1.本发明涉及如下抗体：通过增大对内皮素受体a(eta，endothelinreceptortypea)的结合力，来有效抑制内皮素‑1(et‑1，endothelin‑1)及内皮素受体a之间的结合，从而调节内皮素受体a的活性。
背景技术：
：：2.g蛋白偶联受体(gpcr，g‑proteincoupledreceptor)为具有7个跨膜部位的多次跨膜蛋白，将细胞外的信号向细胞内传导，从而不仅起到通过激活异三聚体g蛋白来对信号传导物质反应的作用，还起到感觉等生理学所必需的作用。并且，g蛋白偶联受体不仅在最高层次上直接调节细胞的生长、增殖、移动、聚集、凋亡等主要生物学现象，而且还直接与癌症、心血管疾病等之类的疾病相关，因此作为主要药物靶物质而备受瞩目。3.内皮素受体a已知在正常人中是主要在血管平滑肌中表达，通过与作为配体的内皮素‑1的结合的细胞内信号传导过程来引起血管收缩作用。因此，作为内皮素受体拮抗剂(endothelinreceptorantagonist)的波生坦(bosentan)之类的药物一直用作高血压治疗剂(naturereviewsdrugdiscovery，2011，vol.10，47)。近来，通过许多基础生物学及临床研究报告表明，内皮素受体a在膀胱癌、肺癌、卵巢癌、肾癌、结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、子宫癌、横纹肌肉瘤、胶质母细胞瘤等多种癌症中有过表达，与癌细胞的增殖、移动、浸透、转移、血管新生性等主要的癌症进行过程直接相关，从而降低患者的存活率，因此作为主要抗癌靶物质而备受瞩目(naturereviewcancer，2013，vol.13，637)。4.抗体药物比起低分子合成药品，具有高特异性、低副作用、高血浆半衰期、通过fc区域的缺陷细胞凋亡作用机制(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用(adcc)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(adcp)、补体依赖性细胞毒性作用(cdc))等的优点，但这些优点却被弃之不顾，现有的靶向内皮素受体a的药物仍是波生坦、齐泊腾坦(zibotentan)、阿曲生坦(atrasentan)等低分子化合物，尚无抗体药物的报告，即扩展到所有g蛋白偶联受体，获得出售许可的抗体药物也非常少，作为靶向g蛋白偶联受体的抗体，协和发酵麒麟(kyowahakkokirin)公司的靶向ccr4的poteligeo(mogamulizumab)于2018年5月在日本首次得到认可，安进(amgen)公司开发的靶向cgrp受体的aimovig(erenumab)首次得到美国食品药品监督管理局(usfda)的认可。因此，发掘与内皮素受体a特异性结合并调节其活性的新型抗体的必要性日渐抬头。并且，为了开发靶向g蛋白偶联受体的新型抗体药物，首先要与抗原的胞外结构域(extracellulardomain，ecd)特异性结合，但在g蛋白偶联受体的全部表面中，胞外域所占的比例为非常有限的10％左右，因此，过去使用的抗体发掘战略非常受限。5.上述作为
背景技术：
：来说明的事项仅用于增进对本发明背景的理解，而不应认为这相当于该
技术领域：
：中的普通技术人员已认知的现有技术。技术实现要素：6.技术问题7.本发明人为发掘通过与内皮素受体a特异性结合来阻碍信号传导过程的新型抗体而进行了多次努力。其结果，本发明人发现在稳定表达内皮素受体a的细胞株中有效抑制内皮素‑1信号传导的抗体，从而完成本发明。8.因此，本发明的目的在于，提供一种单克隆抗体或其片段，通过抗原识别内皮素受体a(endothelinreceptortypea)或其胞外结构域(extracellulardomain)并与之特异性结合。9.本发明的再一目的在于，提供一种核酸分子，编码上述单克隆抗体或其片段。10.本发明的另一目的在于，提供一种载体，包含上述核酸分子。11.本发明的还有一目的在于，提供一种宿主细胞，包含上述载体。12.本发明的又一目的在于，提供一种用于预防或治疗癌症或高血压的药剂学组合物，包含上述单克隆抗体、核酸分子或载体。13.本发明的又一目的在于，提供一种癌症或高血压的治疗方法，包括向对象(subject)给药药剂学上有效量的上述单克隆抗体、核酸分子或载体的步骤。14.