二肽和含有该二肽的药物组合物的制作方法

本发明涉及一种二肽和含有该二肽的药物或食品组合物。
背景技术：
：疲劳通常以疲劳感、倦怠感为主要症状，但结果会导致运动能力的下降、睡眠障碍、欲望下降等。在短期疲劳的情况下，通过休息、睡眠、营养补给等会恢复，但在慢性疲劳的情况下，长期的全身疲劳感、倦怠感、微热等难以恢复。已知氨基酸组合物(专利文献1)、l-肉碱(专利文献2)、抗坏血酸等(专利文献3)对这些疲劳有用。另外，报告了肝脏水解物具有ampk活化作用，具有抗疲劳效果(专利文献4)。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特开平9-124473号公报专利文献2：日本特开2001-046021号公报专利文献3：日本特开平6-327435号公报专利文献4：国际公开第2015/022927号技术实现要素：然而，肝脏水解物虽然大量含有氨基酸、肽，但尚未判明实际的有效成分。因此，本发明的课题在于提供一种新的具有疲劳预防改善作用的成分。因此，本发明人为了开发出新的疲劳预防改善剂进行了研究，对动物给予肝脏水解物并探索转运到血中的难消化性肽，另外，针对肝脏水解物，使用各种柱对肽进行分级并进行药效评价，结果发现来自特定的d体氨基酸而不是来自l体氨基酸的二肽，发现该二肽具有疲劳预防改善作用，从而完成了本发明。即，本发明提供以下的[1]～[9]。[1]一种二肽，选自(d)ile-(d)pro、(d)leu-(d)pro、(d)pro-(d)ile、(d)pro-(d)leu、(d)val-(d)-pro、(d)pro-(d)val、(d)leu-(d)hyp、(d)ile-(d)hyp、(d)val-(d)hyp、(d)asp-(d)ile、(d)asp-(d)val、(d)asp-(d)leu、(d)asp-(d)phe、(d)ile-(l)pro、(d)leu-(l)pro、(d)pro-(l)ile、(d)pro-(l)leu、(d)val-(l)-pro、(d)pro-(l)val、(d)leu-(l)hyp、(d)ile-(l)hyp、(d)val-(l)hyp、(d)asp-(l)ile、(d)asp-(l)val、(d)asp-(l)leu和(d)asp-(l)phe。[2]根据[1]所述的二肽，选自(d)asp-(d)val、(d)asp-(d)ile、(d)asp-(d)leu、(d)asp-(d)phe、(d)asp-(l)val、(d)asp-(l)ile、(d)asp-(l)leu和(d)asp-(l)phe。[3]一种药物组合物，含有[1]或[2]所述的二肽。[4]根据[3]所述的药物组合物，其是疲劳预防改善剂。[5]一种食品组合物，含有[1]或[2]所述的二肽。[6]根据[5]记载的食品组合物，其是疲劳预防改善用食品组合物。[7]一种[1]或[2]所述的二肽的用途，用于制造疲劳预防改善剂或疲劳预防改善用食品。[8]根据[1]或[2]所述的二肽，用于预防改善疲劳。[9]一种疲劳的预防改善方法，其特征在于，给予有效量的[1]或[2]所述的二肽。本发明的二肽由于来自d体氨基酸，因此，具有难消化性，在血中长时间存在，具有疲劳预防改善作用，因此，作为疲劳预防改善用的药物和食品组合物有用。附图说明图1表示疏水性肽级分的抗疲劳效果。图2表示疏水性焦谷氨酰肽级分的抗疲劳效果。图3表示亲水性肽级分的抗疲劳效果。图4表示亲水性焦谷氨酰肽级分的抗疲劳效果。图5表示asp-leu(dα)的抗疲劳效果。图6表示asp-leu(dβ)的抗疲劳效果。