政府支持声明本发明是在由美国国立卫生研究院(nationalinstitutesofhealth)授予的授权号r01-dk36425下由政府支持进行的。政府在本发明中具有某些权利。序列表本申请含有已经以ascii格式电子提交并且特此通过引用整体并入的序列表。创建于2019年5月8日的所述ascii副本名称为10491_006542-wo0_v2_st25.txt并且大小为170kb(174,236字节)。本发明涉及重组层粘连蛋白腺相关病毒载体(aav)构建体以及用于恢复缺陷型哺乳动物或具有基底膜不稳定性的哺乳动物的层粘连蛋白表达的相关方法。
背景技术：
：：层粘连蛋白是基底膜(bm)及其组装的基本组分。这些大的糖蛋白是由以长卷曲螺旋连接的α-、β-和γ亚基组成的异源三聚体。层粘连蛋白的基础作用是创建主要支架，所述主要支架(1)将胞外基质附着到细胞表面和细胞骨架，并且(2)充当其它胞外基质组分(如巢蛋白、胶原蛋白和基底膜聚糖(perlecan)/集聚蛋白硫酸肝素蛋白聚糖)变得稳定地附着在其上的平台。许多不同类型的疾病涉及基底膜和层粘连蛋白。转移实体瘤必须穿过基底膜以到达血管系统，并且各种微生物和病毒通过与层粘连蛋白的直接相互作用进入细胞。基于小鼠的基因证据，所述层粘连蛋白中的至少九种层粘连蛋白对于生命是必需的。若干种层粘连蛋白的层粘连蛋白n末端(ln)聚合结构域中的突变是引起肌肉、神经和肾脏疾病的原因。参见scheele等人,2007《分子医学杂志(jmolmed)》85(8):825-36。层粘连蛋白-211(由α2、β1和γ1亚基组成的异源三聚体，缩写为lm211)是骨骼肌和外周神经许旺细胞(sc)的基底膜的主要层粘连蛋白，并且还发现于脑毛细血管中。参见aumailley等人,(2005)《基质生物学(matrixbiol)》24(5):326-32。在胚胎发生期间，层粘连蛋白α2链从胚胎发育的第11天开始沿着发育中的肌肉表达。在编码层粘连蛋白α2链的lama2基因内的ln结构域突变可能导致层粘连蛋白α2蛋白亚基表达的完全或接近完全的损失，以引起层粘连蛋白α2缺陷型肌营养不良(lama2-md)。lama2-md是一种常染色体隐性疾病，其通常表现为非走动性先天性肌营养不良(cmd)，也称为先天性肌营养不良1a型(mdc1a)，是一种在出生或婴儿期开始并且经常伴有外周神经和脑的参与的特别严重的非走动性先天性营养不良。在英国，最近对249名lama2md患者进行的研究揭示，lama2突变是最常见的(37.4％)，随后是肌营养不良蛋白聚糖病(dystroglycanopathy)和ullrich-cmd。参见sframeli等人,(2017)《神经肌肉病症(neuromusculdisor)》27(9):793-803。还存在少量的造成更温和的走动性营养不良的错义和框内缺失突变，主要映射到层粘连蛋白α2短臂聚合结构域(ln)。参见allamand等人,(1997)《人类分子遗传学(hummolgenet)》6(5):747-52；gavassini等人,(2011)《肌肉神经(musclenerve)》44(5):703-9；bonnemann等人,(2014)《神经肌肉病症》24(4):289-311；chan等人,(2014)《神经肌肉病症》24(8):677-83。两者的病理均由肌肉变性、再生、慢性炎症和纤维化组成，伴有白质脑异常和减少的外周神经传导。参见jimenez-mallebrera等人,(20025)《细胞与分子生命科学(cellmollifesci)》62(7-8):809-23。具有无效表达突变的患者从不走动，可能具有外周神经传导缺陷、癫痫和中度精神发育迟缓，并经常在年轻时死于肌肉萎缩和呼吸衰竭。患有缺陷性α2-层粘连蛋白的患者在以后生活中出现不太严重的走动性形式的营养不良(通常是肢带型)，并且还表现出外周和中枢神经系统缺陷。参见bonnemann等人,(2014)《神经肌肉病症》24(4):289-311。治疗通常集中于管理病症的个体体征和症状。目前无法治愈任何一个。另一种神经肌肉疾病，皮尔森综合征(piersonsyndrome)，与层粘连蛋白β2链的缺陷相关，所述层粘连蛋白β2链在神经肌肉接点处的肾小球基底膜中以及在眼内肌肉、晶状体和视网膜中显著表达。层粘连蛋白β2链缺陷是由lamb2基因的错义和框内缺失突变引起的。皮尔森综合征是一种常染色体隐性疾病，主要影响肾脏和眼睛的非常罕见的病症。大多数受影响的儿童患有早期发作、慢性肾衰竭、神经发育问题、明显的眼部异常，其可能包含失明、肌张力减退、精神运动延迟、偏瘫和异常运动。参见schéele等人,(2007)《分子医学杂志》85:825-836。受影响的婴儿可能无法存活超过生命的最初几周或几个月。那些在婴儿期之后存活的人通常具有神经功能障碍和发育延迟。大多数人需要在生命的前十年内进行肾脏移植来治疗晚期肾脏疾病。长期前景不佳。持续需要更好的治疗，尤其是用于基因疗法以恢复患者的层粘连蛋白聚合表达和基底膜组装，特别是用于治疗涉及层粘连蛋白α2和层粘连蛋白β2缺陷的疾病。技术实现要素：在某些实施例中，本发明涉及一种重组腺相关载体(raav)，其包括核酸序列，所述核酸序列包括对alphalnnddeltag2short(αlnndδg2')进行编码的转基因。在某些实施例中，αlnndδg2'包括seqidno:1。在某些实施例中，raav进一步包括cmv启动子，所述cmv启动子包括seqidno:12。在某些实施例中，raav是aav8或aav-dj。在某些实施例中，raav进一步包括末端反向重复序列(itr)。在某些实施例中，itr是包括seqidno:11的5'itr和包括seqidno:16的3'itr。在某些实施例中，本发明涉及一种组合物，其包括本文所述的重组aav中的任何重组aav。在某些实施例中，组合物进一步包括药物载剂。在某些实施例中，本发明涉及一种试剂盒，其包括容器壳体，所述容器壳体包括本文所述的组合物。在某些实施例中，所述容器是注射器。在某些实施例中，本发明涉及一种恢复受试者的层粘连蛋白聚合表达和基底膜组装的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的重组aav载体中的任何重组aav载体。在某些实施例中，本发明涉及一种治疗有需要的受试者的层粘连蛋白α-2缺陷的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的重组aav载体中的任何重组aav载体。在某些实施例中，本发明涉及一种减轻受试者的与选自由层粘连蛋白缺陷型肌营养不良和层粘连蛋白α2缺陷型肌营养不良组成的组的层粘连蛋白缺陷相关的症状中的至少一种症状的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的重组aav载体中的任何重组aav载体。在某些实施例中，本发明涉及一种减轻受试者的与选自由以下组成的组的层粘连蛋白α2-缺陷相关的症状中的至少一种症状的方法：肌肉变性、再生、慢性炎症、纤维化、白质脑异常、外周神经传导减少、癫痫、中度精神发育迟缓以及呼吸衰竭，其中所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的重组aav载体中的任何重组aav载体。在某些方面，本发明的实施例涉及一种用于治疗表征为lama2基因的缺陷或单倍体不足的受试者的层粘连蛋白α2缺乏型肌营养不良的方法。所述方法可以包含向受试者施用有效量的携带对alphalnnddeltag2short(αlnndδg2')进行编码的核酸序列(即，转基因)的重组腺相关病毒，在所期望的细胞中表达所述αlnndδg2'产物的启动子序列的控制下。在某些实施例中，启动子序列提供了αlnndδg2'产物在基底膜中的表达。在某些实施例中，转基因的表达向细胞提供了恢复或维持受试者的所期望的层粘连蛋白聚合表达和基底膜组装所必需的产物。在仍另一个实施例中，本发明提供了用于治疗层粘连蛋白α2缺乏型肌营养不良的组合物。此类组合物可以与载剂和适合注射的另外的组分一起调配。在以下对本发明的优选实施例的详细描述中进一步描述了本发明的其它方面和优点。附图说明图1展示了神经肌肉层粘连蛋白与核心基底膜(bm)组分的相互作用。标记相关层粘连蛋白和其它蛋白质结构域。虚线和点线指示结构域结合相互作用。缩略语：层粘连蛋白(lm)；层粘连蛋白111(lm111)；层粘连蛋白411(lm411)；硫酸化糖脂(sgl)；α营养不良聚糖(αdg)；巢蛋白(nd)；lmα2短臂聚合结构域(ln)。图2展示了在肌肉和外周神经中lm211和lm411介导的bm组装的模型。缩略语：层粘连蛋白211(lm211)；层粘连蛋白411(lm411)；硫酸化糖脂(sgl)；α营养不良聚糖(αdg)；巢蛋白(nd)；lmα2短臂聚合结构域(ln)；与层粘连蛋白卷曲螺旋结合的集聚蛋白的n末端结构域(agrin-nta)；层粘连蛋白g样结构域(lg)。图3a-e是示出了层粘连蛋白功能的连接子蛋白修复的图示、em图像和sds-page图像。图3a示出了αlnnd和mag的结构域结构和功能性活性。源自层粘连蛋白-α1的区域呈绿色；源自巢蛋白-1的区域呈橙色。mag是具有n末端区域(蓝色)和c末端部分(红色)的集聚蛋白的微型化版本。图3b示出了αlnnd和mag以及与层粘连蛋白的复合物的旋转阴影em图像。图3c示出了在lama2md及其dy2j/dy2j小鼠模型的走动性形式中，表达截短版本的lm-211(“dy2j-lm-211”)。αlnnd与巢蛋白结合位点结合并创建具有功能性ln结构域的人工短臂。αlnnd和mag的共表达提供了聚合和αdg锚定的必要结构域。图3d示出了缺乏g2结构域±2个egf样重复序列的聚合连接子蛋白的缩短版本，即αlnnd、αlnndδg2和αlnndδg2。图3e示出了αlnndδg2与lmα1δln-l4b的连接子-层粘连蛋白复合物形成。图4示出了缺乏g2结构域±2个egf样重复序列的αlnnd聚合连接子蛋白的缩短版本，即αlnnd(alphalnnd，其中α是指层粘连蛋白-α1，ln是指ln结构域，并且nd是指巢蛋白)、αlnndδg2(alphalnnddeltag2)和αlnndδg2'(alphalnnddeltag2short)。图5a-e是sds-page、免疫荧光图像以及示出了αlnndδg2'和mag的与lm411结合的aav表达以及αlnndδg'-lm411在许旺细胞上的组装的图。图5a和5b分别示出了表达lm411的293细胞的αlnndδg2'-aav和mag5myc-aav感染。通过n末端flag标记的lm411从培养基中免疫沉淀，随后用图5a中的lmα4的上区段和αlnndδg2'或图5b中的mag和αlnndδg2'的下区段的免疫印迹切割膜来显示与lm411的复合物。图5c和5d示出了由aav产生的αlnndδg2'引起的lm411组装的显著增加。图5e示出了在肌纤维膜中检测来自将aav-αlnndδg2'肌内(i.m.)注射到1周龄的dy3k/dy3kmagtg小鼠中的抗体染色的αlnndδg2'(红色)和层粘连蛋白(绿色)。图6是paav-mcs表达载体的图谱。图7是paav-dj载体的图谱。图8是p辅助载体的图谱。图9是使用蛋白质blast比对的αlnndδg2'蛋白的小鼠和人氨基酸序列的比较。查询＝人αlnndδg2'氨基酸序列。受试者–小鼠αlnndδg2'氨基酸序列。图10提供了如插入aav中的小鼠αlnndδg2'(短-nog2)的开放阅读框的核苷酸和氨基酸序列。信号肽由核苷酸1到51(颜色：绿色)编码。lma1ln由核苷酸52到804(颜色：蓝色)编码。lea1由核苷酸805到975(颜色：品红色)编码。lea2由核苷酸976到1185(颜色：绿色)编码。lea3由核苷酸1186到1356(颜色：红色)编码。lea4由核苷酸1357到1503(颜色：青色)编码。lma1lf区段由核苷酸1504到1536(颜色：蓝色)编码。ndegf-4由核苷酸1537到1668(颜色：红色)编码。ndegf-5由核苷酸1669到1809(颜色：青色)编码。ndty由核苷酸1810到2091(颜色：品红色)编码。ndg3由核苷酸2092到2835(颜色：绿色)编码。ndegf-6由核苷酸2836到3006(颜色：红色)编码。图11提供了如插入aav中的人αlnndδg2'(短-nog2)的开放阅读框的核苷酸和氨基酸序列。信号肽由核苷酸1到51(颜色：绿色)编码。lma1ln由核苷酸52到804(颜色：蓝色)编码。lea1由核苷酸805到975(颜色：品红色)编码。lea2由核苷酸976到1185(颜色：绿色)编码。lea3由核苷酸1186到1356(颜色：红色)编码。lea4由核苷酸1357到1503(颜色：青色)编码。lf片段由核苷酸1504到1536(颜色：蓝色)编码。ndegf-4由核苷酸1537到1668(颜色：红色)编码。ndegf-5由核苷酸1669到1809(颜色：青色)编码。ndty由核苷酸1810到2091(颜色：品红色)编码。ndg3由核苷酸2092到2835(颜色：绿色)编码。ndegf-6由核苷酸2836到3006(颜色：红色)编码。图12提供了如插入aav中的小鼠αlnndδg2'(短-nog2)的开放阅读框的核苷酸序列。图13提供了小鼠αlnndδg2'(短-nog2)的氨基酸序列。图14提供了如插入aav中的人αlnndδg2'(短-nog2)的开放阅读框的核苷酸序列。图15提供了人αlnndδg2'(短-nog2)的氨基酸序列。具体实施方式异源三聚体层粘连蛋白是所有基底膜的限定组分并且自组装成细胞相关网络。在哺乳动物中，所有层粘连蛋白都是由五个α链之一、三个β链之一和三个γ链之一构成的异源三聚体。尽管总共有至少45种潜在的αβγ链组合，但截至2010年仅报道了15种不同的层粘连蛋白同种型。基于体外研究，存在至少16种允许的层粘连蛋白同种型(下表1)。表1.哺乳动物层粘连蛋白.12名称缩写名称链组合物层粘连蛋白-111lm111α1β1γ1层粘连蛋白-121lm121α1β2γ1层粘连蛋白-211lm211α2β1γ1层粘连蛋白-213lm213α2β1γ3层粘连蛋白-221lm221α2β2γ1层粘连蛋白-3113lm311α3β1γ1层粘连蛋白-3124lm312α3β1γ2层粘连蛋白-321lm321α3β2γ1层粘连蛋白-332lm332α3β3γ2层粘连蛋白-411lm411α4β1γ1层粘连蛋白-421lm421α4β2γ1层粘连蛋白-4225lm422α4β2γ2层粘连蛋白-423lm423α4β2γ3层粘连蛋白-511lm511α5β1γ1层粘连蛋白-521lm521α5β2γ1层粘连蛋白-523lm523α5β2γ3层粘连蛋白是基底膜的基本中央组织者，这可能是层粘连蛋白与细胞、与自身以及与其它基底膜组分结合的独特能力的结果。组织和分化细胞的出现所需的基底膜在胚胎发育、组织稳态和人类疾病中是很重要的。十字形层粘连蛋白分子的三个短臂形成网络节点，其中对一个α臂、一个β臂和一个γ臂具有严格要求。同源短臂由远端层粘连蛋白n末端(ln)结构域构成，随后是层粘连蛋白型表皮生长因子样(le)结构域的串联重复序列并穿插有未知结构的球形结构域。ln结构域对于层粘连蛋白聚合和bm组装是必需的。层粘连蛋白聚合对于髓鞘形成是很重要的。含有α3a、α4和β2亚基的层粘连蛋白不具有ln结构域的完整补体，并且因此无法聚合(在hohenester和yurchenco中进行综述2012.《细胞粘附和迁移(celladh.migr.)》2013.7(1):56-63)。所述十字的长臂(长度为75-80nm)是由所有三个链形成的α螺旋状的卷曲螺旋，而三个短臂(35–50nm)各自由一个链构成。在长臂远端处，α链添加了含有层粘连蛋白的主要细胞粘附位点的五个层粘连蛋白g样(lg)结构域。长臂的端处的这个球形结构域与细胞受体结合，包含整联蛋白、α营养不良聚糖、硫酸乙酰肝素和硫酸化糖脂。层粘连蛋白网络的侧枝锚定由蛋白聚糖、基底膜聚糖和集聚蛋白提供。然后，由iv胶原蛋白形成第二网络，所述胶原蛋白通过基底膜聚糖和集聚蛋白的硫酸乙酰肝素链以及通过巢蛋白进行另外连接与层粘连蛋白网络相互作用。通常参见hohenester等人(2013)《细胞粘附和迁移》7(1):56-63。在胚胎发育的后期，基底膜的这种成熟变得至关重要。在图1中，lm111，一种在胚胎发生中表达的原型层粘连蛋白(lm)，与细胞表面硫酸化糖脂(sgl)、整联蛋白、α营养不良聚糖(αdg)、巢蛋白(nd)、集聚蛋白结合并且通过其ln结构域聚合。胶原蛋白-iv和基底膜聚糖与巢蛋白结合。整联蛋白和αdg通过衔接子蛋白附着到细胞骨架。lm411，一种不聚合的lm同种型，表现出非常弱的整联蛋白和αdg结合。