1.一种用于富集靶核酸序列的方法,所述方法包括:
(a)向包含多个样品核酸分子的样品溶液中引入与所述多个样品核酸分子中的一个或多个样品核酸分子的靶核酸序列互补或部分互补的捕获引物核酸分子,所述样品核酸分子各自包含通用衔接子核酸序列;
(b)酶促延伸与所述一个或多个样品核酸分子的靶核酸序列退火的捕获引物核酸分子;和
(c)酶促降解单链样品核酸分子,以提供比所述样品溶液具有更高比例的包含靶核酸序列的样品核酸分子的富集的样品溶液。
2.权利要求1所述的方法,其中酶促延伸所述捕获引物核酸分子包括:
使样品溶液的温度保持在所述多个样品核酸分子的解链温度或以上;
向样品溶液中引入延伸酶,所述延伸酶被配置成延伸与所述靶核酸序列退火的捕获引物核酸分子;
使样品溶液保持在捕获引物核酸分子的退火温度附近或以下,所述退火温度适合使捕获引物核酸分子与靶核酸序列退火;和
使样品溶液保持在延伸酶的延伸温度附近,所述延伸温度适合通过延伸酶酶促延伸与所述靶核酸序列退火的捕获引物核酸分子。
3.权利要求2所述的方法,其中所述延伸酶选自聚合酶、逆转录酶及其组合。
4.权利要求1-3中任一项所述的方法,其中酶促降解单链样品核酸分子包括:
向样品溶液中引入降解酶,所述降解酶配置成降解包含通用衔接子核酸序列的单链核酸分子;和
使样品溶液的温度保持在所述降解酶的降解温度。
5.权利要求4所述的方法,其中在酶促延伸所述捕获引物核酸分子之后,将所述降解酶引入样品溶液。
6.权利要求4所述的方法,其中在酶促延伸所述捕获引物核酸分子之前,将所述降解酶引入样品溶液。
7.权利要求4-6中任一项所述的方法,其中所述降解温度在所述退火温度以下。
8.权利要求4-7中任一项所述的方法,其中所述降解温度在所述延伸温度以下。
9.权利要求4-8中任一项所述的方法,其中所述降解温度是所述降解酶的活性温度。
10.权利要求4-9中任一项所述的方法,其中所述降解酶是核糖核酸酶。
11.权利要求4-10中任一项所述的方法,其中所述降解酶是核酸内切酶。
12.权利要求11所述的方法,其中所述核酸内切酶是核糖核酸内切酶。
13.权利要求12所述的方法,其中所述核糖核酸内切酶选自rna酶t1、rna酶a及其组合。
14.权利要求4-13中任一项所述的方法,其中所述降解酶是rna酶t1,并且其中所述通用衔接子核酸序列包含核糖鸟嘌呤。
15.权利要求4-13中任一项所述的方法,其中所述降解酶是rna酶a,并且其中所述通用衔接子核酸序列包含选自核糖胞嘧啶、核糖尿嘧啶及其组合的碱基。
16.权利要求4-15中任一项所述的方法,其中所述降解酶在延伸温度下是无活性的。
17.权利要求4-16中任一项所述的方法,其中所述降解酶在降解温度以上的温度下是无活性的之后,在所述降解温度下是有活性的。
18.权利要求1-17中任一项所述的方法,其中酶促降解所述单链样品核酸分子包括降解设置在所述单链样品核酸分子上的通用衔接子核酸序列的部分。
19.权利要求1-18中任一项所述的方法,其中酶促降解所述单链样品核酸分子包括切割所述单链样品核酸分子的通用衔接子核酸分子的骨架。
20.权利要求1-18中任一项所述的方法,其中酶促降解所述单链样品核酸分子包括消化所述单链样品核酸分子的通用衔接子核酸分子的部分。
21.权利要求1-20中任一项所述的方法,其中所述捕获引物核酸分子与所述多个样品核酸分子的一个或多个第二样品核酸分子的第二靶核酸序列互补或部分互补,其中所述第二靶核酸序列不同于所述靶核酸序列。
22.权利要求2-21中任一项所述的方法,其中使样品溶液保持在捕获引物核酸分子的退火温度附近或以下包括使样品溶液保持在捕获引物核酸分子的退火温度的约1℃至约5℃的范围内的温度。