图7表示asp-val(dα)的抗疲劳效果。图8表示asp-val(dβ)的抗疲劳效果。图9表示asp-phe(dα)的抗疲劳效果。图10表示asp-phe(dβ)的抗疲劳效果。具体实施方式本发明的二肽是选自(d)ile-(d)pro、(d)leu-(d)pro、(d)pro-(d)ile、(d)pro-(d)leu、(d)val-(d)-pro、(d)pro-(d)val、(d)leu-(d)hyp、(d)ile-(d)hyp、(d)val-(d)hyp、(d)asp-(d)ile、(d)asp-(d)val、(d)asp-(d)leu、(d)asp-(d)phe、(d)ile-(l)pro、(d)leu-(l)pro、(d)pro-(l)ile、(d)pro-(l)leu、(d)val-(l)-pro、(d)pro-(l)val、(d)leu-(l)hyp、(d)ile-(l)hyp、(d)val-(l)hyp、(d)asp-(l)ile、(d)asp-(l)val、(d)asp-(l)leu和(d)asp-(l)phe中的二肽，其中，从基于口服给予的向血中的转运性、作用持续性和抗疲劳效果的方面考虑，优选为选自(d)asp-(d)val、(d)asp-(d)ile、(d)asp-(d)leu、(d)asp-(d)phe、(d)asp-(l)val、(d)asp-(l)ile、(d)asp-(l)leu和(d)asp-(l)phe中的二肽，进一步优选为(d)asp-(d)leu、(d)asp-(l)leu。在此，(d)这样的表述是指氨基酸为d体。(l)这样的表述是指氨基酸为l体。另外，上述(d)体或(l)体二肽的α体和β体中，更优选β体。本发明的二肽可使用(d)氨基酸作为原料且通过通常的液相肽合成法或固相肽合成法进行制造。例如可通过如下方法进行制造：使保护了α-氨基以外的官能团的氨基酸与保护了羧基以外的官能团的氨基酸或将羧基活化并保护了羧基以外的官能团的氨基酸缩合后，使保护基脱离。在此，作为氨基酸的氨基的保护基，可举出苄氧基羰基、叔丁氧基羰基、芴基甲氧基羰基等。作为羧基的保护基，可举出叔丁基、苄基等。缩合反应可利用使用n,n’-二环己基碳二亚胺、二环己基脲或其它缩合剂的方法、使用硝基苯酚、n-羟基琥珀酰亚胺等的活性酯法、混合酸酐法等。缩合反应结束后，将保护基除去，但在固相法的情况下，进一步将肽的c末端与树脂的键切断。进而，本发明的肽按照通常的方法进行精制。本发明的二肽可以为酸加成盐或碱性盐。作为酸加成盐，可举出盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、氢溴酸、高氯酸等无机酸的盐；柠檬酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、对甲苯磺酸、苯磺酸、甲磺酸、三氟乙酸等有机酸的盐。作为碱性盐，可举出钠、钾、锂等碱金属的盐；钙、镁等碱土金属的盐等。本发明的肽可以为溶剂化物。作为溶剂化物，可举出水(水合物的情况)、甲醇、乙醇、异丙醇等溶剂化物。本发明的二肽具有难消化性，口服给予后的血中转运性高，持续性也优异，具有疲劳预防改善作用。在此，作为疲劳预防改善作用，可举出运动功能持续作用、运动功能提高作用、抗疲劳作用、抗压作用、疲劳感减轻作用、慢性疲劳预防作用、疲劳恢复作用、心悸预防·改善作用、精神不济预防·改善作用、气喘预防·改善作用、肌肉痛预防·改善作用等。因此，本发明的含有二肽的组合物作为药物组合物、食品组合物有用。本发明的药物组合物可通过口服给予、经皮给予、经肠给予、经静脉给予等进行给予，更优选为口服给予。