lm211和lm411在肌肉和外周神经中介导bm组装。层粘连蛋白通过与硫酸化糖脂(sgl)(如硫苷脂)结合、与整联蛋白α7β1和α营养不良聚糖(αdg)结合并且通过ln相互作用聚合而形成初始的新生支架，如图2所示。巢蛋白(主要是巢蛋白-1)与层粘连蛋白和胶原蛋白-iv结合，充当桥，其中胶原蛋白聚合以形成第二网络。所有组分通过层粘连蛋白直接地或间接地束缚到细胞受体，但可以单独地与其它整联蛋白相互作用。lm411是与lm211在神经中共组装的非聚合层粘连蛋白。αlnnd与lm411结合并赋予聚合活性。微型集聚蛋白(miniagrin)(mag，ma)与lm411结合并赋予αdg结合。(参见mckee等人,2017.《临床研究杂志(j.clin.invest.》127:1075-1089和reinhard等人2017,《科学转化医学(sci.transl.med.)》28:9(396),pii:eaal4649.doi:10.1126/scitranslmed.aal4649)。许旺细胞(sc)bm与肌肉bm共享整个架构组织；然而，所述两者在以下若干方面有所不同：(i)β1-整联蛋白是髓鞘形成的主要介质，而在肌肉中，αdg是最重要的受体；(ii)若干sc整联蛋白可用于与bm相互作用(但在肌肉中仅α7β1)，从而允许其它bm组分的整联蛋白连接；(iii)在肌纤维中不存在的lmα4是有助于髓鞘形成的正常sc亚基；(iv)sc表达可以实现α4-层粘连蛋白粘附的硫苷脂和cd146；并且(v)dy2j脱髓鞘在坐骨神经和根中最明显，表明层粘连蛋白聚合的特别重要性。α2-层粘连蛋白也在形成血脑屏障的毛细血管中发现。层粘连蛋白亚基的损失使屏障对水渗漏，这很可能解释了几乎所有lama2-md患者中通过mri检测到的脑白质变化。层粘连蛋白α2缺陷型肌营养不良(lama2-md)是由lama2基因内的突变引起的常染色体隐性疾病，其通常呈现为非走动性先天性肌营养不良(cmd)。营养不良经常伴有外周神经和脑的参与。大多数lama2突变导致蛋白质亚基表达(特别是lm211)的完全或接近完全的损失，从而造成特别严重的非走动性先天性营养不良。还存在少量的造成更温和的走动性营养不良的错义和框内缺失突变，主要映射到lmα短臂聚合结构域(ln)。在lama2-md中，lm411的转录和蛋白质积累增加，而lm511少量增加。lm411是不寻常的，是因为其与肌肉αdg和整联蛋白弱结合并且缺乏聚合的能力。lm411不足以进行bm组装，使得细胞表面积累相对于其它层粘连蛋白需要高lm411浓度，这解释了其拯救lama2突变的有限能力。这些组成变化是在不存在层粘连蛋白-α2的情况下观察到的bm的结构衰减的基础。参见综述，yurchenco等人,2017,《基质生物学》,pii:s0945-053x(17)30333-5.doi:10.1016/j.matbio.2017.11.009。用于层粘连蛋白α2链缺陷的若干个小鼠模型是可获得的，并且所述若干个小鼠模型还显示肌肉营养不良以及外周和中枢神经系统髓鞘形成缺陷。bm被破坏，并且在lmα2链缺陷型肌肉中lmα2链受体和一些bm相关蛋白的表达被改变，并且结构和信号传导缺陷两者对于正常的肌肉功能可能是有害的。此外，已经证明层粘连蛋白α2链分别在外周神经系统和中枢神经系统中诱导许旺细胞增殖和少突胶质细胞扩散以及髓鞘形成的关键性作用。参见schéele等人,(2007)《分子医学杂志》85:825-836。层粘连蛋白α2在dyw(dyw/dyw)小鼠中大大减少，而在dy3k(dy3k/dy3k)lama2-敲除小鼠中则完全不存在。这两个模型表示大多数表达非常低的或根本不表达层粘连蛋白α2亚基的lama2-md患者。dy3k小鼠(受影响最严重的小鼠)是极其虚弱、小的，以及寿命非常短。第三个模型是dy2j(dy2j/dy2j基因型)小鼠，其中层粘连蛋白α2略有减少，而层粘连蛋白α4适度增加。dy2j小鼠中的lm211由于ln结构域的损失而不能聚合。dy2j小鼠的特征在于：在约31/2周龄时开始进行性虚弱和麻痹，其中后肢首先受影响，并且随后轴向和前肢肌肉受影响，许旺细胞不能分选并包埋轴突，从而导致脱髓鞘。然而，这些小鼠可以存活许多个月。对于lama2-md的治疗的发展存在挑战。通过lama1(lmα1)的种系转基因恢复层粘连蛋白表达的直接方法在其恢复小鼠的正常功能的能力方面是有效的；然而，9.3kbdna构建体对于可用的递送系统而言太大。药物疗法显示出改进，但重要的是未纠正潜在的结构缺陷。已经发现ehs源性lm111(肠胃外递送到发炎肌肉)在dyw小鼠中是有益的，但尚未显示这种方法对于治疗所需的重组层粘连蛋白是有效的。尽管纠正框外突变的外显子跳读已经用于治疗肌营养不良蛋白缺陷，但对于层粘连蛋白缺陷是有问题的，因为外显子边界与蛋白质结构域边界不匹配，并且几乎所有lama2外显子的跳读将可能导致半胱氨酸错配和结构域错折叠。aav递送的crispr/cas9已经用于修复剪接缺陷，所述剪接缺陷发现于大约20％的lama2-md受试者中。显示的是，转基因minagrin(mag)表达部分地改善层粘连蛋白-α2缺陷型肌营养不良的小鼠模型的肌肉病理生理，即使在出生之后表达时也是如此。当通过aav将mag基因引入围产期dyw(dyw/dyw)小鼠时，观察到类似的益处。参见qiao等人,《美国国家科学院院刊(procnatlacadsciusa)》(2005)102(34):11999-2004。已经证明用于在人中治疗杜氏肌营养不良的微型肌营养不良蛋白aav递送。参见mendell,《神经科学快报(neuroscilett)》(2012)。本发明提供了具有改善所有lama2-md的潜力的基底膜的修复。重组层粘连蛋白和嵌合连接子蛋白可以修复lama2-md的模型中的基底膜缺陷。理解bm组装要求的最新进展已经显示，层粘连蛋白结合蛋白可以提供用于在缺乏ln结构域的层粘连蛋白中聚合的替代性臂。αlnnd、βlnnd和γlnnd连接子蛋白可以使得能够在缺乏对应的αln、βln和γln结构域的层粘连蛋白中聚合。参见mckee等人,《基质生物学》(2018),www.//doi.org/10.1016/j.matbio.2018.01.012,《营养不良的皮尔森和其它层粘连蛋白聚合残基的嵌合蛋白鉴定(chimericproteinidentificationofdystrophic,piersonandotherlamininpolymerizationresidues)》。αlnnd由三个球形结构域组成，其中介入杆由lmα1ln-lea结构域与巢蛋白-1g2-g3结构域融合产生，如图3a和图4所示。ln球形结构域是聚合结构域。g2与胶原蛋白-iv和基底膜聚糖结合，而g3与lmγ1-leb3结构域结合，从而产生附着到短臂十字交叉点附近的基因座的人工臂。当与缺乏α-ln结构域的非聚合层粘连蛋白结合时，αlnnd使得能够聚合并且胶原蛋白-iv募集到bm，而对wt层粘连蛋白没有不利影响。参见mckee等人,《生物化学杂志(jbiolchem)》,(2009)284(13):8984-8994。已经显示出αlnnd的转基因表达改善了dy2j肌肉营养不良并且与minagrin(增强受体结合的蛋白质)组合，还改善了更严重的dyw营养不良。参见mckee等人,《临床研究杂志》(2017)127(3)1075-1089；reinhard等人,《科学转化医学》(2017)9(396)。另外值得注意的是，通过使用βlnnd而不是αlnnd蛋白来恢复聚合到携带β2ln突变的肾小球lm521，可能治疗患有由层粘连蛋白自组装失败引起的皮尔森综合征的患者。腺相关病毒(aav)是最有前景的基因递送系统之一，在所述基因递送系统中可以在肌肉、外周神经和其它组织中实现高表达。潜在风险包含对转基因产物和aav衣壳的宿主细胞免疫应答，以及随后的蛋白质损失。然而，通过避免转基因新抗原的产生已经减少了这个问题。αlnndd、βlnnd和γlnnd连接子蛋白的结构域通常表达为更大的基底膜蛋白的部分，甚至在营养不良状态下，并且不太可能是免疫原性的。为了利用其中cmv启动子已经被增强并且具有最大的插入能力的aav递送的最新改进，本发明的优选的aav系统是采用具有混合的血清型衣壳的增强的cmv启动子并允许高达3.1kb插入的aav-dj系统(加利福尼亚州圣地牙哥的细胞生物实验室公司(cellbiolabs,inc.,sandiego,ca))(参见图6-8)。αlnnd的aav体细胞基因表达的问题是，尽管αlnnd小到足以由aav表达，但启动子将必须非常小并且将不可能提供良好的表达。对于这个问题的潜在解决方案是减小αlnnddna的大小(4.17kb)，使其可以适合aav，但关注的是减小大小可能影响蛋白质的用于基膜组装和髓鞘形成的功能。由于n末端和c末端结构域是必需的，因此重点在于减小内部结构域的大小。图3a和4示出了被制备并命名为αlnndδg2的第一经过修饰蛋白。g2的去除给出了大部分所需的还原，但是代价是失去聚合层粘连蛋白与胶原蛋白-iv以及基底膜聚糖的直接偶联。用许旺细胞、肌管和背根神经节进行的实验揭示，g2及其侧接3kb的le/egf样结构域是可消耗的，只要某个巢蛋白-1存在于测试系统中。用转基因进行的其它实验显示，基本的巢蛋白-1保留在基底膜中，这指示可以追求αlnnd连接子蛋白的大小减小。本发明提供了被命名为αlnndδg2'的新的αlnnd连接子蛋白，其中内部g2和两个egf样的间隔子结构域已经被去除，将核苷酸序列的大小减小到约2.9-3.0kb，使得其足够小以由aav表达但保留蛋白质的用于基底膜组装和髓鞘形成的功能。本发明涉及使用aav-dj-αlnndδg2'构建体来恢复在肌肉、外周神经和其它组织中的层粘连蛋白聚合和基底膜组装，并且改善lama2-md。预期的是，此类方法和aav-dj-αlnndδg2'构建体可以有效治疗人类疾病。为了便于参考，本文所述的载体构建体被称为各种aav-dj-αlnndδg2'构建体，其指示包括编码小鼠alphalnnddeltag2short的核酸序列以及其它元件的aav-dj构建体。如图9所示，人alphallnddeltag2short蛋白与小鼠alphallnddeltag2short蛋白具有87％同一性。预期的是，密码子优化的人构建体将以相同的期望方式发挥作用，以恢复在肌肉、外周神经和其它组织中的层粘连蛋白聚合和基底膜组装，并且改善lama2-md。据信，可以使用相同的aav-dj构建体通过用来自βlnnd蛋白的β1区段替代α1区段以便恢复聚合到携带β2ln突变的肾小球lm521来治疗患有皮尔森综合征的患者。aav相容的层粘蛋白—连接子蛋白alphalnnddeltag2short，缩略语：aav：腺相关病毒raav重组腺相关病毒或病毒载体bm：基底膜αlnndα层粘连蛋白n末端结构域连接蛋白αlnndδg2'α层粘连蛋白n末端结构域δg2短连接蛋白，alphalnnddeltag2shortα-dgα营养不良聚糖βlnndδg2'β层粘连蛋白n末端结构域δg2短连接蛋白，betalnnddeltag2shortecm胞外基质γlnndδg2'γ层粘连蛋白n末端结构域δg2短连接蛋白，gammalnnddeltag2shortle结构域层粘连蛋白型表皮生长因子样结构域lg结构域层粘连蛋白g样结构域lm或lm层粘连蛋白ln结构域层粘连蛋白n末端结构域定义为了可以更容易地理解本发明，下文具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文档的其它地方明确定义，否则本文所使用的所有其它技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义。如本文所使用的，包含所附权利要求书，词语的单数形式，如“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包含其对应的复数指代物，除非上下文中清楚地另有指明。“激活”、“刺激”和“治疗”，在其应用于细胞或受体时，可以具有相同的含义，例如用配体激活、刺激或治疗细胞或受体，除非上下文中明确地另有指明。“配体”涵盖天然和合成的配体，例如细胞因子、细胞因子变体、类似物、突变蛋白以及源自抗体的结合化合物。“配体”还涵盖小分子，例如细胞因子的肽模拟物和抗体的肽模拟物。“激活”可以指代由内部机制以及外部或环境因素调节的细胞激活。例如细胞、组织、器官或生物体的“应答”涵盖生物化学或生理行为的变化，例如生物隔室内的浓度、密度、粘附或迁移、基因表达的速率或分化状态，其中所述变化与激活、刺激或治疗或与内部机制(如基因编程)相关。分子的“活性”可以描述或指代分子与配体或与受体、与催化活性的结合；刺激基因表达或细胞信号传导、分化或成熟的能力；抗原活性、调节其它分子的活性等。分子的“活性”还可以指代在调节或维持细胞到细胞相互作用(例如，粘附)中的活性或在维持细胞的结构(例如，细胞膜或细胞骨架)中的活性。“活性”还可以意指比活性，例如(催化活性)/(mg蛋白质)或(免疫活性)/(mg蛋白质)、在生物隔室中的浓度等。“活性”可以指代先天性或适应性免疫系统的组分的调节。“施用”和“治疗”，在其应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织，器官或生物流体的接触。“施用”和“治疗”可以指代例如治疗、药代动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的治疗涵盖试剂与细胞的接触以及试剂与流体的接触，其中流体与细胞接触。“施用”和“治疗”还意指例如通过试剂、诊断、结合化合物或通过另一细胞进行的细胞的体外和离体治疗。术语“受试者”包含任何生物体，优选地动物，更优选地哺乳动物(例如，大鼠、小鼠、狗、猫、兔子)，并且最优选地人类，包含人类患者。“alphalnnd”(αlnnd)是由三个球形结构域组成的连接子蛋白，其中介入杆由lmα1ln-lea结构域与巢蛋白-1g2-g3结构域融合产生。ln球形结构域是聚合结构域。g2与胶原蛋白-iv和基底膜聚糖结合，而g3与lmα1-leb3结构域结合，从而产生附着到短臂十字交叉点附近的基因座的人工臂。当与缺乏αln结构域的非聚合层粘连蛋白结合时，αlnnd使得能够聚合并且胶原蛋白-iv募集到bm，而对wt层粘连蛋白没有不利影响。“治疗(treat)”或“治疗(treating)”意指向患有一种或多种疾病症状或怀疑患有疾病或处于升高的患病风险的受试者或患者内部或外部地施用治疗剂，如含有本发明的任何raav构建体的组合物，对于所述疾病药剂具有治疗活性。通常，所述药剂以有效减轻所治疗受试者或群体中的一种或多种疾病症状的量施用，无论是通过以临床上可测量的程度诱导此类一种或多种症状的消退或抑制其的进展。有效减轻任何特定疾病症状的治疗剂的量(也称为“治疗有效量”)可以根据如患者的疾病状态、年龄和体重以及药物能够在受试者中引起期望的应答的能力而变化。疾病症状是否已经减轻可以通过由医师或其它熟练的医疗保健提供者通常用于评估所述症状的严重性或进展状态的任何临床测量来评估。尽管本发明的实施例(例如，治疗方法或制品)可能不能有效地减轻每个受试者的一种或多种靶疾病症状，但是所述实施例应当减轻统计学上显著数量的受试者中的一种或多种靶疾病症状，如通过本领域已知的任何统计学测试(如学生t测试(student'st-test)、chi2测试、根据mann和whitney的u测试、kruskal-wallis测试(h测试)、jonckheere-terpstra测试和wilcoxon测试)所确定的。“治疗”，在其应用于人、兽医或研究受试者时，是指治疗性治疗、预防性(prophylactic或preventative)措施，用于研究和诊断应用。“治疗”，在其应用于人、兽医或研究受试者或细胞、组织或器官时，涵盖在应用于人或动物受试者、细胞、组织、生理隔室或生理流体时，本发明的任何raav构建体的转染或相关方法。“分离的核酸分子”意指基因组、mrna、cdna或合成来源的dna或rna或其某种组合，其不与在自然界中发现分离的多核苷酸的多核苷酸的全部或一部分相关，或与在自然界中未与其连接的多核苷酸连接。出于本公开的目的，应当理解，“包括”特定核苷酸序列的核酸分子不涵盖完整的染色体。除指定序列之外，“包括”指定核酸序列的分离的核酸分子可以包含多达十个或甚至多达二十个或更多个其它蛋白质或其部分或片段的编码序列，或可以包含控制所列举的核酸序列的编码区的表达的可操作地连接的调节序列，和/或可以包含载体序列。短语“控制序列”是指在特定宿主生物体中表达可操作地连接的编码序列所必需的dna序列。