23.权利要求2-22中任一项所述的方法,其中所述捕获引物核酸分子和所述第二靶核酸序列具有在退火温度的约1℃至约5℃的范围内的第二退火温度。
24.权利要求2-23中任一项所述的方法,还包括对富集的样品溶液重复步骤(b)和(c)一次或多次。
25.权利要求24所述的方法,还包括使样品溶液的温度保持在所述多个样品核酸分子和所述捕获引物核酸分子的解链温度或以上。
26.权利要求1-25中任一项所述的方法,还包括:
将多个扩增引物核酸分子引入富集的样品溶液,其中所述多个扩增引物核酸分子中的扩增引物核酸分子与所述通用衔接子核酸序列互补;和
对具有所述多个扩增引物核酸分子的富集的样品溶液中的所述多个样品核酸分子进行核酸扩增反应,以提供扩增的富集的样品溶液。
27.权利要求26所述的方法,其中对所述富集的样品溶液中的所述多个样品核酸分子进行核酸扩增反应不扩增或基本上不扩增已经被降解酶降解的样品核酸分子。
28.权利要求26和27中任一项所述的方法,还包括对所述扩增的富集的样品溶液进行反应,所述反应选自核酸片段化反应、酶促末端修复、a加尾、衔接子连接、聚合酶链反应及其组合。
29.权利要求1-28中任一项所述的方法,还包括纯化所述富集的样品溶液中的所述多个样品核酸分子。
30.权利要求29所述的方法,其中纯化所述富集的样品溶液中的所述多个样品核酸分子包括从所述富集的样品溶液中去除选自捕获引物核酸分子、酶及其组合的试剂。
31.权利要求1-30中任一项所述的方法,还包括对所述富集的样品溶液中的核酸分子测序。
32.权利要求1-31中任一项所述的方法,其中所述多个样品核酸分子的通用衔接子核酸序列包含衔接子标签核酸序列。
33.权利要求32所述的方法,其中所述衔接子标签核酸序列限定独特的核酸序列。
34.权利要求31-33中任一项所述的方法,其中对所述富集的样品溶液中的核酸分子测序包括基于所述富集的样品溶液中的所述多个样品核酸分子生成样品核酸信息。
35.权利要求34所述的方法,其中对所述富集的样品溶液中的核酸分子测序包括基于所述衔接子标签核酸序列生成衔接子标签核酸序列信息。
36.权利要求1-35中任一项所述的方法,其中所述捕获引物核酸分子包含硫代磷酸酯键。
37.权利要求36所述的方法,其中所述硫代磷酸酯键设置在所述捕获引物核酸分子的3’末端处的碱基以及与所述3’末端处的碱基紧邻的碱基之间。
38.权利要求1-37中任一项所述的方法,其中所述捕获引物核酸分子被配置成在退火温度下主要是单链的。
39.权利要求1-37中任一项所述的方法,其中所述捕获引物核酸分子被配置成在退火温度下主要是至少部分双链的。
40.权利要求1-37中任一项所述的方法,其中所述捕获引物核酸分子与所述靶核酸序列部分互补,并且其中所述捕获引物核酸分子包含在1到5个范围内的与通用衔接子核酸序列不互补的多个碱基。
41.权利要求1-37中任一项所述的方法,其中所述捕获引物核酸分子与所述靶核酸序列部分互补,并且其中所述捕获引物核酸分子与通用衔接子序列大于或等于90%互补。
42.权利要求1-37中任一项所述的方法,其中所述捕获引物核酸还包含与第一捕获引物核酸分子互补或部分互补的第二捕获引物核酸分子。
43.一种试剂盒,其包含:
与靶序列互补或部分互补的捕获引物核酸分子;和
配置成降解单链核酸分子的降解酶。
44.权利要求43所述的试剂盒,其中所述降解酶是核糖核酸酶。
45.权利要求43所述的试剂盒,其中所述降解酶是核酸内切酶。
46.权利要求45所述的试剂盒,其中所述核酸内切酶是核糖核酸内切酶。
47.权利要求46所述的试剂盒,其中所述核糖核酸内切酶选自rna酶t1、rna酶a及其组合。