作为口服给予用的制剂，可举出液剂、片剂、散剂、细粒剂、颗粒剂、胶囊剂等，优选为液剂、片剂，更优选为液剂。为了制成这些口服给予制剂，可使用乳糖、甘露醇、玉米淀粉、结晶纤维素等赋形剂；纤维素衍生物、阿拉伯胶、明胶等粘合剂；羧甲基纤维素钙等崩解剂；滑石、硬脂酸镁等润滑剂；非离子表面活性剂等溶解助剂；矫味剂、甜味剂、稳定剂、ph调节剂、水、乙醇、丙二醇、甘油等。另外，也可以使用羟甲基纤维素邻苯二甲酸酯、羟丙甲基纤维素乙酸酯琥珀酸酯、纤维素乙酸酯邻苯二甲酸酯、甲基丙烯酸酯共聚物等被覆剂。另外，也可以在本发明的药物组合物中配合其它有效成分。作为其它有效成分，可举出维生素b1类；硫胺素、硝酸硫胺素、盐酸硫胺素、呋喃硫胺、双苯联硫胺、苯磷硫胺、硫胺素二硫化物、地赛硫胺、硫胺素丙基二硫化物和它们的衍生物、维生素b2类；核黄素和衍生物以及它们的盐、维生素b3类；尼克酸、烟酸、烟酰胺和衍生物以及它们的盐、维生素b5类；泛醇、泛酸和衍生物以及它们的盐、维生素b6类；吡哆醇和衍生物以及它们的盐、维生素b12类；氰钴胺和衍生物以及它们的盐、其它维生素类；维生素a、维生素c、维生素e、维生素k、维生素p、二氯乙酸二异丙胺、牛磺酸、硫酸软骨素、蜂王浆、咖啡因、姜黄、水飞蓟、蒲公英、西洋蒲公英、牛蒡、大蒜、菊花、欧蓍草、栀子花、芝麻、三七、天门冬、洋葱、菊苣、荔枝草、朝鲜蓟(artichoke)、枸杞、豆科·鸢尾科科的植物、斑叶兰、小灌木(ervadepassarinho)、香膏萼距花、野梧桐、红茶、白藜芦醇、儿茶素类、小檗碱、迷迭香、豆萃取物、二甲双胍等。另外，本发明的组合物除药品以外，也可以用作准药品、特定保健用食品、运动饮料、康复用饮料、宠物食品等功能性食品。本发明的药物组合物或食品组合物中的上述二肽的含量根据给予形态而不同，通常优选为0.001～10质量％，更佳为0.001～5质量％。另外，本发明的药物组合物或食品组合物中的上述二肽的1天给予量优选为10mg～1000mg，更优选为20mg～800mg，进一步优选为50mg～800mg。实施例接着，举出实施例对本发明进行详细说明，但本发明不受这些实施例任何限定。实施例1(肝脏水解物的分级)(1)肽与焦谷氨酰肽的分级将强阳离子交换树脂(ag50)填充于econocolumn(2.5×20cm)中，利用10mmhcl使树脂平衡。将1g的肝脏水解物(样品a)溶解于20ml的10mmhcl中。将该溶液添加在树脂上，回收流过级分20ml(流过级分1)。接着，将20ml的10mmhcl添加在树脂上，回收流过级分20ml。将该操作重复进行19次(流过级分2～20)。测定流过级分1～20的吸光度(230nm)，确认肽的溶出。接着，将20ml的50％氨溶液添加在树脂上，回收吸附级分20ml。将该操作重复进行20次(吸附级分1～20)。测定吸附级分1～20的吸光度(230nm)，确认肽的溶出。利用蒸发器对流过级分(焦谷氨酰肽级分)和吸附级分(肽级分)进行减压浓缩。(2)亲水性与疏水性的分级利用10mmhcl使固相萃取柱(sep-pak)平衡。使焦谷氨酰肽级分通过柱，将流过级分溶出并回收(亲水性焦谷氨酰肽级分)。接着，使含有10mmhcl的60％乙腈溶液通过柱，将吸附级分溶出并回收(疏水性焦谷氨酰肽级分)。对肽级分也进行这些操作。将得到的4种级分进行冷冻干燥。实施例2(1)肝脏水解物中的难消化性肽的定量实验1)将2.5mg的肝脏水解物溶解于1ml的50mmtris-hcl中。2)在1)中添加胰酶(0.1mg)、亮氨酸氨基肽酶(2.45unit)、羧肽酶(7.7unit)，进行酶反应(37℃、24h)。