适用于原核生物的控制序列例如包含启动子、任选地操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞使用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。当核酸被放置到与另一核酸序列处于功能关系中时，所述核酸是“可操作地连接的”。例如，如果前序列或分泌性前导序列的dna表达为参与多肽分泌的前蛋白，则其与多肽的dna可操作地连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则所述启动子或增强子与编码序列可操作地连接；或如果核糖体结合位点被定位以便促进翻译，则所述核糖体结合位点与编码序列可操作地连接。通常，“可操作地连接”意指被连接的dna序列是连续的，并且在分泌性前导序列的情况下是连续的并且处于阅读相中。然而，增强子不必是连续的。通过在方便的限制性位点处进行连接来完成连接。如果此类位点不存在，则根据常规实践使用合成寡核苷酸衔接子或连接子。如本文所使用的，表达“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有此类命名均包含子代。因此，词语“转化体”和“经过转化的细胞”包含原代受试者细胞和源自其的培养物，而不考虑转移的数量。还应理解，由于有意或故意的突变，并非所有子代将具有精确地相同的dna含量。包含具有与经过原始转化的细胞中筛选的功能或生物活性相同的功能或生物活性的突变体子代。在打算使用不同的命名的情况下，则从上下文将显而易见。重组aav在一些方面，本发明提供了分离的aav。如本文关于aav所使用的，术语“分离的”是指已经从其天然的环境(例如，从宿主细胞、组织或受试者)中分离或人工产生的aav。可以使用重组方法产生分离的aav。此类aav在本文中被称为“重组aav”。重组aav(raav)优选地具有组织特异性靶向能力，使得raav的转基因将被特异性地递送到一个或多个预定组织。aav衣壳是确定这些组织特异性靶向能力的重要元件。因此，可以选择具有适合于被靶向的组织的衣壳的raav。为了在治疗层粘连蛋白α-2缺乏的上下文中靶向期望的组织，优选的raav是aav-dj衣壳和aav-2rep基因主链的组合，从而产生本文所述的各种raav(参见序列表)。已经描述了用于获得具有期望的衣壳蛋白的重组aav的方法(参见例如us2003/0138772，所述文献的内容通过引用整体并入本文)。已经描述了许多不同的aav衣壳蛋白，例如在g.gao等人,《病毒学杂志(j.virol)》,78(12):6381-6388(2004年6月)中公开的aav衣壳蛋白；g.gao等人,《美国国家科学院院刊》,100(10):6081-6086(2003年5月13日)；us2003-0138772、us2007/0036760、us2009/0197338，所述文献涉及aav衣壳蛋白以及相关的核苷酸和氨基酸序列的内容通过引用并入本文。对于目前描述的构建体和方法的期望包装，aav-dj载体和衣壳是优选的(seqidno:17)。通常，所述方涉及培养宿主细胞，所述宿主细胞含有对aav衣壳蛋白或其片段进行编码的核酸序列；功能性rep基因；由aav末端反向重复序列(itr)和转基因构成的重组aav载体；以及足够的辅助功能以允许将重组aav载体包装到aav衣壳蛋白中。可以以反式向宿主细胞提供有待在宿主细胞中培养以将raav载体包装在aav衣壳中的组分。可替代地，所需组分(例如，重组aav载体、rep序列、cap序列和/或辅助功能)中的任何一种或多种组分可以由稳定宿主细胞提供，所述稳定宿主细胞已经使用本领域的技术人员已知的方法被工程化成含有所需组分中的一种或多种组分。最适合的是，此类稳定宿主细胞将含有在诱导型启动子的控制下所需的一种或多种组分。然而，所需的一种或多种组分可以在组成型启动子的控制下。在仍另一个替代方案中，所选的稳定宿主细胞可以含有在组成型启动子控制下的所选的一种或多种组分以及在一个或多个诱导型启动子控制下的其它所选的一种或多种组分。例如，可以产生稳定宿主细胞，所述稳定宿主细胞源自293个细胞(所述细胞在组成型启动子控制下含有e1辅助功能)，但是所述细胞在诱导型启动子控制下含有rep蛋白和/或cap蛋白。可以使用任何适当的基因元件(载体)将重组aav载体、rep序列、cap序列和用于产生raav的辅助功能递送到包装宿主细胞。可以通过任何适合的方法(包含本文所述的方法)递送所选基因元件。参见例如k.fisher等人,《病毒学杂志》,70:520-532(1993)和美国专利第5,478,745号。在一些实施例中，可以使用三重转染方法来产生重组aav(例如，如在美国专利第6,001,650号中详细描述的，所述美国专利涉及三重转染方法的内容通过引用并入本文)。通常，通过用有待包装成aav颗粒、aav辅助功能载体和附属功能(accessoryfunction)载体的重组aav载体(包括转基因)转染宿主细胞来产生重组aav。aav辅助功能载体编码“aav辅助功能”序列(即，rep和cap)，所述序列以反式作用于生产性aav复制和衣壳化。优选地，aav辅助功能载体支持有效的aav载体产生，而不产生任何可检测的野生型aav病毒粒子(即，含有功能性rep和cap基因的aav病毒粒子)。适合与本发明一起使用的载体的非限制性实例包含在美国专利第6,001,650号中描述的phlp19和在美国专利第6,156,303号中描述的prep6cap6载体，所述两个美国专利的整体通过引用并入本文。附属功能载体编码非aav源性病毒和/或细胞功能的核苷酸序列，aav依赖于所述非aav源性病毒和/或细胞功能进行复制(即“附属功能”)。附属功能包含aav复制所需的功能，包含但不限于涉及aav基因转录的激活、阶段特异性aavmrna剪接、aavdna复制、cap表达产物的合成以及aav衣壳组装的那些部分。基于病毒的附属功能可以源自任何已知的辅助病毒，如腺病毒、疱疹病毒(除了单纯疱疹病毒1型)和牛痘病毒。关于经过转染的宿主细胞，术语“转染”用于指代由细胞摄取外源dna，并且当外源dna已经被引入到细胞膜内部时，细胞已经被“转染”。许多转染技术通常是本领域已知的。参见例如graham等人(1973)《病毒学(virology)》,52:456；sambrook等人(1989)《分子克隆，实验室手册(molecularcloning,alaboratorymanual)》,冷泉港实验室(coldspringharborlaboratories),纽约；davis等人(1986)《分子生物学的基本方法(basicmethodsinmolecularbiology)》；elsevier和chu等人(1981)《基因(gene)》13:197。此类技术可以用于将一种或多种外源核酸，如核苷酸整合载体和其它核酸分子引入适合的宿主细胞中。“宿主细胞”是指包含或能够包含感兴趣的物质的任何细胞。宿主细胞通常是哺乳动物细胞。宿主细胞可以用作aav辅助构建体、aav微基因质粒、附属功能载体或与重组aav的产生相关的其它转移dna的受体。术语包含已经被转染的原始细胞的子代。因此，如本文所使用的“宿主细胞”可以是指已经用外源dna序列转染的细胞。应当理解，由于天然的、偶然的或故意的突变，单个亲本细胞的子代在形态学上或在基因组或总dna互补物上可能不一定与原始亲本细胞完全相同。关于细胞，术语“分离的”是指已经从其天然环境(例如，从组织或受试者)分离的细胞。术语“细胞系”指代能够在体外连续或延长的生长和分裂的细胞群体。通常，细胞系是源自单个祖细胞的克隆群体。在本领域中进一步已知的是，在此类克隆群体的储存或转移期间，自发或诱导的变化可能在核型中发生。因此，源自所提及的细胞系的细胞可能与祖细胞或培养物不精确地相同，并且所提及的细胞系包含此类变体。如本文所使用的，术语“重组细胞”是指外源dna区段，如导致生物活性多肽的转录或生物活性核酸(如rna)的产生的dna区段已经被引入其中的细胞。术语“载体”包含任何基因元件，如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、人工染色体、病毒、病毒粒子等，当与合适的控制元件相关时所述基因元件能够进行复制并且可以细胞之间转移基因序列。因此，所述术语包含克隆和表达载体，以及病毒载体。在一些实施例中，有用的载体预期是其中待转录的核酸区段定位在启动子的转录控制下的那些载体。“启动子”是指由细胞的合成机制(syntheticmachinery)或引入的合成机制识别的、启动基因的特异性转录所需的dna序列。短语“可操作地定位”、“可操作地连接”、“在控制下”或“在转录控制下”意指启动子相对于核酸处于正确的位置和朝向，以控制rna聚合酶启动和基因的表达。术语“表达载体或构建体”意指含有核酸的任何类型的基因构建体，其中部分或全部核酸编码序列能够被转录。在一些实施例中，表达包含核酸的转录，例如以从转录的基因产生生物活性多肽产物或抑制性rna(例如，shrna、mirna)。重组aav载体本文所述的“重组aav(raav)载体”通常至少由转基因(例如，编码αlnndδg2')和其调节序列以及5'和3'aav末端反向重复序列(itr)构成。正是这种重组aav载体被包装到衣壳蛋白中并且被递送到所选靶细胞。在一些实施例中，转基因是与载体序列异源的核酸序列，所述核酸序列编码多肽、蛋白质、功能性rna分子(例如，mirna、mirna抑制剂)或其它感兴趣的基因产物(例如，αlnndδg2')。核酸编码序列以允许转基因在靶组织的细胞中转录、翻译和/或表达的方式与调节组分可操作地连接。载体的aav序列可以包括顺式作用的5'和3'末端反向重复序列(参见例如，b.j.carter,在《细小病毒手册(handbookofparvoviruses)》中,编辑,p.tijsser,crc出版社(crcpress),第155-168页(1990))。itr序列的长度通常为约145bp。优选地，基本上对itr进行编码的整个序列用于分子中，但是对这些序列进行一定程度的微小修饰是可允许的。(参见例如，如sambrook等人,《分子克隆，实验室手册》,第2版,冷泉港实验室,纽约(1989)；以及k.fisher等人,《病毒学杂志》,70:520532(1996))的文本。此类分子的实例是含有转基因的“顺式作用”质粒，其中所选转基因序列和相关调节元件的侧接是5'和3'aavitr序列。aavitr序列可以从任何已知的aav获得，包含目前所鉴定的哺乳动物aav类型。除了上文鉴定的用于重组aav载体的元件之外，载体还可以包含常规控制元件，所述常规控制元件以允许其在用质粒载体转染或用本发明产生的病毒感染的细胞中转录、翻译和/或表达的方式与转基因可操作地连接。如本文所使用的，“可操作地连接的”序列包含与感兴趣的基因邻接的表达控制序列和以反式或在远处起作用以控制感兴趣的基因的表达控制序列。表达控制序列包含适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的rna加工信号，如剪接和聚腺苷酸化(polya)信号；使细胞质mrna稳定的序列；增强翻译效率的序列(即，kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；以及当需要时，增强所编码产物的分泌的序列。大量表达控制序列(包含天然的、组成型、诱导型和/或组织特异性启动子)是本领域已知的并且可以被利用。如本文所使用的，当核酸序列(例如，编码序列)和调节序列以将核酸序列的表达或转录放置于调节序列的影响或控制下的方式共价连接时，所述核酸序列和调节序列被认为是可操作地连接。如果期望将核酸序列翻译成功能性蛋白质，如果在5'调节序列中启动子的诱导导致编码序列的转录并且如果在两个dna序列之间的连接的性质不会(1)导致移码突变的引入；(2)干扰启动子区指导编码序列的转录的能力，或(3)干扰对应的rna转录物被翻译成蛋白质的能力，则这两个dna序列被认为是可操作地连接的。因此，如果启动子区能够影响所述dna序列的转录，使得所得转录物可以翻译成期望的蛋白质或多肽，则所述启动子区将与核酸序列可操作地连接。类似地，当两个或更多个编码区连接方式使得其从共同启动子的转录导致两个或更多个蛋白质的表达已经使用相同读框翻译时，所述两个或更多个编码区是可操作地连接的。在一些实施例中，可操作地连接的编码序列产生融合蛋白。在一些实施例中，可操作地连接的编码序列产生功能性rna(例如，shrna、mirna)。对于对蛋白质进行编码的核酸，通常在转基因序列之后并且在3'aavitr序列之前插入聚腺苷酸化序列。可用于本发明的raav构建体还可以含有令人希望地定位在启动子/增强子序列与转基因之间的内含子。一种可能的内含子序列源自sv-40，并且被称为sv-40t内含子序列。可以使用的另一个载体元件是内部核糖体进入位点(ires)。ires序列用于从单个基因转录物产生多于一个多肽。ires序列将用于产生含有多于一个多肽链的蛋白质。这些和其它常见载体元件的选择是常规的，并且许多此类序列是可获得的(参见例如，sambrook等人以及其中引用的参考文献，例如第3.183.26和16.1716.27页和ausubel等人,《当前分子生物学实验指南(currentprotocolsinmolecularbiology)》,约翰·威立父子出版公司(johnwiley&sons),纽约,1989)。在一些情况下，口蹄疫病毒2a序列可以包含在多蛋白中；这是已经显示出介导多蛋白裂解的小肽(长度大约为18个氨基酸)(ryan,md等人,《欧洲分子生物学组织(embo)》,1994；4:928-933；mattion,nm等人,《病毒学杂志》,1996年11月；第8124-8127页；furler,s等人,《基因疗法(genetherapy)》,2001；8:864-873；以及halpin,c等人,《植物学杂志(theplantjournal)》,1999；4:453-459)。先前已经在包含质粒和基因疗法载体(aav和逆转录病毒)的人工系统中证明了2a序列的裂解活性(ryan,md等人,《欧洲分子生物学组织》,1994；4:928-933；mattion,nm等人,《病毒学杂志》,1996年11月；第8124-8127页；furler,s等人,《基因疗法》,2001；8:864-873；以及halpin,c等人,《植物学杂志(theplantjournal)》,1999；4:453-459；defelipe,p等人,《基因疗法》,1999；6:198-208；defelipe,p等人,《人类基因疗法(humangenetherapy)》,2000；11:1921-1931；以及klump,h等人,《基因疗法》,2001；8:811-817)。宿主细胞中基因表达所需的调节序列的精确性质可能在物种、组织或细胞类型之间有所不同，但如有必要，通常应包含分别涉及转录和翻译的起始的5'非转录序列和5'非翻译序列，如tata盒、加帽序列、caat序列、增强子元件等。特别地，此类5'非转录调节序列将包含启动子区，所述启动子区包含用于可操作地连接的基因的转录控制的启动子序列。调节序列还可以根据需要包含增强子序列或上游激活子序列。载体可以任选地包含5'前导序列或信号序列。组成型启动子的实例包含但不限于逆转录病毒劳斯氏肉瘤病毒(rsv)ltr启动子(任选地具有rsv增强子)、巨细胞病毒(cmv)启动子(任选地具有cmv增强子)(参见例如boshart等人,《细胞(cell)》,41:521-530(1985))、sv40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、13-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(pgk)启动子和efla启动子(英杰公司(invitrogen))。诱导型启动子允许调节基因表达并且可以通过外源供应的化合物、环境因素如温度或特异性生理状态例如急性期、细胞的特定分化状态、或仅在复制细胞时的存在来调节。诱导型启动子和诱导型系统可从多种商业来源获得，包含但不限于英杰公司、克罗泰克公司(clontech)和阿瑞雅德公司(ariad)。通过外源供应的启动子调节的诱导型启动子的实例包含锌诱导型绵羊金属硫蛋白(mt)启动子、地塞米松(dex)诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)启动子、t7聚合酶启动子系统(wo98/10088)；蜕皮激素昆虫启动子(no等人,《美国国家科学院院刊》,93:3346-3351(1996))、四环素可抑制系统(gossen等人,《美国国家科学院院刊》,89:5547-5551(1992))、四环素诱导型系统(gossen等人,《科学(science)》,268:1766-1769(1995)，还参见harvey等人,《化学生物当前观点(curr.opin.chem.biol.)》,2:512-518(1998))、ru486诱导型系统(wang等人,《自然生物技术(nat.biotech.)》,15:239-243(1997)和wang等人,《基因疗法》,4:432-441(1997))以及雷帕霉素诱导型系统(magari等人,《临床研究杂志)100:2865-2872(1997))。