本发明的又一目的在于，提供一种上述单克隆抗体或其片段、核酸分子或载体在制备用于治疗癌症或高血压的药剂学组合物中的用途。15.本发明的又一目的在于，提供一种样品中包含的内皮素受体a的定量方法，包括使用上述单克隆抗体或其片段进行处理的步骤。16.本发明的又一目的在于，提供一种提供用于诊断由内皮素受体a的过表达引起的疾病的信息的方法。17.本发明的又一目的在于，提供一种内皮素受体a定量试剂盒。18.本发明的其他目的及优点将通过下述发明的详细说明、发明要求保护范围以及附图得到进一步明确。19.技术方案20.根据本发明的一实施方式，提供一种单克隆抗体或其片段，通过抗原识别内皮素受体a或其胞外结构域并与之特异性结合的特异性结合。21.上述内皮素受体a承担通过作为配体的内皮素‑1的结合的细胞内信号传导过程，作为高血压治疗剂及主要的抗癌靶物质而备受瞩目，现有的靶向内皮素受体a的药物为波生坦、齐泊腾坦、阿曲生坦等低分子化合物，至今仍无通过抗原识别内皮素受体a的胞外结构域的单克隆抗体药物的报告。22.在本说明书中公开的术语“抗原”是指任意的天然或合成的免疫原性物质，例如蛋白质、肽或半抗原。抗原可以为内皮素受体a或其片段(例如，胞外结构域)。23.在本说明书中公开的“表位”是本发明所属
技术领域：
：的术语，是指能够与抗体特异性结合的抗原的局部区域。例如，表位可以为多肽的相邻氨基酸(线性或相邻表位)，或者表位可以为将多肽或多肽的两个以上非相邻区域相合(构象性、非线性、不连续或者非相邻表位)。由相邻氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时仍能保持，但并不总是如此，经过3次折叠形成的表位会在变性溶剂处理时丧失。表位通常包括具有独特空间立体结构的至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或20个氨基酸。通过给定的抗体结合表位的方式来决定表位的方法(即，表位作图)已是本领域公知的，例如，包括免疫印迹及免疫沉淀分析，在本说明书中，测试与重叠或相邻肽(例如，通过内皮素受体a)的给定的抗体(例如，抗‑内皮素受体a抗体)之间的反应性。决定表位的空间立体结构的方法包括本领域的技术及本说明书中提及的方法，例如，包括x射线结晶学、二维核磁共振及fidx‑ms(例如，参照epitopemappingprotocolsinmethodsinmolecularbiology，vol.66，g.e.morris，ed.(1996))。24.在特定具体例中，与抗体结合的表位可以通过例如与核磁共振(nmr)分光学、x射线衍射结晶学研究、酶联免疫吸附测定(elisa)分析、质谱法结合的氢/重氢交换(例如，液相色谱电喷雾质谱法)、基于阵列的低聚肽扫描分析和/或突变诱导作图(例如指定部位突变诱导作图)来决定。在x射线结晶学的情况下，可以使用本领域公知的方法中的任意方法来实现结晶化(例如，参照giegeretal，(1994)actacrystallogrdbiolcrystallogr50(pt4)：339‑350；mcphersona(1990)eurjbiochem189:1‑23；chayene(1997)structure5：1269‑1274；mcphersona(1976)jbiolchem251:6300‑6303)。抗体：抗原结晶可以通过已知的x射线衍射技术来研究，可以使用x‑plor(通过yaleuniversity，1992，molecularsimulations，inc.发布；例如，参照methenzymol(1985)volumes114&115，edswyckoffhwetal；u.s.2004/0014194)及buster(bricogneg(1993)actacrystallogrdbiolcrystallogr49(pt1)：37‑60；bricogneg(1997)methenzymol276a:361‑423，edcartercw；roversipetal，(2000)actacrystallogrdbiolcrystallogr56(pt10)：1316‑1323)之类的计算机软件确认。突变诱导作图研究可以使用本领域公知的任意方法进行。有关包括丙氨酸扫描突变诱导技术在内的突变诱导技术的内容，可以参照例如champemetal，(1995)jbiolchem270：1388‑1394以及cunninghambc&wellsja(1989)science244：1081‑1085。