48.权利要求43-47中任一项所述的试剂盒,其中所述降解酶是rna酶t1。
49.权利要求43-48中任一项所述的试剂盒,其中所述降解酶被配置成降解包含核糖鸟嘌呤的单链核酸分子。
50.权利要求43-46中任一项所述的试剂盒,其中所述降解酶是rna酶a。
51.权利要求50所述的试剂盒,其中所述降解酶被配置成降解包含选自核糖胞嘧啶、核糖尿嘧啶及其组合的核酸碱基的单链核酸分子。
52.权利要求43-51中任一项所述的试剂盒,其中所述降解酶:
在活性温度范围以上对于降解单链核酸分子是无活性的;和
在无活性之后,在活性温度范围内对于降解单链核酸分子是有活性的。
53.权利要求43-52中任一项所述的试剂盒,还包含多个配置成偶联到样品核酸分子的通用衔接子核酸分子。
54.权利要求43-53中任一项所述的试剂盒,还包含选自以下的试剂:负载有包含通用衔接子核酸分子的寡核苷酸的转座酶;限制性核酸内切酶;包含通用衔接子核酸分子的寡核苷酸或寡核苷酸复合物;包含t7启动子的寡核苷酸或寡核苷酸复合物;针对转录因子的抗体或抗体片段;及其组合。
55.权利要求53和54中任一项所述的试剂盒,其中所述降解酶被配置成降解包含所述通用衔接子核酸分子的单链核酸分子。
56.权利要求43-55中任一项所述的试剂盒,还包括用于富集靶核酸序列的说明书,所述说明书包括:
(a)向包含多个样品核酸分子的样品溶液中引入与所述多个样品核酸分子中的一个或多个样品核酸分子的靶核酸序列互补或部分互补的捕获引物核酸分子,所述样品核酸分子各自包含通用衔接子核酸序列;
(b)酶促延伸与所述一个或多个样品核酸分子的靶核酸序列退火的捕获引物核酸分子;和
(c)酶促降解单链样品核酸分子,以提供比所述样品溶液具有更高比例的包含靶核酸序列的样品核酸分子的富集的样品溶液。
57.权利要求56所述的试剂盒,其中用于酶促延伸所述捕获引物核酸分子的说明书包括:
使样品溶液的温度保持在所述多个样品核酸分子的解链温度或以上;
向样品溶液中引入延伸酶,所述延伸酶被配置成延伸与所述靶核酸序列退火的捕获引物核酸分子;
使样品溶液保持在捕获引物核酸分子的退火温度附近或以下,所述退火温度适合使捕获引物核酸分子与靶核酸序列退火;和
使样品溶液保持在延伸酶的延伸温度附近,所述延伸温度适合通过延伸酶酶促延伸与所述靶核酸序列退火的捕获引物核酸分子。
58.权利要求56和57中任一项所述的试剂盒,其中用于酶促降解单链样品核酸分子的说明书包括:
向样品溶液中引入降解酶,所述降解酶配置成降解包含通用衔接子核酸序列的单链核酸分子;和
使样品溶液的温度保持在所述降解酶的降解温度。
59.权利要求56-58中任一项所述的试剂盒,其中所述说明书还包括对富集的样品溶液重复步骤(b)和(c)一次或多次。
60.权利要求59所述的试剂盒,其中所述说明书还包括使样品溶液的温度保持在所述多个样品核酸分子和所述捕获引物核酸分子的解链温度或以上。
61.权利要求56-60中任一项所述的试剂盒,其中所述说明书还包括:
将多个扩增引物核酸分子引入富集的样品溶液,其中所述多个扩增引物核酸分子中的扩增引物核酸分子与所述通用衔接子核酸序列互补;和
对具有所述多个扩增引物核酸分子的富集的样品溶液中的所述多个样品核酸分子进行核酸扩增反应。
62.权利要求56-61中任一项所述的试剂盒,其中所述说明书还包括以下说明:
使通用衔接子分子偶联到样品溶液中的样品核酸分子。
63.权利要求43-62中任一项所述的试剂盒,还包括被配置成延伸与所述靶核酸序列退火的捕获引物核酸分子的延伸酶。
64.权利要求63所述的试剂盒,其中所述延伸酶选自聚合酶、逆转录酶及其组合。