在此上下文中可能有用的仍其它类型的诱导型启动子是受特定生理状态例如温度、急性期、细胞的特定分化状态、或仅在复制细胞时调节的那些启动子。在另一个实施例中，将使用转基因的天然启动子或其片段。当期望转基因的表达应模仿天然表达时，天然启动子可能是优选的。当转基因的表达必须在时间上或发育上、或以组织特异性方式、或响应于特异性转录刺激调节时，可以使用天然启动子。在另外的实施例中，还可以使用其它天然表达控制元件，如增强子元件、聚腺苷酸化位点或kozak共有序列来模仿天然表达。在一些实施例中，调节序列赋予组织特异性基因表达能力。在某些情况下，组织特异性调节序列与以组织特异性方式诱导转录的组织特异性转录因子结合。此类组织特异性调节序列(例如，启动子、增强子等)是本领域众所周知的。示例性组织特异性调节序列包含但不限于以下组织特异性启动子：神经元如神经元特异性烯醇化酶(nse)启动子(andersen等人,《细胞分子神经生物学(cellmol.neurobiol.)》,13:503-15(1993))，神经丝轻链基因启动子(piccioli等人,《美国国家科学院院刊》,idsa,88:5611-5(1991))和神经元特异性vgf基因启动子(piccioli等人,《神经元(neuron)》,15:373-84(1995))。在一些实施例中，组织特异性启动子是选自以下的基因的启动子：神经元核(neun)、胶质原纤维酸性蛋白(gfap)、结肠腺瘤样息肉病(apc)和电离钙结合衔接子分子1(iba-1)。在一些实施例中，启动子是cmv启动子。转基因编码序列raav载体的转基因序列的组合物将取决于将投入的所得载体的用途。例如，一种类型的转基因序列包含报道序列，所述报道序列在表达时产生可检测的信号。在另一个实例中，所述转基因编码治疗性αlnndδg2'蛋白或治疗性功能性rna。在另一个实例中，所述转基因编码旨在用于研究目的的蛋白质或功能性rna，例如用于创建包含转基因的体细胞转基因动物模型，例如用于研究转基因产物的功能。在另一个实例中，所述转基因编码旨在用于创建疾病的动物模型的蛋白质或功能性rna。适当的转基因编码序列对于技术人员将是显而易见的。在一些方面，本发明提供了用于预防或治疗哺乳动物中的lama2基因缺陷(例如，可遗传基因缺陷、体细胞基因改变)的方法中的raav载体，例如在受试者中导致层粘连蛋白α-2多肽缺陷的基因缺陷，并且特别是用于治疗或降低表现出层粘连蛋白α-2缺陷的受试者的缺陷的严重程度或程度。在一些实施例中，方法涉及以足以治疗患有或怀疑患有lama2病症的受试者的此类病症的量和持续时间段向受试者施用药学上可接受的载剂中的编码一种或多种治疗性肽、多肽、shrna、微小rna、反义核苷酸等的raav载体。重组aav施用以足够的量施用raavs以转染期望的组织的细胞并提供足够水平的基因转移和表达，而没有过度的不利影响。常规的和药学上可接受的施用途径包含但不限于直接递送到所选组织(例如，脑内施用、鞘内施用)、静脉内、口服、吸入(包含鼻内和气管内递送)、眼内、静脉内、肌内、皮下、皮内、瘤内和其它亲本施用途径。如果需要，可以组合施用途径。向受试者递送某些raav可以例如通过向受试者的血流中施用来进行。可以通过注射到静脉、动脉或任何其它血管导管来施用到血液中。此外，在某些情况下，可能期望的是向脑组织、脑膜、神经元细胞、神经胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、脑脊髓液(csf)、间隙空间等递送raav。在一些实施例中，重组aav可以使用本领域已知的神经外科技术，如通过立体定向注射用针、导管或相关装置向脊髓或脑直接递送(参见例如stein等人,《病毒学杂志》,73:3424-3429,1999；davidson等人,《美国国家科学院院刊(pnas)》97:3428-3432,2000；davidson等人,《自然遗传学(nat.genet.)》3:219-223,1993；以及alisky和davidson,《人类基因疗法》11:2315-2329,2000)。在某些情况下，将期望的是皮下地、胰腺内地、鼻内地、肠胃外地、静脉内地、肌内地、脑内地、鞘内地、脑内地、口服地、腹膜内地或通过吸入递送本文中所公开的适合地调配的药物组合物中的基于raav的治疗性构建体。在一些实施例中，如美国专利第5,543,158号；第5,641,515号和第5,399,363号中所描述的施用模式(所述美国专利各自通过引用整体明确地并入本文)可以用于递送raav。重组aav组合物raav可以根据本领域已知的任何适当的方法在组合物中向受试者递送。可以向受试者，例如人、小鼠、大鼠、猫、狗、绵羊、兔、马、牛、山羊、猪、豚鼠、仓鼠、鸡、火鸡或非人灵长类动物(例如，猕猴)施用优选地悬浮在生理上相容的载剂(例如，在组合物中)的raav。在某些实施例中，组合物可以仅包括raav，或与一种或多种其它病毒(例如，编码具有一种或多种不同转基因的第二raav)组合。鉴于raav针对的适应症(indication)，本领域的技术人员可以容易地选择适合的载剂。例如，一种适合的载剂包含盐水，其可以与多种缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水)一起调配。其它示例性载剂包含无菌盐水、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、葡聚糖、琼脂、果胶、花生油、芝麻油和水。载剂的选择不是对本发明的限制。任选地，除了raav和一种或多种载剂之外，本发明的组合物还可以含有其它常规药物成分，如防腐剂或化学稳定剂。适合的示例性防腐剂包含氯丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯、乙基香草醛、甘油、苯酚以及对氯苯酚。适合的化学稳定剂包含明胶和白蛋白。实现期望效果或“治疗效果”所需的raav病毒粒子的剂量(例如，在载体基因组中的剂量单位/每千克体重(vg/kg))将基于若干因素而变化，包含但不限于：raav施用的途径、实现治疗效果所需的基因或rna表达水平、所治疗的特异性疾病或病症以及基因或rna产物的稳定性。基于上述因素以及本领域众所周知的其它因素，本领域的技术人员可以容易地确定用于治疗患有特定疾病或病症的受试者的raav病毒粒子剂量范围。raav的有效量通常处于含有约109到1016基因组拷贝每受试者的溶液的约10μl到约100ml的范围内。可以使用其它体积的溶液。除了别的之外，所使用的体积将通常取决于受试者的大小、raav的剂量和施用的途径。例如，对于鞘内或脑内施用，可以使用1μl到10μl或10μl到100μl的范围内的体积。对于静脉内施用，可以使用10μl到100μl、100μl到1ml、1ml到10ml或更大的范围内的体积。在一些情况下，约1010到1012个raav基因组拷贝每受试者之间的剂量是适当的。在某些实施例中，1012个raav基因组拷贝每受试者对于靶向cns组织是有效的。在一些实施例中，所述raav以1010、1011、1012、1013、1014或1015基因组拷贝每受试者的剂量施用。在一些实施例中，所述raav以每千克1010、1011、1012、1013或1014基因组拷贝的剂量施用。在一些实施例中，调配raav组合物以减少aav颗粒在组合物中的聚集，特别是在存在高raav浓度(例如，约1013gc/ml或更高)的情况下。用于减少raav的聚集的方法是本领域众所周知的，并且包含例如添加表面活性剂、pii调节、盐浓度调节等。(参见例如wrightfr等人,《分子疗法(moleculartherapy)》(2005)12,171-178，所述文献的内容通过引用并入本文。)药学上可接受的赋形剂和载剂溶液的调配物是本领域的技术人员众所周知的，同样是用于在多种治疗方案中使用本文所述的特定组合物的适合的给药和治疗方案的开发。通常，这些调配物可以含有至少约0.1％的活性成分或更多，但是一种或多种活性成分的百分比当然可以变化并且可以方便地介于总调配物的重量或体积的约1％或2％与约70％或80％或更多之间。自然地，每种治疗上有用的组合物中的活性成分的量可以是以这样的方式来制备，所述方式使得在化合物的任何给定的单位剂量中将获得适合的剂量。制备此类药物调配物的本领域的技术人员将考虑如溶解度、生物利用度、生物半衰期、施用途径、产品保质期以及其它药理学因素等因素，并且如此，多种剂量和治疗方案可能是期望的。适用于可注射使用的药物形式包含无菌水溶液或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。还可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物中以及在油中制备分散体。在普通储存和使用条件下，这些制剂含有防止微生物生长的防腐剂。在许多情况下，所述形式是无菌的并且具有达到易于注射的程度的流动性。其在制造和储存条件下必须是稳定的并且必须被保存免于如细菌和真菌等微生物的污染作用。载剂可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其适合的混合物和/或植物油的溶剂或分散介质。合适的流动性可以例如通过使用如卵磷脂等包衣、在分散体的情况下通过维持所需的粒径并且通过使用表面活性剂来维持。对微生物的作用的预防可以通过多种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来提供。在许多情况下，将优选的是包含等渗剂，例如，糖或氯化钠。对可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中使用延迟吸收的药剂，例如单硬脂酸铝和明胶来提供。对于可注射水溶液的施用，例如，如果需要，所述溶液可以被适合地缓冲，并且液体稀释剂首先用足够的盐水或葡萄糖等渗。这些特定的水溶液特别适合于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。在此方面，本领域的技术人员将知道可以采用的无菌水性介质。例如，可以将一个剂量溶解于1ml等渗nacl溶液中，并且添加到1000ml皮下输液液体中或注射在建议的输注部位处(参见例如《雷明顿药物科学(remington'spharmaceuticalsciences)》,第15版,第1035-1038页和第1570-1580页)。剂量的一些变化必然会根据宿主的病症而发生。在任何情况下，负责施用的人员将确定用于个体宿主的适当剂量。通过将活性raav以所需的量根据需要与本文枚举的各种其它成分一起并入适当的溶剂中，然后进行过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，通过将各种灭菌的活性成分并入无菌媒剂中来制备分散体，所述无菌媒剂含有基础分散介质和来自上文枚举的那些的所需其它成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，所述技术从其先前的无菌过滤溶液中产生活性成分加上任何另外的期望成分的粉末。本文公开的raav组合物还可以以中性或盐形式调配。药学上可接受的盐包含酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)，并且其与例如盐酸或磷酸等无机酸或如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等有机酸形成。与游离羧基形成的盐还可以源自如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁等无机碱和如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因(procaine)等有机碱。在调配后，溶液将以与剂量调配物相容的方式并以治疗上有效的量施用。调配物容易地以多种剂型施用，如可注射溶液、药物释放胶囊等。如本文所使用的，“载剂”包含任何和所有溶剂、分散介质、媒剂、涂层、稀释剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、载剂溶液、悬浮液、胶体等。将这种培养基和药剂用于药物活性物质在本领域中是众所周知的。还可以将补充性活性成分并入到组合物中。短语“药学上可接受的”是指当向宿主施用时不产生过敏或类似不良反应的分子实体和组合物。递送媒剂，如脂质体、纳米胶囊、微粒、微球、脂质颗粒、囊泡等可以用于将本发明的组合物引入到适合的宿主细胞中。具体地，raav载体递送的转基因可以被调配成用于递送或包封在脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球或纳米颗粒等中。此类调配物对于引入本文公开的核酸或raav构建体的药学上可接受的调配物可能是优选的。脂质体的形成和使用通常是本领域的技术人员已知的。最近，开发具有改进的血清稳定性和循环半衰期的脂质体(美国专利第5,741,516号)。进一步地，已经描述了脂质体和脂质体样制剂作为潜在的药物载剂的各种方法(美国专利第5,567,434号；第5,552,157号；第5,565,213号；第5,738,868号和第5,795,587号)。脂质体已经成功地与通常对通过其它程序的转染具有抗性的许多细胞类型一起使用。另外，脂质体没有典型的基于病毒的递送系统的dna长度限制。已经将脂质体有效地用于将基因、药物、放射治疗剂、病毒、转录因子和变构效应子引入到各种培养的细胞系和动物中。另外，已经完成了检查脂质体介导的药物递送的有效性的若干成功的临床试验。脂质体由分散在水性介质中的磷脂形成并且自发地形成多层同心双层囊泡(也称为多层囊泡(mlv))。mlv的直径通常为25nm到4μm。mlv的超声处理导致形成直径在200到范围内的小单层囊泡(suv)，从而在核心中含有水溶液。可替代地，可以使用raav的纳米胶囊调配物。纳米胶囊通常可以以稳定且可再现的方式截留物质。为了避免由于胞内聚合物超载引起的副作用，应使用能够在体内降解的聚合物来设计此类超细颗粒(尺寸约为0.1μm)。考虑使用满足这些要求的可生物降解的聚烷基-氰基丙烯酸酯纳米颗粒。除了上述递送方法之外，还考虑以下技术作为向宿主递送raav组合物的替代性方法。超声促渗(即，超声)已经在美国专利第5,656,016号中使用并且描述为用于增强药物渗透进入和通过循环系统的速率和功效的装置。考虑的其它药物递送替代方案是骨内注射(美国专利第5,779,708号)、微芯片装置(美国专利第5,797,898号)、眼科调配物(bourlais等人,1998)、经皮基质(美国专利第5,770,219号和第5,783,208号)和反馈控制递送(美国专利第5,697,899号)。涉及raav组合物的递送的一般方法本发明提供了包括raav病毒粒子的稳定的药物组合物。即使在经受冷冻/解冻循环时并且当储存在由包含玻璃的各种材料制成的容器中时，组合物仍保持稳定和活性。含有感兴趣的异源核苷酸序列的重组aav病毒粒子可以用于基因递送，如在基因疗法应用中、用于产生转基因动物、在核酸疫苗接种中、核酶和反义疗法以及用于向各种细胞类型体外递送基因。通常，使用体内或体外转导技术将raav病毒粒子引入到受试者的细胞中。如果体外转导，则将从受试者中取出期望的受体细胞，用raav病毒粒子转导并重新引入到受试者体内中。可替代地，可以使用同基因细胞或异基因细胞，其中那些细胞将不会在受试者中产生不适当的免疫应答。已经描述了用于将经过转导的细胞递送和引入到受试者中的适合方法。例如，可以通过将重组aav病毒粒子与细胞(例如，在适当的培养基中)组合并使用常规技术(如southern印迹和/或pcr)或通过使用可选标志物筛选包含感兴趣的dna的那些细胞来在体外转导细胞。如下文更全面描述的，然后可以将经过转导的细胞调配成药物组合物，并且通过各种途径将组合物引入到受试者中，如通过肌内、静脉内、动脉内、皮下和腹膜内注射或通过使用例如导管注射到平滑肌中或直接注射到器官中。对于体内递送，将raav病毒粒子调配成药物组合物，并且通常将通过肠胃外施用，例如通过肌内直接注射到骨骼肌、关节内、静脉内或直接注射到器官中。