25.术语“表位作图”是指确认用于识别抗体‑抗原的分子决定基的过程。26.关于两个以上的抗体，术语“与相同的表位结合”是指当通过给定的方法决定时，抗体与氨基酸残基的相同片段的结合。抗体决定本说明书中提及的抗体是否与“内皮素受体a上相同的表位”结合的技术，例如，表位作图方法，包括例如有关提供相关表位的原子分解能的抗原：抗体复合物结晶的x射线分析及氢/重氢交换质谱法(hdx‑ms)。其他方法是监测有关抗原片段或抗原突变的变体与抗体的结合，在此情况下，在抗原序列中，因氨基酸残基的变形引起的结合的丧失将主要考虑为表位成分的表征。并且，可以使用用于表位作图的计算机组合方式方法。这些方法依赖于能够从组合方式噬菌体展示肽文库中亲和性分离特定短肽的感兴趣的抗体的能力。预计具有相同的vh及vl或相同的cdr1、cdr2及cdr3序列的抗体能够与相同的表位结合。[0027]“对与靶标结合的与其他抗体竞争”抗体是指抑制(部分或完全)其他抗体与靶标结合的抗体。两种抗体是否对与靶向的结合相互竞争，即，一种抗体是否抑制剩余抗体与靶标的结合及其程度，可以使用公知的竞争实验来决定。在特定具体例中，抗体对其他抗体与靶标的结合进行竞争，对其他抗体与靶标的结合抑制至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。抑制或竞争的水平可以根据抗体是否为“封闭抗体”(即，首先与靶标一同培养的冷性抗体)而不同。竞争分析可以按照例如edharlowanddavidlane，coldspringharbprotoc；2006；doi:10.1101/pdb.prot4277或edharlowanddavidlane，coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，ny，usa1999“usingantibodies”的第11章公开的内容执行。竞争抗体与相同表位、重叠表位或相邻表位(例如，通过空间位阻证明的)结合。[0028]其他竞争结合分析包括固相直接或间接放射性免疫分析(ria)、固相直接或间接酶免疫分析(eia)、竞争夹心法(参照stahlietal，methodsinenzymology9:242(1983))；固相直接生物素‑亲和素酶免疫分析(参照kirklandetal，j.immunol.137：3614(1986))；固相直接标记分析、固相直接标记三明治分析(参照harlowandlane，antibodies：alaboratorymanual，coldspringharborpress(1988))；使用i‑125标记的固相直接标记放射性免疫分析(参照moreletal.，mol.immunol.25(1)：7(1988))；固相直接生物素‑亲和素酶免疫分析(参照cheungetal，virology176：546(1990))以及直接标记放射性免疫分析(参照moldenhaueretal，scand.j.immunol.32：77(1990))。[0029]“双特异性”或“双功能性”抗体是指具有两个不同的重链/轻链对和两个不同结合部位的人工杂交抗体。双特异性抗体可以通过包括多个杂交瘤的融合或多个fab'片段的结合在内的多种方法来生成(参照例如songsivilai&lachmann，clin.exp.immunol.79:315‑321(1990)；kostelnyetal，j.immunol.148，1547‑1553(1992))。[0030]本说明书中提及的“单克隆抗体”是指对特定表位表现出单一结合特异性及亲和性的抗体或所有抗体对特定表位表现出单一结合特异性及亲和性的抗体的组合。由此，术语“人类单克隆抗体”是指表现出单一结合特异性的，具有源自人类种系免疫球蛋白序列的可变区及恒定区的抗体或抗体组合物。在一具体例中，人类单克隆抗体可以通过具有包括融合于永生化细胞的人类重链转移基因及轻链转移基因在内的基因组的转基因非人类动物生成，例如通过包含从转基因小鼠获取的b细胞的杂交瘤来生成。[0031]本说明书中提及的“重组人类抗体”包括通过重组方法制备、表达、生成或分离的所有人类抗体有，例如，(a)对人类免疫球蛋白基因进行转基因或转染色体的动物(例如，小鼠)或从使用其制备的杂交瘤分离的抗体；(b)从通过转化来表达抗体的宿主细胞分离的抗体，例如从转染瘤中分离的抗体；(c)从重组、组合方式人类抗体文库中分离的抗体；以及(d)通过伴随人类免疫球蛋白基因序列与其他dna序列的拼接的任意的其他方法制备、表达、生成或分离的抗体。