65.一种用于消耗靶核酸序列的方法,所述方法包括:
(a)向包含多个样品核酸分子的样品溶液中引入与所述多个样品核酸分子中的一个或多个样品核酸分子的靶核酸序列互补或部分互补的捕获引物核酸分子,所述样品核酸分子各自包含通用衔接子核酸序列,所述通用衔接子核酸序列包含核糖核苷酸;
(b)酶促延伸与所述一个或多个样品核酸分子的靶核酸序列退火的捕获引物核酸分子;和
(c)酶促切割所述样品核酸分子的双链核糖核酸分子,以提供比所述样品溶液具有更低比例的包含靶核酸序列的样品核酸分子的消耗的样品溶液。
66.权利要求65所述的方法,其中酶促延伸所述捕获引物核酸分子包括:
使样品溶液的温度保持在所述多个样品核酸分子的解链温度或以上;
向样品溶液中引入延伸酶,所述延伸酶被配置成延伸与所述靶核酸序列退火的捕获引物核酸分子;和
使样品溶液保持在捕获引物核酸分子的退火温度附近或以下,所述退火温度适合使捕获引物核酸分子与靶核酸序列退火;和
使样品溶液保持在延伸酶的延伸温度附近,所述延伸温度适合通过延伸酶酶促延伸与所述靶核酸序列退火的捕获引物核酸分子。
67.权利要求66所述的方法,其中所述延伸酶选自聚合酶、逆转录酶及其组合。
68.权利要求66和67中任一项所述的方法,其中酶促切割所述双链样品核酸分子包括:
向样品溶液中引入降解酶,所述降解酶配置成降解包含通用衔接子核酸序列的双链核糖核酸分子;和
使样品溶液的温度保持在降解酶的降解温度。
69.权利要求68所述的方法,其中在酶促延伸所述捕获引物核酸分子之后,将所述降解酶引入样品溶液。
70.权利要求68所述的方法,其中在酶促延伸所述捕获引物核酸分子之前,将所述降解酶引入样品溶液。
71.权利要求68所述的方法,其中所述降解温度在所述退火温度以下。
72.权利要求68所述的方法,其中所述降解温度在所述延伸温度以下。
73.权利要求68所述的方法,其中所述降解温度是所述降解酶的活性温度。
74.权利要求68-73中任一项所述的方法,其中所述降解酶是核糖核酸酶。
75.权利要求68-73中任一项所述的方法,其中所述降解酶是核酸内切酶。
76.权利要求75所述的方法,其中所述核酸内切酶是核糖核酸内切酶。
77.权利要求76所述的方法,其中所述核糖核酸内切酶选自rna酶hii、rna酶h、rna酶iii及其组合。
78.权利要求68-76中任一项所述的方法,其中所述降解酶是rna酶hii。
79.权利要求65-78中任一项所述的方法,其中所述捕获引物核酸分子是封闭的捕获引物核酸分子,其中所述封闭的捕获引物核酸分子被配置成阻断封闭的捕获引物核酸分子通过延伸酶在3’末端的酶促延伸。
80.权利要求68-79中任一项所述的方法,其中酶促切割所述双链样品核酸分子包括降解设置在所述双链样品核酸分子上的通用衔接子核酸序列的部分。
81.权利要求80所述的方法,其中酶促切割所述双链样品核酸分子包括切割所述双链样品核酸分子的通用衔接子核酸分子的骨架。
82.权利要求80所述的方法,其中酶促切割所述双链样品核酸分子包括消化所述双链样品核酸分子的通用衔接子核酸分子的部分。
83.权利要求65-82中任一项所述的方法,其中所述捕获引物核酸分子与所述多个样品核酸分子的一个或多个第二样品核酸分子的第二靶核酸序列互补或部分互补,其中所述第二靶核酸序列不同于所述靶核酸序列。
84.权利要求66-83中任一项所述的方法,其中使样品溶液保持在捕获引物核酸分子的退火温度附近或以下包括使样品溶液保持在捕获引物核酸分子的退火温度的约1℃至约5℃的范围内的温度。
85.权利要求83和84中任一项所述的方法,其中捕获引物核酸分子和所述第二靶核酸序列具有在退火温度的约1℃至约5℃的范围内的第二退火温度。