3)通过超滤(10k)将酶除去。4)使3)通过填充于旋转管的强阳离子交换树脂(ag50)，回收流过级分(焦谷氨酰肽级分)。5)通过尺寸排阻hplc分级并分取200μl的3)(肽级分)和4)(焦谷氨酰肽级分)(secfr.35-44)。6)针对肽级分，使secfr.35-44干固，进行accq化。针对焦谷氨酰肽级分，直接使用secfr.35-44。7)通过lc-ms/ms分析来确定难消化性肽的结构。管：inertsilods-3洗脱液：0.1％甲酸和含有0.1％甲酸的80％乙腈分析方法：针对肽级分，特异性地检测出(precursorionscan分析)accq的片段(m/z＝171.1)后，通过ms/ms分析来推定结构并合成标准品，通过mrm分析进行鉴定、定量。针对焦谷氨酰肽级分，通过totalscanion分析检测出峰后，通过ms/ms分析来推定结构并合成标准品，通过mrm进行鉴定、定量。(2)将肝脏水解物给予至大鼠时的肽的血中转运的实验1)对维斯特大鼠(6周龄、雄)单次给予肝脏水解物水溶液(10g/60kg)。2)给予30分钟和60分钟后，在异氟烷麻醉下从腹部大静脉采血，得到血浆。进而，将消化道(十二指肠～回肠)摘除，利用生理盐水10ml使管腔内容物溶出。在血浆和消化道内容物中加入3倍量的乙醇(在分析前在-20℃下保存)。3)使血浆和消化道内容物的乙醇上清液干固，进行accq化。4)通过mrm分析进行(1)中鉴定出的难消化性肽的鉴定、定量。将血中的二肽浓度示于表1。[表1](pmolml)(min)asp-leu(dα)asp-val(dα)asp-ile(dα)asp-phe(dα)02.03±0.94nd2.03±0.940.09±0.166016.43±2.09**8.84±0.85**16.43±2.10**2.08±0.09**(min)asp-leu(dβ)asp-val(dβ)asp-ile(dβ)asp-phe(dβ)03.41±0.50nd3.56±1.281.54±0.626028.54±2.83**16.31±3.27*26.37±2.66**17.67±3.25**平均(n＝3)±sd*p＜0.05，**p＜0.01asp-leu(dα)、asp-val(dα)：asp-ile、asp-leu无法在lc中分离，因此，均为asp-ile+asp-leu(dα)。其结果，判明(d)asp-(d)val、(d)asp-(d)phe、(d)asp-(d)ile、(d)asp-(d)leu、(d)asp-(l)val、(d)asp-(l)ile、(d)asp-(l)leu和(d)asp-(l)phe的基于口服给予的血中转运性良好且在血中持续长时间。实施例3(二肽的合成)1)按照以下顺序在茄型烧瓶中加入试剂，一边搅拌一边进行反应(4℃，一整夜)。(i)h-leu-otbu·hcl(ii)dmf(iii)tea(iv)boc-asp(otbu)-oh(lα体)(v)hobt(vi)edl·hcl在其它异构体的情况下，使用以下的保护氨基酸。boc-d-asp(otbu)-oh(dα体)boc-asp-otbu(lβ体)boc-d-asp-otbu(dβ体)2)利用蒸发器将dmf除去。3)溶解于乙酸乙酯中，移至分液漏斗中。4)加入5％碳酸氢钠并进行搅拌，将水层除去。(×2)5)加入10％柠檬酸并进行搅拌，将水层除去。(×2)6)加入饱和盐水并进行搅拌，将水层除去。7)回收乙酸乙酯层，加入硫酸氢钠进行脱水。