适当的剂量将取决于待治疗的受试者(例如，人或非人灵长类动物或其它哺乳动物)、待治疗的受试者的年龄和一般状况、待治疗的病症的严重程度、raav病毒粒子的施用模式以及其它因素。适当的有效量可以由本领域的技术人员容易地确定。因此，“治疗有效量”将落在可以通过临床试验确定的相对较宽的范围内。例如，对于体内注射，即直接向受试者注射，治疗有效剂量将为约105到1016个raav病毒粒子，更优选地108到1014个raav病毒粒子。对于体外转导，向细胞待递送的raav病毒粒子的有效量将为105到1013个raav病毒粒子，优选地108到1013个raav病毒粒子。如果组合物包括待递送回到受试者的经过转导的细胞，则药物组合物中的经过转导的细胞的量将为约104到1010个细胞，更优选地105到108个细胞。当然，剂量取决于转导的效率、启动子强度、信息的稳定性和由其编码的蛋白质等。本领域的普通技术人员可以通过建立剂量反应曲线的常规试验容易地确定有效剂量。剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案，以最终递送上文指定的量。此外，受试者可以施用尽可能多的剂量。因此，可以例如以单一剂量将例如105到1016个raav病毒粒子给予受试者或以共同导致递送例如105到1016个raav病毒粒子的两个、四个、五个、六个或更多个剂量给予受试者。本领域的技术人员可以容易地确定待施用的剂量的适当数量。因此，药物组合物将包括足够的遗传物质以产生治疗有效量的感兴趣的蛋白质，即足以减少或改善所讨论的疾病状态的症状的量或足以赋予所期望的益处的量。因此，当以一个或多个剂量给予时，raav病毒粒子将以足以提供治疗效果的量存在于本发明组合物中。raav病毒粒子可以被提供为冻干的制剂，并在病毒粒子稳定组合物中稀释以供立即使用或将来使用。可替代地，raav病毒粒子可以在产生之后立即提供，并储存以供将来使用。药物组合物还将含有药学上可接受的赋形剂。此类赋形剂包含本身不诱导对接受组合物的个体有害的抗体的产生的任何药物制剂，并且所述任何药物制剂可以在没有过度毒性的情况下施用。药学上可接受的赋形剂包含但不限于液体，如水、盐水、甘油和乙醇。药学上可接受的盐可以包含在其中，例如无机酸盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；和有机酸的盐，如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。另外，此类媒剂中可以存在辅助物质，如润湿剂或乳化剂、ph缓冲物质等。对药学上可接受的赋形剂的详尽讨论可在《雷明顿药物科学》(新泽西州麦克出版公司(mackpub.co.),1991)中获得。如本文所使用的，“聚合酶链反应”或“pcr”是指程序或技术，其中特异性核酸序列、rna和/或dna如在例如美国专利第4,683,195号中所描述的进行扩增。通常，使用来自感兴趣的区域的末端或以外的序列信息来设计寡核苷酸引物。这些引物在序列上与待扩增的模板的相反链相同或类似。两个引物的5'末端核苷酸可以与经过扩增的材料的末端一致。pcr可以用于扩增特异性rna序列、来自总基因组dna的特异性dna序列以及从总细胞rna转录的cdna、噬菌体或质粒序列等。通常参见mullis等人,(1987)《冷泉港生物学季度讨论会(coldspringharborsymp.quant.biol.)》51:263；erlich编辑,(1989)《pcr技术(pcrtechnology)》(斯托克顿出版社(stocktonpress),纽约)。如本文所使用的，pcr被认为是用于扩增核酸测试样本的核酸聚合酶反应方法的一个但不是唯一的实例，所述方法包括使用已知的核酸作为引物和核酸聚合酶来扩增或产生核酸的特异性片段。核酸本发明还包括对本文所述的αlnndδg2'蛋白进行编码的某些构建体和核酸。包含在序列表中列出的包含seqidno:1和seqidno:24的所选序列的某些构建体和序列可以用于本发明的实施例中。优选地，核酸在低、中或高严格性条件下杂交，并且编码维持生物功能的αlnndδg2'蛋白。当第一核酸分子的单链形式可以在适当的温度和溶液离子强度条件下退火到第二核酸分子时，第一核酸分子与第二核酸分子是“可杂交”(参见sambrook等人,同上)。温度和离子强度的条件确定了杂交的“严格性”。典型的低严格性杂交条件包含55℃、5xssc、0.1％sds和无甲酰胺；或30％甲酰胺、5xssc、0.5％sds，在42℃下。典型的中等严格性杂交条件是40％甲酰胺，与5x或6xssc和0.1％sds，在42℃下。高严格性杂交条件是50％甲酰胺，5x或6xssc，在42℃下，或任选地在更高温度(例如，57℃、59℃、60℃、62℃、63℃、65℃或68℃)下。通常，ssc是0.15mnacl和0.015m柠檬酸钠。杂交要求两个核酸含有互补序列，但是取决于杂交的严格性，并且碱基之间的错配是可能的。用于杂交核酸的适当严格性取决于核酸的长度和互补的程度，本领域众所周知的变量。两个核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越高，核酸可以杂交的严格性越高。对于长度大于100个核苷酸的杂合体，已经得出用于计算熔解温度的方程(参见sambrook等人,同上,9.50-9.51)。为了与较短的核酸(例如,寡核苷酸)杂交，错配的位置变得更加重要，并且寡核苷酸的长度确定了其特异性(参见sambrook等人,同上,11.7-11.8)。αlnndδg2'小鼠多肽包括seqidno:21的氨基酸序列。αlnndδg2'人多肽包括seqidno:22的氨基酸序列，并且与小鼠多肽具有87％同一性，如图9所示。当通过blast算法进行比较时，关于恢复层粘连蛋白聚合功能，考虑到包括与本文提供的αlnndδg2'氨基酸序列(例如，seqidno:21-22)至少约90％相同并且最优选地至少约95％相同(例如,95％、96％、97％、98％、99％、100％)的氨基酸序列的αlnndδg2'多肽，其中选择所述算法的参数以在相应的参考序列的整个长度上在相应的序列之间给出最大匹配。当使用blast算法进行比较时，包括与任何参考αlnndδg2'氨基酸序列至少约90％相似并且最优选地至少约95％相似(例如，95％、96％、97％、98％、99％、100％)的氨基酸序列的多肽也包含在本发明的构建体和方法中，其中选择所述算法的参数以在相应的参考序列的整个长度上在相应的序列之间给出最大匹配。序列同一性是指当两个序列进行最佳比对时，两个多肽的氨基酸在等效位置处相同的程度。序列相似性包含相同的残基和不相同的、生物化学相关的氨基酸。上文讨论了共享相似性质并且可以是可互换的生物化学相关氨基酸。“同源性”是指当进行最佳比对时，两个多核苷酸序列之间或两个多肽序列之间的序列相似性。当所述两个比较序列中的一个位置被同一碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如如果两个dna分子中的每个分子中的一个位置被腺嘌呤占据，则所述分子在那个位置处是同源的。同源性的百分比是由两个序列共享的同源位置的数量除以所比较的位置的总数量×100。例如，如果当两个序列进行最佳比对时，所述两个序列中的10个位置中的6个位置是匹配的或同源的，则这两个序列是60％同源的。通常，当两个序列被比对以给出最大百分比同源性时进行比较。以下参考文献涉及通常用于序列分析的blast算法：blast算法：altschul,s.f.等人,(1990)《分子生物学杂志(j.mol.biol.)》215:403-410；gish,w.等人,(1993)《自然遗传学》3:266-272；madden,t.l.等人,(1996)《酶学方法(meth.enzymol.)》266:131-141；altschul,s.f.等人,(1997)《核酸研究(nucleicacidsres.)》25:3389-3402；zhang,j.等人,(1997)《基因组研究(genomeres.)》7:649-656；wootton,j.c.等人,(1993)《计算化学(comput.chem.)》17:149-163；hancock,j.m.等人,(1994)《计算机应用生物科学(comput.appl.biosci.)》10:67-70；比对评分系统：dayhoff,m.o.等人,《蛋白质序列和结构图谱学(atlasofproteinsequenceandstructure)》中的“蛋白质中演化变化的模型(amodelofevolutionarychangeinproteins.)”(1978)第5卷,第3增刊。m.o.dayhoff(编辑),第345-352页,《美国国家生物医学研究基金会(natl.biomed.res.found.)》,华盛顿特区；schwartz,r.m.等人,《蛋白质序列和结构图谱学》中的“用于检测距离关系的基质(matricesfordetectingdistantrelationships.)”(1978)第5卷,第3增刊”。m.o.dayhoff(编辑),第353-358页,《美国国家生物医学研究基金会》,华盛顿特区；altschul,s.f.(1991)《分子生物学杂志》219:555-565；states,d.j.等人,(1991)《方法(methods)》3:66-70；henikoff,s.等人,(1992)《美国国家科学院院刊》89:10915-10919；altschul,s.f.等人,(1993)《分子进化杂志(j.mol.evol.)》36:290-300；比对统计：karlin,s.等人,(1990)《美国国家科学院院刊》87:2264-2268；karlin,s.等人,(1993)《美国国家科学院院刊》90:5873-5877；dembo,a.等人,(1994)《概率年报(ann.prob.)》22:2022-2039；以及altschul,s.f.《基因组研究中的理论和计算方法(theoreticalandcomputationalmethodsingenomeresearch)》中的“评估多个不同的局部比对的统计显著性(evaluatingthestatisticalsignificanceofmultipledistinctlocalalignments)”(s.suhai编辑),(1997),第1-14页,普莱南出版公司(plenum),纽约。本发明还提供了包括各种核酸的表达载体，其中当用载体转染宿主细胞时，核酸与由宿主细胞识别的控制序列可操作地连接。还提供了包括重组aav-dj和某些aav-2序列的病毒粒子，以及用于在cmv启动子和cmv增强子的指导下表达αlnndδg2'的核酸序列。可以使用替代性启动子，条件是所述替代性启动子的大小是小的并且具有高活性和良好表达。在这些构建体中，raav2序列与5'和3'itr序列相对应，例如seqidno:11和16以及序列表中所述的其它序列。在本发明中，将这些序列与aav-dj衣壳一起包装以形成对层粘连蛋白α-2缺陷是治疗性的病毒粒子。药物组合物和施用为了制备本发明的组合物的药物组合物或无菌组合物，可以将aav-dj载体或相关组合物与药学上可接受的载剂或赋形剂混合。参见例如《雷明顿药物科学》和《美国药典国家处方集(u.s.pharmacopeia:nationalformulary)》,麦克出版公司,伊斯顿,宾夕法尼亚州(1984)。治疗剂和诊断剂的调配物可以通过与呈例如冻干粉末、浆料、水溶液或悬浮剂的形式的可接受载剂、赋形剂或稳定剂混合来制备(参见例如，hardman等人,(2001)goodman和gilman的《治疗学的药理学基础(thepharmacologicalbasisoftherapeutics)》,麦格劳-希尔出版公司(mcgraw-hill),纽约市,纽约州；gennaro(2000)《雷明顿：药物科学与实践(remington:thescienceandpracticeofpharmacy)》,利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(lippincott,williams,andwilkins),纽约市,纽约州；avis等人(编辑)(1993)《药物剂型：肠胃外药物(pharmaceuticaldosageforms:parenteralmedications)》,马塞尔德克尔公司(marceldekker),纽约；lieberman等人(编辑)(1990)《药物剂型：片剂(pharmaceuticaldosageforms:tablets)》,马塞尔德克尔公司,纽约；lieberman等人(编辑)(1990)《药物剂型：分散系统(pharmaceuticaldosageforms:dispersesystems)》,马塞尔德克尔公司,纽约；weiner和kotkoskie(2000),《赋形剂毒性和安全性(excipienttoxicityandsafety)》,马塞尔德克尔公司,纽约市,纽约州)。单独施用或与另一种药剂组合施用的治疗组合物的毒性和治疗功效可以通过在细胞培养物或实验动物中的标准药学程序来确定，例如用于确定ld50(使50％的群体致死的剂量)和ed50(对50％的群体具有治疗有效性的剂量)。毒性与治疗效果之间的剂量比是治疗指数(ld50/ed50)。在特定方面，表现出高治疗指数的治疗组合物是令人期望的。从这些细胞培养测定和动物研究获得的数据可以用于调配用于在人类中使用的剂量范围。此类化合物的剂量优选地处于包含ed50的具有很小毒性或没有毒性的循环浓度范围内。剂量可以根据所采用的剂型和施用途径而在这个范围内变化。在本发明的实施例中，根据医师案头参考(physicians'deskreference)2003(汤姆森医疗保健(thomsonhealthcare)；第57版(2002年11月1日))向受试者施用本发明的组合物。施用模式可以变化。适合的施用途径包含口服、直肠、经粘膜、肠、肠胃外；肌内、皮下、皮内、髓内、鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内、眼内、吸入、吹入、局部、皮肤、经皮或动脉内。在特定实施例中，可以通过侵入性途径，如通过注射(参见上文)施用组合物或治疗剂。在本发明的另外的实施例中，静脉内、皮下、肌内、动脉内、关节内(例如，在关节炎关节中)、瘤内或通过吸入、气雾剂递送施用所述组合物、其治疗剂或药物组合物。通过非侵入性途径(例如，口服地；例如，以丸剂、胶囊或片剂的形式)的施用也处于本发明的范围内。组合物可以用本领域已知的医疗装置施用。例如，可以通过用包含例如预填充注射器或自动注射器的皮下注射针注射来施用本发明的药物组合物。本发明的药物组合物还可以用无针皮下注射装置施用；如美国专利第6,620,135号；第6,096,002号；第5,399,163号；第5,383,851号；第5,312,335号；第5,064,413号；第4,941,880号；第4,790,824号或第4,596,556号中公开的装置。可替代地，可以以局部而非全身性方式施用aav-dj载体或相关化合物，例如通过通常以长效调配物或持续释放调配物的形式直接注射到所期望的靶位点。此外，可以在靶向药物递送系统中，例如在用靶向例如脑的组织特异性抗体包被的脂质体中施用组合物。脂质体靶向于所期望的组织并被其选择性地摄取。施用方案取决于若干因素，包含治疗组合物的血清或组织周转率、症状水平以及生物基质中的靶细胞的可及性。优选地，施用方案递送足够的治疗组合物以实现靶疾病状态的改善，而同时使不期望的副作用最小化。因此，所递送的生物剂的量部分取决于特定治疗组合物和所治疗病症的严重性。对适当剂量的确定是由临床医生例如使用本领域已知或怀疑影响治疗的参数或因素进行的。通常，剂量开始的量略微小于最佳剂量并且其随后以小增量增加，直到相对于任何负性副作用达到期望的或最佳效应。重要的诊断措施包含例如所产生的炎症或炎性细胞因子水平的症状中的那些症状。通常，令人期望的是将使用的生物剂源自与靶向治疗的动物相同的物种，从而使对所述试剂的任何免疫应答最小化。如本文所使用的，“抑制”或“治疗”或“治疗”包含延缓与病症相关的症状的发展和/或降低此类病症的症状的严重程度。所述术语进一步包含改善现有的不受控制或不想要的症状、预防另外的症状以及改善或预防此类症状的潜在原因。因此，所述术语表示已经向患有病症、疾病或症状或具有可能发展成这种病症、疾病或症状的脊椎动物受试者赋予了有益结果。如本文所使用的，术语“治疗有效量”、“治疗有效剂量”和“有效量”是指当向细胞、组织或受试者单独施用或与另外的治疗剂组合施用时，有效地引起疾病或病状的一种或多种症状或此类疾病或病状的进展的重大改善的本发明的基于raav-dj-αlnndδg2'的化合物的量。