86.权利要求65-85中任一项所述的方法,还包括对消耗的样品溶液重复步骤(b)和(c)一次或多次。
87.权利要求86所述的方法,还包括使样品溶液的温度保持在所述多个样品核酸分子和所述捕获引物核酸分子的解链温度或以上。
88.权利要求65-87中任一项所述的方法,还包括:
将多个扩增引物核酸分子引入消耗的样品溶液,其中所述多个扩增引物核酸分子中的扩增引物核酸分子与所述通用衔接子核酸序列互补;和
对具有所述多个扩增引物核酸分子的消耗的样品溶液中的所述多个样品核酸分子进行核酸扩增反应,以提供扩增的消耗的样品溶液。
89.权利要求88所述的方法,其中对所述消耗的样品溶液中的所述多个样品核酸分子进行核酸扩增反应不扩增或基本上不扩增已经被降解酶降解的样品核酸分子。
90.权利要求65-89中任一项所述的方法,还包括对所述扩增的消耗的样品溶液进行反应,所述反应选自核酸片段化反应、酶促末端修复、a加尾、衔接子连接、聚合酶链反应及其组合。
91.权利要求65-90中任一项所述的方法,还包括纯化所述消耗的样品溶液中的所述多个样品核酸分子。
92.权利要求91所述的方法,其中纯化所述消耗的样品溶液中的所述多个样品核酸分子包括从所述消耗的样品溶液中去除选自捕获引物核酸分子、酶及其组合的试剂。
93.权利要求65-92中任一项所述的方法,还包括对所述消耗的样品溶液中的核酸分子测序。
94.权利要求65-93中任一项所述的方法,其中所述多个样品核酸分子的通用衔接子核酸序列包含衔接子标签核酸序列。
95.权利要求94所述的方法,其中所述衔接子标签核酸序列限定独特的核酸序列。
96.权利要求93-95中任一项所述的方法,其中对所述消耗的样品溶液中的核酸分子测序包括基于所述消耗的样品溶液中的所述多个样品核酸分子生成样品核酸信息。
97.权利要求96所述的方法,其中对所述消耗的样品溶液中的核酸分子测序包括基于所述衔接子标签核酸序列生成衔接子标签核酸序列信息。
98.权利要求65-97中任一项所述的方法,其中所述捕获引物核酸分子包含硫代磷酸酯键。
99.权利要求98所述的方法,其中所述硫代磷酸酯键设置在所述捕获引物核酸分子的3’末端处的碱基以及与所述3’末端处的碱基紧邻的碱基之间。
100.权利要求65-99中任一项所述的方法,其中所述捕获引物核酸分子被配置成在退火温度下主要是单链的。
101.权利要求65-99中任一项所述的方法,其中所述捕获引物核酸分子被配置成在退火温度下主要是至少部分双链的。
102.权利要求65-101中任一项所述的方法,其中所述捕获引物核酸分子与所述靶核酸序列部分互补,并且其中所述捕获引物核酸分子包含在1到5个范围内的与通用衔接子核酸序列不互补的多个碱基。
103.权利要求65-102中任一项所述的方法,其中所述捕获引物核酸分子与所述靶核酸序列部分互补,并且其中所述捕获引物核酸分子与通用衔接子序列大于或等于90%互补。
104.权利要求65-103中任一项所述的方法,其中所述捕获引物核酸分子还包含与第一捕获引物核酸分子互补或部分互补的第二捕获引物核酸分子。
105.一种试剂盒,其包含:
与靶序列互补或部分互补的捕获引物核酸分子;和
配置成降解双链核酸分子的降解酶。
106.权利要求105所述的试剂盒,其中所述降解酶是核糖核酸酶。
107.权利要求105所述的试剂盒,其中所述降解酶是核酸内切酶。
108.权利要求107所述的试剂盒,其中所述核酸内切酶是核糖核酸内切酶。
109.权利要求108所述的试剂盒,其中所述核糖核酸内切酶选自rna酶hii、rna酶h、rna酶iii及其组合。