上述重组人类抗体包括可变区及恒定区，它们利用通过种系基因编码的特定人类种系免疫球蛋白序列，包括例如抗体成熟化期间发生的后续重排及突变。正如本领域公知的(参照例如lonberg(2005)naturebiotech.23(9)：1117‑1125)，可变区包含抗原结合区域，通过重排的多种基因编码来对外来的抗原形成特异性的抗体。除了重排，可变区为了增加对外来抗原的抗体亲和性，可以通过多个单个氨基酸变化来进一步变形(体细胞突变或超突变)。恒定区将在对抗原的追加反应中变化(即，同种型转换)。因此，与抗原反应来编码轻链及重链免疫球蛋白多肽的重排并体细胞突变的核酸分子虽然无法与母核酸分子具有序列的同一性，但代之以实际上的相同或类似(即，至少具有80％的同一性)。[0032]“人类”抗体(humab)是指框架和cdr区域都具有源自人类种系免疫球蛋白序列的可变区的抗体。并且，在抗体包含恒定区的情况下，恒定区也源自人类种系免疫球蛋白序列。在本说明书中公开的抗体可以包含不通过人类种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过试管内随机或部位‑特异性突变诱导或者通过生物体内体细胞突变导入的突变)。但是，在本说明书中公开的“人类抗体”不包括在人类框架序列上移植源自小鼠之类的其他哺乳动物的种系的cdr序列的抗体。术语“人类”抗体及“完全人类”抗体可用作同义词。al，(1989)nature341：544‑546)；以及(vi)分离的互补决定区(cdr)，或者(vii)可以通过合成接头选择性地连接的两个以上的分离的cdr的组合。并且，虽然fv片段、vl及vh中的2个区域可以通过单独的基因编码，但使用重组方法，可以通过形成能够使vl和vh区域成对来形成一价分子(单链fv(scfv))的单一蛋白质链的合成接头来连接(参照birdetal，(1988)science242:423‑426以及hustonetal，(1988)proc.natl.acad.sci.usa85：5879‑5883)。也尝试将上述单链抗体包括于术语抗体的“抗原‑结合片段”中。上述抗体片段可以通过本发明所属
技术领域：
：的普通技术人员使用公知的现有技术来获得，片段通过与无损伤抗体相同的方式对其有用性进行筛选。抗原‑结合片段可以通过重组dna技术，或者无损伤免疫球蛋白的酶或化学切割来生成。[0042]为了形成重链(heavychain)，vh区域或一个或多个的cdr可以与不变区域连接。并且，为了形成轻链(lightchain)，vl区域或一个或多个的cdr可以与不变区域连接。全长(fulllength)重链及全长轻链连接构成全长抗体。[0043]在本说明书中，术语“可变区”或“可变区域”可以相互交换使用。典型的可变区是指抗体的一部分，通常是指轻链或重链的一部分，典型的是指在成熟的重链中的约氨基‑末端110个至120个氨基酸以及在成熟的轻链中的约90个至115个氨基酸，它们中的每个抗体的序列在广范围内不同，从而特化特定抗体对特定抗原的结合及特异性。序列的可变性集中于称为互补决定区的区域(重链：hcdr1、hcdr2及hcdr3，轻链：lcdr1、lcdr2及lcdr3)，在可变区中得到高度保存的区域称为框架区(fr)。[0044]轻链及重链的cdr主要承担抗体与抗原的互补作用及特异性。在特定具体例中，可变区为人类可变区。在特定具体例中，可变区包含啮齿类或鼠类cdr和人类框架区。在特定具体例中，在特定具体例中，可变区为灵长类(例如，非人灵长类)可变区。在特定具体例中，可变区包含啮齿类或鼠类cdr和灵长类(例如，非人灵长类)框架区。[0045]在本说明书中，当术语“重链”与抗体一同使用时，指任意不同的类型，例如以恒定区的氨基酸序列为基础，可以指阿尔法(α)、德尔塔(δ)、厄普西隆(ε)、伽马(γ)及谬(μ)，它们分别是igg的子类，例如产生包含iggl、igg2、igg3及igg4的抗体的iga、igd、ige、igg以及igm类型。[0046]本说明书中提及的术语“轻链”是指在与抗体一起使用的情况下的任意类型，例如基于恒定区的氨基酸序列的卡帕(κ)或兰布达(λ)。轻链氨基酸序列在本领域已众所周知。在特定具体例中，轻链为人类轻链。