治疗有效剂量进一步是指足以导致症状的至少部分改善(例如，相关医学病状的治疗、治愈、预防或改善或此类病状的治疗、治愈、预防或改善的速率的增加)的化合物的量。当应用于单独施用的个体活性成分时，治疗有效剂量单独是指所述个体活性成分。当应用于组合时，治疗有效剂量是指导致治疗效果的活性成分的组合量，无论是以组合方式连续施用还是同时施用。有效量的治疗剂将导致诊断措施或参数提高至少10％；通常至少20％；优选地至少约30％；更优选地至少约40％，并且最优选地至少约50％。在使用主观量度来评估疾病严重程度的情况下，有效量也可以导致主观量度的改善。试剂盒本发明还提供了试剂盒，所述试剂盒包括试剂盒形式的本发明的组合的组分。本发明的试剂盒包含一种或多种组分，包含但不限于如本文所讨论的基于raav-dj-αlnndδg2'的化合物与一种或多种另外的组分，包含但不限于如本文所讨论的药学上可接受的载剂和/或化学治疗剂的联合。基于raav-dj-αlnndδg2'的化合物或组合物和/或治疗剂可以在药物组合物中调配成纯组合物或与药学上可接受的载剂组合。在一个实施例中，试剂盒包含在一个容器(例如，在无菌玻璃或塑料小瓶中)中的本发明的基于raav-dj-αlnndδg2'的化合物/组合物或其药物组合物，以及在另一容器(例如，在无菌玻璃或塑料小瓶中)中的其药物组合物和/或化学治疗剂。在本发明的另一个实施例中，所述试剂盒包括本发明的组合，包含任选地在药物组合物中在单个共同容器中一起调配的基于raav-dj-αlnndδg2'的化合物连同药学上可接受的载剂，任选地与一种或多种化学治疗剂组分组合。如果试剂盒包含用于向受试者进行肠胃外施用的药物组合物，则所述试剂盒可以包含用于进行此类施用的装置。例如，试剂盒可以包含一个或多个皮下注射针或如上文所讨论的其它注射装置。试剂盒可以包含包装插入物(packageinsert)，所述包装插入物包含关于试剂盒中的药物组合物和剂型的信息。通常，此类信息帮助患者和医师有效地且安全地使用包封的药物组合物和剂型。例如，可以在插入物中提供关于本发明的组合的以下信息：药代动力学、药效学、临床研究、功效参数、适应症和用法、禁忌症、警告、注意事项、不良反应、过剂量、合适的剂量和施用、如何供应、合适的储存条件、参考资料、制造商/经销商信息和专利信息。一般方法在以下文献中描述了分子生物学的标准方法：sambrook、fritsch和maniatis(1982和1989,第2版,2001,第3版)《分子克隆，实验室手册》,冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约)；sambrook和russell(2001)《分子克隆(molecularcloning)》,第3版,冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约；wu(1993)《重组dna(recombinantdna)》,第217卷,学术出版社(academicpress),圣地亚哥,加利福尼亚州)。标准方法还出现在以下文献中：ausbel等人(2001)《当前分子生物学实验指南》第1-4卷,约翰·威利父子出版公司,纽约市,纽约州，所述文献描述了细菌细胞和dna诱变中的克隆(第1卷)、哺乳动物细胞和酵母中的克隆(第2卷)、糖缀合物和蛋白质表达(第3卷)以及生物信息学(第4卷)。描述了用于蛋白质纯化的方法，包含免疫沉淀、色谱、电泳、离心和结晶(coligan等人,(2000)《当代蛋白质科学实验指南(currentprotocolsinproteinscience)》,第1卷,约翰·威利父子出版公司,纽约)。描述了化学分析、化学修饰、翻译后修饰、融合蛋白的产生、蛋白质的糖基化(参见例如coligan等人(2000)《当代蛋白质科学实验指南》第2卷,约翰·威利父子出版公司,纽约；ausubel等人,(2001)《当代分子生物学实验指南》,第3卷,约翰·威利父子出版公司,纽约市,纽约州,第16.0.5-16.22.17页；西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich,co.)(2001)《生命科学研究产物(productsforlifescienceresearch)》,圣路易斯,密苏里州；第45-89页；安玛西亚法玛西亚生物技术公司(amershampharmaciabiotech)(2001)《生物目录(biodirectory)》,皮斯卡塔韦,新泽西州,第384-391页。描述了多克隆和单克隆抗体的产生、纯化和片段化(coligan等人,(2001)《当代免疫学实验指南(currentprotcolsinimmunology)》,第1卷,约翰·威利父子出版公司,纽约)；harlow和lane(1999)《使用抗体(usingantibodies)》,冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约；harlow和lane,同上)。用于表征配体/受体相互作用的标准技术是可获得的(参见例如coligan等人(2001)《当代免疫学实验指南》,第4卷,约翰·威利父子出版公司,纽约)。实例实例1alphalnnddeltag2short(αlnndδg2')构建体开发用重叠的pcr完成αlnndpcdna3.1zeo中的g2巢蛋白-1结构域的去除。在第一轮pcr中，1.2kb-5'(f1nog21f5'-ctgggtcactgtcaccctgg-3'(seqidno:2)和nog22r5'-atggattctgaagacagacaccagagacac-3'(seqidno:3))和1.8kb-3'(nog22f5'-ctggtgtctgtcttcagaatccatgctac-3'(seqidno:4)和f1nog21r5'-gaaggcacagtcgaggctgatcag-3'(seqidno:5))产物产生于αlnnd的g2巢蛋白-1结构域的任一侧上。将其与第二轮pcr(f1nog21fandf1nog21r)一起缝合到3kb产物中，然后将所述产物用2.4kb的ecori消化并连接到5.85kbecoriαlnndpcdna3.1zeo载体(产生8.25kbnog2αlnndpcdna3.1zeo质粒)。用重叠的pcr引物(bamshnog21f5'-cggcagcctgaatgaggatccatgcataga-3'(seqidno:6)和shnog22r5'-cacagtagttgatgggacagacacc-3'(seqidno:7))以及3'(shnog22f5'-gtctctggtgtctgtcccatcaacta-3'(seqidno:8)和sseshnog21r5'-gaggcacaaacatcccctgcagggtgggcc-3'(seqidno:9)执行nog2αlnnd的另外的2egf(270bp)缺失以分别产生160bp和357bp产物。在第二轮pcr之后，将485bpbamhi-sbfi消化的插入物连接到同样消化的nog2αlnndpcdna3.1zeo载体(7.5kb)中。为了去除短的nog2αlnnd开放阅读框(orf)上的n末端myc标签，将1.5kbbamhi插入物从f3-8mck-pa构建体移动到mcs-aav载体(4.6kb，细胞生物学实验室(cellbiolabs)，vpk-410-dj)，从而产生6.1kbaav-5'f1无标签-10质粒。用fsei和xhoi消化短的nog2αlnndpcdna3.1zeo质粒，以产生将其连接到类似消化的aav-5'f1无标签-10载体(4.9kb)中的2.8kb插入物。最终的载体大小为7.7kb，其中alphalnnddeltag2short(αlnndδg2')的orf为3009bp(seqidno:1)。实例2aav病毒的产生使用磷酸钙瞬时转染的常用方法，将αlnndδg2'-mcs质粒与aav-djp辅助p辅助质粒(分别是seqidno:1、17、20；图6-8)(加利福尼亚州圣地亚哥细胞实验室有限公司(cellbiolabs,inc.))以1:1:1的比率一起三重转染到粘附的hek293中。简而言之，根据制造商的说明书(密苏里州圣路易斯西格玛奥德里奇公司，目录号caphos)，将12.5ug每/150mm培养皿(每次制备10-150mm培养皿)添加到75％汇合的hek293细胞中过夜。96小时后，用aavpro纯化试剂盒(加利福尼亚州山景城美国塔卡拉生物公司(takarabiousa,inc.)，目录号6666)从培养物收获病毒。替代性纯化方法是可获得的，其包含细胞冷冻-解冻或triton-100裂解，然后进行peg8000和/或氯化铯离心。用实时pcr(aavpro滴定试剂盒，加利福尼亚州山景城美国塔卡拉生物公司，目录号6233)测定病毒滴度。实例3aav产生的αlnndδg2'蛋白的表达和分析用约6×10vg/6孔培养皿感染稳定转染的411hek293细胞。四天后，通过用a-flag琼脂糖珠在室温下免疫沉淀1小时，然后进行蛋白质印迹分析来评估条件培养基。将蛋白质印迹切割并用1μg/ml的抗-flag(上图)或抗g2-g2巢蛋白(下图)对其进行染色。结果示出在图5a中。可替代地，向高传代大鼠许旺细胞中添加条件化aav411hek293培养基持续1小时，并且使用1ug/ml鸡抗α4和1:100抗鸡alexafluor647通过免疫荧光对411层粘连蛋白组装进行分析(加利福尼亚州卡尔斯巴德生命技术公司(lifetechnologies)，目录号a-21449)。lm411组装的显著增加是由图5c和5d所示的aav产生的αlnndδg2'蛋白引起的。将aavαlnndδg2'(病毒，含1010vg的～25μl)或pbs缓冲液腹膜内注射到1周龄的dy3k/dy3kmag小鼠中。两周后，收获股四头肌，对其进行切片，并且用抗体染色以检测αlnndδg2'(红色)和层粘连蛋白(绿色)，如图5e所示。在股四头肌肌肉组织中检测到αlnndδg2'的∞1ln表位，这指示连接子被并入肌肉肌膜中。实例4使有症状的小鼠恢复层粘连蛋白α2在表达mag转基因的dy3k/dy3k小鼠中注射aav-dj-αlnndδg2'构建体，在表达αlnnd转基因的dy3k/dy3k小鼠中完成集聚蛋白图3b(seqidno:23)的微小型化版本以及aav-dj-αlnndδg2'构建体的注射，以结合稳定且已经表征的配对连接子蛋白的表达来评估一次一种病毒感染，并且分别地验证每种连接子蛋白，从而使可变性最小化。使用免疫荧光显微镜，用以下文献中所描述的特异性连接子和层粘连蛋白抗体，对肌肉进行初始分析以确定哪些肌肉在神经表达的程度之后填充有αlnndδg2'和mag，并且在注射后持续表达：mckee等人,(2017)《临床研究杂志》127(3):1075-1089；reinhard等人,(2017)《科学转化医学》9(396)。在评估初始分析后，将dy3k/dy3k小鼠与病毒制剂两者共感染。注射将在出生后第1天或第2天给予，考虑到髓鞘形成的围产期时间过程(在出生前通过基本上在出生后第一周发生的径向分选开始sc增殖)。待进行的表型和组织学分析包含：(1)测量存活率、体重、肌肉重量、垂直网格上的时间、握力和不同年龄的整体行为的测量结果；(2)隔膜、肋间肌和膈神经的检查；(3)通过h&e和天狼星红(siriusred)(胶原蛋白)染色的在不同年龄的前肢桡侧腕伸肌(extensorcarpiradialis)和隔膜/肋间肌的组织学的骨骼肌分析，其中对纤维大小、数量、再生(具有中央核的肌纤维的部分)、炎症和纤维化进行形态学定量；(4)通过检查免疫染色的神经和根来评估连接子-蛋白7表达的程度和检测层粘连蛋白亚基的相对变化的外周神经分析；使用电子显微镜检查亚甲蓝染色的半薄切片，以定量地评估轴突分选的程度、髓鞘形成、髓鞘脂厚度和裸轴突的部分；从edu/dapi比率确定sc增殖，并且使用qrt-pcr来评估髓鞘形成的成熟(例如，oct6、sox2、cjun)。分析的结果用于优化递送并评估可以进一步改善功能的αlnndδg2'和mag连接子蛋白的变体。实例5具有变体血清型衣壳的aav的αlnndδg2'的表达出于改变组织特异性的目的，例如仅骨骼肌加上心脏或主要是肝脏，将αlnndδg2'dna插入具有编码不同衣壳血清型或复合血清型的aav载体中。注意：αlnndδg2'是可溶的分泌蛋白，其中合成位点不需要是靶细胞类型。实例6被修饰以减少泛素化的aav衣壳序列与其它aav一样，aav-dj在衣壳上含有若干磷酸化位点和泛素化位点。发现在k137r、s503a和t251a处的rep/cap质粒上的点突变显著增加体外和体内蛋白质表达(如mao,wang,yan,li,wang和li中所描述的,2016,“腺相关病毒载体-dj衣壳中的单点突变导致体内基因递送的改善(singlepointmutationinadeno-associatedviralvectors–djcapsidleadstoimprovementforgenedeliveryinvivo)”《bmc生物技术(bmcbiotechnology)》16:1-8)。可以容易地修饰aav质粒以引入这种改善。实例7使用特异性启动子用aav表达αlnndδg2'将αlnndδg2'dna插入具有不同启动子/增强子的aav载体中，其作用是(a)改变特异性和/或(b)增加插入物的可允许的开放阅读框。用于驱动骨骼肌和心脏中微肌营养不良蛋白的表达的一个实例是已经从肌肉肌酸激酶基因基础启动子和上游增强子修饰的436bpck8e启动子/增强子。ck8e启动子/增强子描述于j.n.ramos等人,2019,《分子疗法》,27:623-635。实例8用替代性信号序列表达lmα1lnndδg2'已经使用bm-40信号序列在体外和小鼠中表达了蛋白质αlnndδg2'和相关蛋白，所述信号序列具有seqidno:25中的核苷酸序列并且已经在下表2中给出了字母代码a。替代方案是表达具有内源性α1亚基信号肽的蛋白质，所述亚基信号肽具有seqidno:27中的核苷酸序列并且已经在表2中给出了字母代码a'。表2提供了所有具有指定字母代码的变体蛋白质序列的列表，所述字母代码可以与bm-40信号肽或通常在层粘连蛋白n末端亚基之前的层粘连蛋白内源性信号肽一起使用。这些结构域可以用于产生实现层粘连蛋白聚合的连接子蛋白。可以实现聚合的层粘连蛋白结合连接子蛋白和内部大小减小的连接子蛋白的小鼠结构域已经被指定为核苷酸和氨基酸序列两者的字母代码a、a'到p(seqidnos:25-58)。替代性n末端结构域(小鼠和人)已经被指定为核苷酸和氨基酸序列两者的字母代码q到z和a到b(seqidnos:59-106)。另外的c末端结构域，可以与聚合连接子蛋白的巢蛋白层粘连蛋白结合g3结构域c末端(5'到)融合的小鼠和人非神经集聚蛋白营养不良聚糖(non-neuralagrindystroglycan)-结合结构域，已经被指定为核苷酸和氨基酸序列两者的字母代码c到j(seqidnos:107-138)。表3提供了表2中列出的变体蛋白序列中的每个变体蛋白序列的小鼠和人核苷酸和氨基酸序列，并且提供了指定给序列表中的这些序列的seqidno。表2.结构域单字母代码字母代码基因蛋白质结构域dna大小，bp6alama1层粘连蛋白-α1bm-40信号肽51a'lama1层粘连蛋白-α1内源性信号肽72blama1层粘连蛋白-α1ln753表3.结构域序列实例9功能性增强的lmαlnndδg2'的简化和修饰当前评估的aav-dj构建体允许包含表示开放阅读框的3.1kbdna。现有或计划的其它构建体可以允许更大的内含物。基于aav-dj极限的允许的蛋白质大小，注意到lmαlnndδg2'的巢蛋白g3结构域的大小可以减少到螺旋桨结构域的大小(～270个残基，810bp)，保留如j.takagi等人,2003,《自然(nature)》424:963-974中所描述的层粘连蛋白结合。393bp的减少允许结构域重排，使得可以包含g2型iv胶原蛋白和基底膜聚糖结合结构域。新的布置允许层粘连蛋白聚合与胶原蛋白/基底膜聚糖结合偶联。实例是(a)αlnndg2propeller(3.08kb)和(b)αlnndg2propeller-2(3.02kb)。下表4中示出了使用表2中提供的字母结构域编码的结构域中的每个结构域的结构域组合物。表3和序列表中提供了结构域组合物中使用的结构域的核苷酸和蛋白质序列。另一种布置允许层粘连蛋白聚合与营养不良聚糖结合偶联，所述营养不良聚糖结合的实例是αlnndpropelleragrinlg(3.6kb)。