110.权利要求105-109中任一项所述的试剂盒,其中所述降解酶是rna酶hii。
111.权利要求105-110中任一项所述的试剂盒,其中所述捕获引物核酸分子是封闭的捕获引物核酸分子,其中所述封闭的捕获引物核酸分子被配置成阻断封闭的捕获引物核酸分子通过延伸酶在3’末端的酶促延伸。
112.权利要求105-111中任一项所述的试剂盒,其中所述降解酶:
在活性温度范围以上对于降解双链核酸分子是无活性的;和
在无活性之后,在活性温度范围内对于降解双链核酸分子是有活性的。
113.权利要求105-112中任一项所述的试剂盒,还包含多个配置成偶联到样品核酸分子的通用衔接子核酸分子。
114.权利要求105-113中任一项所述的试剂盒,还包含选自以下的试剂:负载有包含通用衔接子核酸分子的寡核苷酸的转座酶;限制性核酸内切酶;包含通用衔接子核酸分子的寡核苷酸或寡核苷酸复合物;包含t7启动子的寡核苷酸或寡核苷酸复合物;针对转录因子的抗体或抗体片段;及其组合。
115.权利要求114所述的试剂盒,其中所述降解酶被配置成切割包含所述通用衔接子核酸分子的双链核酸分子。
116.权利要求105-115中任一项所述的试剂盒,还包括用于消耗靶核酸序列的说明书,所述说明书包括:
(a)向包含多个样品核酸分子的样品溶液中引入与所述多个样品核酸分子中的一个或多个样品核酸分子的靶核酸序列互补或部分互补的捕获引物核酸分子,所述样品核酸分子各自包含通用衔接子核酸序列,所述通用衔接子核酸序列包含核糖核苷酸;
(b)酶促延伸与所述一个或多个样品核酸分子的靶核酸序列退火的捕获引物核酸分子;和
(c)酶促切割样品核酸分子的双链核糖核酸分子,以提供比所述样品溶液具有更低比例的包含靶核酸序列的样品核酸分子的消耗的样品溶液。
117.权利要求116所述的试剂盒,其中用于酶促延伸所述捕获引物核酸分子的说明书包括:
使样品溶液的温度保持在所述多个样品核酸分子的解链温度或以上;
向样品溶液中引入延伸酶,所述延伸酶被配置成延伸与所述靶核酸序列退火的捕获引物核酸分子;
使样品溶液保持在捕获引物核酸分子的退火温度附近或以下,所述退火温度适合使捕获引物核酸分子与靶核酸序列退火;和
使样品溶液保持在延伸酶的延伸温度附近,所述延伸温度适合通过延伸酶酶促延伸与所述靶核酸序列退火的捕获引物核酸分子。
118.权利要求116和117中任一项所述的试剂盒,其中用于酶促切割双链样品核酸分子的说明书包括:
向样品溶液中引入降解酶,所述降解酶配置成切割包含通用衔接子核酸序列的双链核酸分子;和
使样品溶液的温度保持在降解酶的降解温度。
119.权利要求116-118中任一项所述的试剂盒,其中所述说明书还包括对消耗的样品溶液重复步骤(b)和(c)一次或多次。
120.权利要求119所述的试剂盒,其中所述说明书还包括使样品溶液的温度保持在所述多个样品核酸分子和所述捕获引物核酸分子的解链温度或以上。
121.权利要求116-120中任一项所述的试剂盒,其中所述说明书还包括:
将多个扩增引物核酸分子引入消耗的样品溶液,其中所述多个扩增引物核酸分子中的扩增引物核酸分子与所述通用衔接子核酸序列互补;和
对具有所述多个扩增引物核酸分子的消耗的样品溶液中的所述多个样品核酸分子进行核酸扩增反应。
122.权利要求116-121中任一项所述的试剂盒,其中所述说明书还包括以下说明:
使通用衔接子分子偶联到样品溶液中的样品核酸分子。
123.权利要求105-122中任一项所述的试剂盒,还包括被配置成延伸与所述靶核酸序列退火的捕获引物核酸分子的延伸酶。
124.权利要求105-123中任一项所述的试剂盒,其中所述延伸酶选自聚合酶、逆转录酶及其组合。