8)过滤回收乙酸乙酯层，利用蒸发器进行浓缩。9)加入石油醚，使产生的沉淀干燥。(在不产生沉淀的情况下，前进至10))10)在干燥物中加入4mhcl/二烷，一边搅拌一边进行反应(4℃，24～48h)。11)利用蒸发器将4mhcl/二烷除去。12)加入乙醚，利用超声波将得到的沉淀破碎并清洗，利用癸烷将醚上清液除去。(×3)13)加入乙醚并进行放置(4℃，一整夜)。14)加入乙醚，利用超声波将得到的沉淀破碎并清洗，利用癸烷将醚上清液除去。(×3)15)将沉淀物干燥。实施例4[试验方法](1)使用动物在实验中使用体重28～32g(搬入时26g)的ddy系雄性小鼠(日本slc)，在供至实验前在室温22±2℃、湿度55±5％、明暗循环12小时(明期：7：00～19：00；暗期：19：00～7：00)的一定环境下进行饲育。饲育时使用塑料笼(纵30cm×横20cm×高13cm)，除实验以外，使小鼠自由摄取固型饲料和自来水。(2)使用药物和制备法·疏水性肽级分、疏水性焦谷氨酰肽级分、亲水性肽级分、亲水性焦谷氨酰肽级分在生理盐水中溶解，针对每10g体重，腹腔内(i.p.)给予0.1ml。作为给予方案，在强制步行前i.p.给予生理盐水或疏水性肽级分、疏水性焦谷氨酰肽级分、亲水性肽级分、亲水性焦谷氨酰肽级分，在3小时的强制步行负荷后，在观察用笼中适应环境15分钟后，i.p.给予生理盐水或疏水性肽级分、疏水性焦谷氨酰肽级分、亲水性肽级分、亲水性焦谷氨酰肽级分。(3)强制步行负荷强制步行负荷是将小鼠放入直径37×深度35.5cm的电动式旋转笼中，以1转/25秒的速度试行3小时强制步行。(4)自主运动量的测定自主运动量是在将小鼠在塑料笼(纵24cm×横17cm×高12cm)中放入1只并使其适应环境15分钟后，使用supermex将90分钟的平面运动量自动数值化并进行评价。[结果]将结果示于图1～图4。根据图1～图4，与亲水性肽级分相比，疏水性肽级分和疏水性焦谷氨酰肽级分显示优异的抗疲劳效果。实施例5(1)使用动物在实验中使用体重28～32g(搬入时26g)的ddy系雄性小鼠(日本slc)，在供至实验前在室温22±2℃、湿度55±5％、明暗循环12小时(明期：7：00～19：00；暗期：19：00～7：00)的一定环境下进行饲育。饲育时使用塑料笼(纵30cm×横20cm×高13cm)，除实验以外，使小鼠自由摄取固型饲料和自来水。(2)使用药物和制备法·二肽是在生理盐水中溶解，针对每10g体重，腹腔内(i.p.)给予0.1ml。作为给予方案，在强制步行前i.p.给予生理盐水或二肽，在3小时的强制步行负荷后，在观察用笼中适应环境15分钟后，i.p.给予生理盐水或二肽。(3)强制步行负荷强制步行负荷是将小鼠放入直径37×深度35.5cm的电动式旋转笼中，以1转/25秒的速度试行3小时强制步行。(4)自主运动量的测定自主运动量是在将小鼠于塑料笼(纵24cm×横17cm×高12cm)中放入1只，使其适应环境15分钟后，使用supermex将90分钟的平面运动量自动数值化并进行评价。(5)统计处理实验结果以平均值(mean)和标准误差(s.e.m)表示。显著性差异检验在分散分析处理后进行fisher’的plsd法。将p值5％以下判定为有显著性差异。应予说明，该检验中使用statview-j5.0forwindows(注册商标)。[结果]将结果示于图5～图10。由图5～图10明确，asp-leu(dα体)、asp-leu(dβ体)、asp-val(dα体)、asp-val(dβ体)、(d)asp-phe(dα、dβ)显示优异的抗疲劳效果。当前第1页12