下表4中示出了使用表2中提供的字母结构域编码的αlnndpropelleragrinlg的结构域组合物。表3和序列表中提供了结构域组合物中使用的结构域的核苷酸和蛋白质序列。表4具有字母代码的结构域组合物的层粘连蛋白连接子蛋白7实例10具有聚合缺陷的其它层粘连蛋白的修复皮尔森综合征是具有眼部异常的先天性肾病综合征，导致早期终末期肾脏疾病、失明和死亡。原因是编码层粘连蛋白β2亚基的lamb2基因中的无效、框内缺失或错义突变。这些突变阻止亚基表达或改变亚基性质。所述错义突变中的若干错义突变聚类在β2ln结构域中(参见maatejas等人,2010,《人突变(hummutat.)》38:992-1002和k.k.mckee,m.aleksandrova和p.d.yurchenco,2018,《基质生物学》67:32-46)。ln结构域介导层粘连蛋白的聚合。这些突变的可能作用是可能是低分泌者/非分泌者的结构域的折叠失败以及聚合突变失败。在将皮尔森综合征中的两个高度保守的突变(s80r和h147r)放置到β1亚基(s68r和h135r)中之后对其进行评估。两种突变大大降低了聚合，并且发现βlnnd(β1ln-lea结构域在与巢蛋白g3融合时交换为α1ln-lea)能够拯救不能聚合的重组层粘连蛋白，因为层粘连蛋白缺乏βln结构域(描述于k.k.mckee,m.aleksandrova和p.d.yurchenco,2018,《基质生物学》67:32-46)。由于βlnnd可以在体外修复皮尔森缺陷，因此推断较短的βlnndδg2可以用于治疗疾病。类似地，预期可通过表达相关的层粘连蛋白连接子蛋白来治疗由于影响聚合的层粘连蛋白ln突变引起的其它疾病，其中其对应的ln-lea区段已经替代了融合蛋白中的α1ln-lea区段。这些蛋白质(βlnndδg2'、βlnndg2propeller、γlnndδg2'和γlnndg2propeller)通过表2和表4中的结构域组合物以及表3和序列表中提供的结构域组合物中使用的结构域的序列来描述。实例11向αlnndδg2直接添加营养不良聚糖结合活性采用巢蛋白螺旋桨结构域而不是完整的g3结构域复合物产生了用于添加营养不良聚糖结合结构域的空间(在允许的aav插入物大小的上下文中)。所述蛋白质被指定为αlnndδg2propelleragrinlg。在表2和4中示出了结构域组合物，其中表3和序列表中提供了结构域组合物中使用的结构域的序列。此处的大小增加阻止了在标准aav-dj病毒中的使用，并且需要允许更大插入物的病毒，如含有较小ck8e启动子的插入物。实例12通过肠胃外注射递送蛋白质lmαlnndδg2'蛋白及其任何替代性形式均可以肠胃外(腹膜内、血管内、肌内途径)注射，以将所述蛋白质递送到其预期的组织靶标，作为病毒递送的体细胞基因疗法的替代方案。构建体的密码子优化为了优化本文所述的测试构建体的表达，不仅作为在制造过程期间降低病毒滴度的手段，而且为了解决与高浓度的病毒相关的安全问题，将使用密码子优化方法使用自由可获得的软件对αlnndδg2'转基因进行评估(https://www.idtdna.com/codonopt)。另外，根据需要将共有kozak序列引入到构建体中。因此，可以以这种方式对本文所述的构建体或元件中的任何构建体或元件进行密码子优化。在小鼠中，将与亲本构建体平行地测试经过修饰的构建体中的每个经过修饰的构建体。简而言之，将通过颞静脉向小鼠幼崽全身性地施用构建体。然后在两周或三周后使动物安乐死，并且通过q-pcr和蛋白质印迹来测定所述构建体中的每个构建体的蛋白质水平。递送最快和高水平表达的构建体将被考虑用于最终用于非人灵长类动物研究中，并且最终用于人类患者的临床试验中。参考文献1.donnelly,m.l.等人(2001).口蹄疫病毒2a定点突变体和天然存在的“2a样”序列的“裂解”活性(the‘cleavage’activitiesoffoot-and-mouthdiseasevirus2asitedirectedmutantsandnaturallyoccurring‘2a-like’sequences)《普通病毒学杂志(j.gen.virol.)》82,1027-1041。2.foust,k.d、nurre,e、montgomery,c.l、hernandez,a、chan,c.m.和kaspar,b.k.(2009).血管内aav9优选地靶向新生神经元和成年星形胶质细胞(intravascularaav9preferentiallytargetsneonatalneuronsandadultastrocytes)《自然生物技术(nat.biotech.)》27,59-65。3.griegerjc、samulskirj(2005),腺相关病毒作为基因疗法载体：载体开发、生产和临床应用(adeno-associatedvirusasagenetherapyvector:vectordevelopment,productionandclinicalapplications)《生物化学工程技术进展(advbiochemengbiotechnol.)》99,119-145。4.griegerjc、samulskirj(2012),腺相关病毒载体学、制造和临床应用(adeno-associatedvirusvectorology,manufacturing,andclinicalapplications)《酶学方法(methodsenzymol)》507,229-254。5.kariyas、redb、jacquiera、nelsonk、przedborskis、monaniur(2012),突变体超氧化物歧化酶1(sod1)，肌萎缩性脊髓侧索硬化症的原因，破坏smn(脊髓性肌肉萎缩蛋白)向核酸cajal体的募集(mutantsuperoxidedismutase1(sod1),acauseofamyotrophiclateralsclerosis,disruptstherecruitmentofsmn,thespinalmuscularatrophyproteintonuclearcajalbodies)《人类分子遗传学(hummolgenet)》21,3421-3434。6.foustkd、wangx、mcgovernvl、braunl、bevanak、haidetam、lett、moralespr、richmm、burghesah、kasparbk(2010),通过早期出生后递送smn来拯救小鼠模型的脊髓性肌萎缩表型(rescueofthespinalmuscularatrophyphenotypeinamousemodelbyearlypostnataldeliveryofsmn)《自然生物技术(nat.biotech.)》28,271-274。7.flemingjo、tingjy、stohlmansa、weinerlp(1983),在获得和表征小鼠脑脊髓液方面的改进(improvementsinobtainingandcharacterizingmousecerebrospinalfluid)应用于小鼠肝炎病毒诱导的脑脊髓炎(applicationtomousehepatitisvirus-inducedencephalomyelitis)《神经免疫学杂志(jneuroimmunol.)》4,129-140。8.gao,g.p.和sena-esteves,m.(2012).将基因引入到哺乳动物细胞中：病毒载体(introducinggenesintomammaliancells:viralvectors)在《分子克隆(molecularcloning)》,第2卷：实验室手册(alaboratorymanual)(m.r.green和j.sambrook编辑),第1209-1313页,冷泉港实验室出版社(coldspringharborlaboratorypress),纽约。9.raptik、louis-jeunev、kohlbrennere、ishikawak、ladaged、zolotukhins、hajjarrj、weber(2012),在大量常用动物模型中针对aav血清型1、2、6和9的中和抗体(neutralizingantibodiesagainstaavserotypes1,2,6,and9inseaofcommonlyusedanimalmodels)《分子疗法(mol.ther.)》20,73-83。10.goulderpj、addomm、altfeldma、rosenberges、tangy、govenderu、mngqundanison、annamalaik、vogeltu、hammondm、buncem、coovadiahm、walkerbd(2001),通过酶联免疫斑点测定法和胞内细胞因子染色测定法快速定义五种新颖的hla-a*3002限制的人免疫缺陷病毒特异性细胞毒性t淋巴细胞表位(rapiddefinitionoffivenovelhla-a*3002-restrictedhumanimmunodeficiencyvirus-specificcytotoxict-lymphocyteepitopesbyelispotandintracellularcytokinestainingassays)《病毒学杂志(j.virol.)》75,1339-1347。11.aumailley,m、l.bruckner-tuderman、w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述和附图中变得显而易见。此类修改旨在落入所附权利要求书的范围内。前述书面说明书被认为足以使本领域的技术人员能够实践本发明。除了本文所示出和所描述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域的技术人员来说将从前面的描述中变得显而易见，并且落入所附权利要求的范围内。序列表<110>罗特格斯新泽西州立大学（rutgers,thestateuniversityofnewjersey）<120>aav相容的层粘连蛋白—连接子聚合蛋白<130>10491/006542-wo0<150>62/668,664<151>2018-05-08<160>170<170>patentin版本3.5<210>1<211>3009<212>dna<213>人工序列<220><223>在aav构建体中未使用标签的alphalnnddeltag2开放阅读框<400>1atgagggcctggatcttctttctcctttgcctggccgggagggctctggcacagcagaga60ggcttgttccctgccattctcaacctggccaccaatgcccacatcagcgccaatgctacc120tgtggagagaaggggcctgagatgttctgcaaactcgtggagcacgtgccgggccggcct180gttcgacacgcccaatgccgggtctgtgacggtaacagtacgaatcctagagagcgccat240ccgatatcacacgcaatcgatggcaccaacaactggtggcagagccccagtattcagaat300gggagagagtatcactgggtcactgtcaccctggacttacggcaggtctttcaagttgca360tacatcatcattaaagctgccaatgcccctcggcctggaaactggattttggagcgctcc420gtggatggcgtcaagttcaaaccctggcagtactatgccgtcagcgatacagagtgtttg480acccgctacaaaataactccacggcggggacctcccacttacagagcagacaacgaagtc540atctgcacctcgtattattcaaagctggtgccacttgaacatggagagattcacacatca600ctcatcaatggcagacccagcgctgacgacccctcaccccagttgctggaattcacctca660gcacggtacattcgccttcgtcttcagcgcatcagaacactcaacgcagacctcatgacc720cttagccatcgggacctcagagaccttgaccccattgtcacaagacgttattactattcg780ataaaagacatttccgttggaggcatgtgcatttgctacggccatgccagcagctgcccg840tgggatgaagaagcaaagcaactacagtgtcagtgtgaacacaatacgtgtggcgagagc900tgcgacaggtgctgtcctggctaccatcagcagccctggaggcccggaaccatttcctcc960ggcaacgagtgtgaggaatgcaactgtcacaacaaagccaaagattgttactatgacagc1020agtgttgcaaaggagaggagaagcctgaacactgccgggcagtacagtggaggaggggtt1080tgtgtcaactgctcgcagaataccacagggatcaactgtgaaacctgtatcgaccagtat1140tacagacctcacaaggtatctccttatgatgaccacccttgccgtccctgtaactgtgac1200cctgtggggtctctgagttctgtctgtatcaaggatgaccgccatgccgatttagccaat1260ggaaagtggccaggtcagtgtccatgtaggaaaggttatgctggagataaatgtgaccgc1320tgccagtttggctaccggggtttcccaaattgcatcccctgtgactgcaggactgtcggc1380agcctgaatgaggatccatgcatagagccgtgtctttgtaagaaaaatgttgagggtaag1440aactgtgatcgctgcaagccaggattctacaacttgaaggaacgaaaccccgagggctgc1500tccgagtgcttctgcttcggtgtctctggtgtctgtcccatcaactactgtgaaactggt1560ctccacaactgtgatatcccccagcgagcccagtgcatctatatgggtggttcctcctac1620acctgctcctgtctgcctggcttctctggggatggcagagcctgccgagacgtggatgaa1680tgccagcacagccgatgtcaccccgatgccttctgctacaacacaccaggctctttcaca1740tgtcagtgcaagcctggctatcagggggatggcttccgatgcatgcccggagaggtgagc1800aaaacccggtgtcaactggaacgagagcacatccttggagcagccggcggggcagatgca1860cagcggcccaccctgcaggggatgtttgtgcctcagtgtgatgaatatggacactatgta1920cccacccagtgtcaccacagcactggctactgctggtgtgtggaccgagatggtcgggag1980ctggagggtagccgtaccccacctgggatgaggcccccgtgtctgagtacagtggctcct2040cctattcaccagggaccagtagtacctacagctgtcatccccctgcctccagggacacac2100ttactctttgctcagactggaaagattgaacgcctgcccctggaaagaaacaccatgaag2160aagacagaacgcaaggcctttctccatatccctgcaaaagtcatcattggactggccttt2220gactgcgtggacaaggtggtttactggacagacatcagcgagccttccattgggagagcc2280agcctccacggtggagagccaaccaccatcattcgacaagatcttggaagccctgaaggc2340attgcccttgaccatcttggtcgaaccatcttctggacggactctcagttggatcgaata2400gaagttgcaaagatggatggcacccagcgccgagtgctgtttgacacgggtttggtgaat2460cccagaggcattgtgacagaccccgtaagagggaacctttattggacagattggaacaga2520gataatcccaaaattgagacttctcacatggatggcaccaaccggaggattctcgcacag2580gacaacctgggcttgcccaatggtctgacctttgatgcattctcatctcagctttgctgg2640gtggatgcaggcacccatagggcagaatgcctgaacccagctcagcctggcagacgcaaa2700gttctcgaagggctccagtatcctttcgctgtgactagctatgggaagaatttgtactac2760acagactggaagacgaattcagtgattgccatggaccttgctatatccaaagagatggat2820accttccacccacacaagcagacccggctatatggcatcaccatcgccctgtcccagtgt2880ccccaaggccacaattactgctcagtgaataatggtggatgtacccacctctgcttgccc2940actccagggagcaggacctgccgatgtcctgacaacaccctgggagttgactgcattgaa3000cggaaatga3009<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>f1nog21f<400>2ctgggtcactgtcaccctgg20<210>3<211>30<212>dna<213>人工序列<220><223>nog22r<400>3atggattctgaagacagacaccagagacac30<210>4<211>29<212>dna<213>人工序列<220><223>nog22f<400>4ctggtgtctgtcttcagaatccatgctac29<210>5<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>f1nog21r<400>5gaaggcacagtcgaggctgatcag24<210>6<211>30<212>dna<213>人工序列<220><223>bamshnog21f<400>6cggcagcctgaatgaggatccatgcataga30<210>7<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>shnog22r<400>7cacagtagttgatgggacagacacc25<210>8<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>shnog22f<400>8gtctctggtgtctgtcccatcaacta26<210>9<211>30<212>dna<213>人工序列<220><223>sseshnog21r<400>9gaggcacaaacatcccctgcagggtgggcc30<210>10<211>4639<212>dna<213>人工序列<220><223>paav-mcs表达载体<400>10cctgcaggcagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcgtcgggcgaccttt60ggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcact120aggggttcctgcggccgcacgcgtggagctagttattaatagtaatcaattacggggtca180ttagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcct240ggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagta300acgtcaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccac360ttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggt420aaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcag480tacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaat540gggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaat600gggagtttgttttgcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccc660cattgacgcaaatggg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hisprogluargaspileargaspproasnphecysglu505560<210>107<211>180<212>dna<213>人工序列<220><223>小鼠层粘连蛋白1lea-3结构域[dna,180bp]<400>107ccatgtacctgtgacccagctggttctgagaatggcgggatctgtgatgggtacactgat60ttttctgtgggtctcattgctggtcagtgtcggtgcaaattgcacgtggagggagagcgc120tgtgatgtttgtaaagaaggcttctacgacttaagtgctgaagacccgtatggttgtaaa180<210>108<211>60<212>prt<213>人工序列<220><223>小鼠层粘连蛋白1lea-3<400>108procysthrcysaspproalaglysergluasnglyglyilecysasp151015glytyrthrasppheservalglyleuilealaglyglncysargcys202530lysleuhisvalgluglygluargcysaspvalcyslysgluglyphe354045tyraspleuseralagluaspprotyrglycyslys505560<210>109<211>180<212>dna<213>人工序列<220><223>人层粘连蛋白1lea-3[dna,180bp]<400>109cgatgtacgtgtgacccagctggctctcaaaatgagggaatttgtgacagctatactgat60ttttctactggtctcattgctggccagtgtcggtgtaaattaaatgtggaaggagaacat120tgtgatgtttgcaaagaaggcttctatgatttaagcagtgaagatccatttggttgtaaa180<210>110<211>60<212>prt<213>人工序列<220><223>人层粘连蛋白1lea-3<400>110argcysthrcysaspproalaglyserglnasngluglyilecysasp151015sertyrthrasppheserthrglyleuilealaglyglncysargcys202530lysleuasnvalgluglygluhiscysaspvalcyslysgluglyphe354045tyraspleusersergluasppropheglycyslys505560<210>111<211>156<212>dna<213>人工序列<220><223>小鼠层粘连蛋白1lea-4结构域[dna,156bp]<400>111tcatgtgcttgcaatcctctgggaacaattcctggtgggaatccttgtgattctgagact60ggctactgctactgtaagcgcctggtgacaggacagcgctgtgaccagtgcctgccgcag120cactggggtttaagcaatgatttggatgggtgtcga156<210>112<211>52<212>prt<213>人工序列<220><223>小鼠层粘连蛋白1lea-4<400>112sercysalacysasnproleuglythrileproglyglyasnprocys151015aspsergluthrglytyrcystyrcyslysargleuvalthrglygln202530argcysaspglncysleuproglnhistrpglyleuserasnaspleu354045aspglycysarg50<210>113<211>156<212>dna<213>人工序列<220><223>人层粘连蛋白1lea-4[dna,156bp]<400>113tcttgtgcttgcaatcctctgggaacaattcctggagggaatccttgtgattccgagaca60ggtcactgctactgcaagcgtctggtgacaggacagcattgtgaccagtgcctgccagag120cactggggcttaagcaatgatttggatggatgtcga156<210>114<211>52<212>prt<213>人工序列<220><223>人层粘连蛋白1lea-4<400>114sercysalacysasnproleuglythrileproglyglyasnprocys151015aspsergluthrglyhiscystyrcyslysargleuvalthrglygln202530hiscysaspglncysleuprogluhistrpglyleuserasnaspleu354045aspglycysarg50<210>115<211>99<212>dna<213>人工序列<220><223>小鼠层粘连蛋白1信号肽[dna,99bp]<400>115atgacgggcggcgggcgggccgcgctggccctgcagccccgggggcggctgtggccgctg60ttggctgtgctggcggctgtggcgggctgtgtccgggcg99<210>116<211>33<212>prt<213>人工序列<220><223>小鼠层粘连蛋白1信号肽<400>116metthrglyglyglyargalaalaleualaleuglnproargglyarg151015leutrpproleuleualavalleualaalavalalaglycysvalarg202530ala<210>117<211>99<212>dna<213>人工序列<220><223>人层粘连蛋白1信号肽[dna,99bp]<400>117atgagagggagccatcgggccgcgccggccctgcggccccgggggcggctctggcccgtg60ctggccgtgctggcggcggccgccgcggcgggctgtgcc99<210>118<211>33<212>prt<213>人工序列<220><223>人层粘连蛋白1信号肽：<400>118metargglyserhisargalaalaproalaleuargproargglyarg151015leutrpprovalleualavalleualaalaalaalaalaalaglycys202530ala<210>119<211>768<212>dna<213>人工序列<220><223>小鼠层粘连蛋白1ln结构域[dna,768bp]（注释：人1中的e/gag（2）相对于小鼠i中的d/gac（1）为d或e，但在小鼠ln-lea的晶体结构中为e）<400>119gccatggactacaaggacgacgatgacaaggagtgcgcggatgagggcgggcggccgcag60cgctgcatgccggagtttgttaatgccgccttcaatgtgaccgtggtggctaccaacacg120tgtgggactccgcccgaggagtactgcgtgcagactggggtgaccggagtcactaagtcc180tgtcacctgtgcgacgccggccagcagcacctgcaacacggggcagccttcctgaccgac240tacaacaaccaggccgacaccacctggtggcaaagccagactatgctggccggggtgcag300taccccaactccatcaacctcacgctgcacctgggaaaggcttttgacatcacttacgtg360cgcctcaagttccacaccagccgtccagagagcttcgccatctataagcgcactcgggaa420gacgggccctggattccttatcagtactacagtgggtcctgtgagaacacgtactcaaag480gctaaccgtggcttcatcaggaccggaggggacgagcagcaggccttgtgtactgatgaa540ttcagtgacatttcccccctcaccggtggcaacgtggccttttcaaccctggaaggacgg600ccgagtgcctacaactttgacaacagccctgtgctccaggaatgggtaactgccactgac660atcagagtgacgctcaatcgcctgaacacctttggagatgaagtgtttaacgagcccaaa720gttctcaagtcttactattacgcaatctcagactttgctgtgggcggc768<210>120<211>249<212>prt<213>人工序列<220><223>小鼠层粘连蛋白1ln结构域<400>120alametaspglucysalaaspgluglyglyargproglnargcysmet151015progluphevalasnalaalapheasnvalthrvalvalalathrasn202530thrcysglythrproprogluglutyrcysvalglnthrglyvalthr354045glyvalthrlyssercyshisleucysaspalaglyglnglnhisleu505560glnhisglyalaalapheleuthrasptyrasnasnglnalaaspthr65707580thrtrptrpglnserglnthrmetleualaglyvalglntyrproasn859095serileasnleuthrleuhisleuglylysalapheaspilethrtyr100105110valargleulysphehisthrserargprogluserphealailetyr115120125lysargthrarggluaspglyprotrpileprotyrglntyrtyrser130135140glysercysgluasnthrtyrserlysalaasnargglypheilearg145150155160thrglyglyaspgluglnglnalaleucysthraspglupheserasp165170175ileserproleuthrglyglyasnvalalapheserthrleuglugly180185190argproseralatyrasnpheaspasnserprovalleuglnglutrp195200205valthralathraspileargvalthrleuasnargleuasnthrphe210215220glyaspgluvalpheasngluprolysvalleulyssertyrtyrtyr225230235240alaileseraspphealavalglygly245<210>121<211>753<212>dna<213>人工序列<220><223>人层粘连蛋白1ln结构域[dna,753bp]<400>121caggcagccatggacgagtgcacggacgagggcgggcggccgcaacgctgcatgcccgag60ttcgtcaacgccgctttcaacgtgactgtggtggccaccaacacgtgtgggactccgccc120gaggaatactgtgtgcagaccggggtgaccggggtcaccaagtcctgtcacctgtgcgac180gccgggcagccccacctgcagcacggggcagccttcctgaccgactacaacaaccaggcc240gacaccacctggtggcaaagccagaccatgctggccggggtgcag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