并且与样品中脂肪酸实际浓度进行对比。使用is混合物获得的计算值比使用传统is更接近实际值。结果如图11所示。

实施例4内标混合物在人体样品中的评估

评估内标混合物的定量性能，15份人体血清样品中的脂质分子种类，使用表1中的内标混合物进行测量，测量三次。在有标记的内标混合物存在下从血清样品中提取脂质，脂质提取物使用所述方法进行分析。使用内标混合物来计算1100种中每种脂质分子种类的平均浓度，精确度通过计算分析cv得到。15种样品测量三次得到所有1100种测量脂质分子种类的平均浓度和cv值。散点图示出了%cv与脂质分子种类浓度关系，具体见图12。在高浓度下，脂质分子种类的cv值较低，然而一定的分子种类在低浓度下(如0.001um)cv可低至10%。

所有血清样品中的ce脂质类平均浓度为3676.72，平均cv为1.22%。这些结果呈现在图13的箱线图中。信号为血清样品中ce脂质类浓度与空白样的比值，其值为1729.02。tag脂质类的平均浓度为4105.8，平均cv为2.79%。这些结果呈现在图14的箱线图中。tag脂质类的信号值为1348.33。

在另一个例子中，以25份人体血浆作为样品，对内标混合物的性能与传统内标物进行比较。使用本文描述的方法，内标物的组分见表1，计算了三种典例脂质类(ce、pc和pe)的脂肪酸组成。实验结果与使用传统每种脂质类使用单个内标的计算方法相比较，并且比较了定量数值。

对于每种脂质类使用单个内标的定量方法（传统方法），胆固醇酯使用dce(16：0)内标物，磷脂酰胆碱使用dpc(16：0/18：1)内标物，磷脂酰乙醇胺使用dpe(18：0/18：1)内标物。对于单个内标物定量，ce、pc或者pe脂质类中的脂肪酸分别归属到单个的ce、pc或者pe内标物。

对于使用典例混合物作为内标物来定量，使用了每种脂质类的完整内标物（表1）。在所有情况下，被定量的脂质分子种类归属于在脂肪酸组分中具有相同双键数量的内标混合物。例如，分子种类pc(16：0/22：5)、pc(18：0/22：5)和pc(14：0/22：5)都归属于内标物dpc(16：0/22：5)。

胆固醇酯（celc）、磷脂酰胆碱（pclc）和磷脂酰乙醇胺（pelc）脂质类的总浓度，以25份人体血浆为样品，用每种脂质类使用单个内标物和内标物混合物（多种is）进行计算（图15）。gc-fid（真实质量，在别处描述）定量分析。偏差计算方式为：

((计算值-真实质量值)/真实质量值)*100

计算得到单个内标物和内标物混合物的偏差。结果如表10所示。

表10三种典例脂质类总浓度的计算偏差

接下来，测定ce、pc和pe脂质类的脂肪酸组分。所有的数值用摩尔％表示，这一种数据形式，提供了存在于每种脂质类的单个脂肪酸相对于所有脂肪酸的相对含量。在一个实例中，使用单个is(dce(16：0))以及多个is方法测量的胆固醇酯（ce）的脂肪酸组分与相对定量（真实质量）值进行比较，结果如图16所示。y=x线表示偏差为零。所有25份受试验品测量ce脂质类的22种脂肪酸中每种脂肪酸。虽然一些脂肪酸使用单个内标物测定非常有效，其它显示出明显的偏差，然而，当使用多个is测定时偏差较低。

特别是，多不饱和脂肪酸使用单个is方法似乎有些偏差。针对ce和pc脂质类中多不饱和脂肪酸的偏差的具体例子如下所示。偏差使用上述方法计算并列于表11中。25种血浆样品中的每种样品测量pc和ce脂质类的典例脂肪酸的真实（定量）值（μμ）和估计值（使用内标计算得到）。结果如图17所示。

表11给定脂质类中的典例脂肪酸相对含量的偏差

我们的研究证明每种脂质类使用单个内标物测量会引起结果的定量和组分偏差，因为单个内标物不能精准地定量每种脂质类所有的分子种类。使用本文描述的方法，脂质组学分析中定量和组分偏差可以得到有效降低。

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本领域的技术人员将容易理解的是，本发明非常容易实施并获得上述最终目的和优点，以及其固有的那些特点。使用本文描述方法的实施例仅代表优选的实施方案，是示例性的，不旨在作为对本发明范围的限制。但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化和其它使用是可以的。