[0047]术语“vl”及“vl区域”可以互换使用，是指抗体的轻链可变区。[0048]术语“vh”及“vh区域”可以互换使用，是指抗体的重链可变区。[0049]在本说明书中，术语“恒定区”或“不变区域”可以互换使用。恒定区虽不伴随与抗体部分的结合，例如不直接伴随抗体和抗原的结合，但却是能够表现出与fc受体相互作用之类的多种效应功能的轻链和/或重链的羧基末端部分。比起免疫球蛋白可变区，免疫球蛋白分子的恒定区通常具有更保守的氨基酸序列。[0050]“fc区域”(能够片段结晶化的区域)，“fc区域”或“fc”是指包括与位于免疫系统的多种细胞(例如，效应器细胞)上的fc受体或经典补体系统的第一成分(clq)结合的，介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合的抗体的重链的c‑末端区域。因此，fc区域包括除第一恒定区免疫球蛋白区域(例如，ch1或cl)以外的抗体的恒定区。在igg、iga及igd抗体同种型中，fc区域包含源自抗体的两个重链的第二不变区域(ch2)及第三不变区域(ch3)的两个相同的蛋白质片段；igm及ige的fc区域在各多肽链中包含3个重链不变区域(ch区域2‑ch区域4)。在igg的情况下，fc区域包含免疫球蛋白区域cγ2及cγ3，还有cγ1与cγ2之间的铰链。虽然免疫球蛋白重链的fc区域的边界使可变的，但人类igg重链fc区域通常定义为从位于c226或p230的氨基酸残基(或者这两个氨基酸之间的氨基酸)到重链的羧基‑末端延伸的区域，其中，根据在kabat提及的eu索引编号。人类iggfc区域的ch2区域从大约氨基酸231延伸到大约氨基酸340，ch3区域在fc区域中位于cm区域的c‑末端侧，即，igg从大约氨基酸341延伸到大约氨基酸447。本说明书中提及的fc区域可以为包括任意的同种异型变体在内的自生序列fc或变体fc(例如，非自然生成fc)。并且，fc还可以为又称为“fc融合蛋白”(例如，抗体或免疫粘附体)的“包含fc区域的结合蛋白”之类的fc‑包含蛋白多肽。[0051]“自生序列fc区域”或“自生序列fc”包含与在自然中发现的fc区域的氨基酸序列相同的氨基酸序列。自生序列人类fc区域不仅包括：自生序列人类igg1fc区域；自生序列人类igg2fc区域；自生序列人类igg3fc区域；以及自生序列igg4fc区域，还包括它们自然发生的变体。自生序列fc包括fes的多种同种异型(例如，jefferisetal，(2009)mabs1:1；vidarssong.etal.，frontimmunol.5:520)[0052]为了去除一个以上的效应功能，恒定区可以通过例如重组技术来操作。“效应功能”是指抗体fc区域与fc受体或配体的相互作用，或者作为上述相互作用的结果的生化现象。例示性的“效应功能”包括clq结合、补体依赖性细胞毒性(cdc)、fc受体结合、fcγr‑介导效应功能，例如adcc及抗体依赖性细胞‑介导吞噬作用(adcp)及细胞表面受体(例如，b细胞受体；bcr)的减量调节。这样的效应功能通常需要能够与结合区域(例如，抗体可变区)组合的fc区域。因此，术语“无fc功能的恒定区”包括减少通过fc区域介导的一个以上的效应功能或者干脆没有效应功能的恒定区。[0053]抗体的效应功能可以通过不同的接近法来减少或避免。抗体的效应功能可以使用缺少fc区域的抗体片段(例如fab、f(ab')2、单链fv(scfv)，或者由单体vh或vl区域构成的sdab之类的片段)来减少或避免。并且，可以通过去除在fc区域中与特定残基结合的糖来生成所谓无糖基化(aglycosylated)的抗体，这样可以在保留fc区域的其他有价值的属性(例如，延长的半衰期及异二聚体化)的情况下减少抗体的效应功能。无糖基化的抗体可以通过例如附着有糖的残基的缺失或变更、通过酶的去糖、在糖基化抑制剂存在的条件下培养的细胞中的抗体的生成或者在不能将蛋白质糖基化的细胞(例如，细菌宿主细胞)中的抗体表达来生成。其他接近法为从具有减少了的效应功能的igg子类中利用fc区域，例如，igg2及igg4抗体的特征在于，具有比igg1及igg3更低水平的fc效应功能。在fc部分的ch2区域中，与铰链区域距离非常近的残基承担抗体的效应功能，这对先天性免疫系统效应器细胞上的clq(补体)及igg‑fc受体(fcγr)来说是包含相当重叠的结合部位(vidarssong.etal.，frontimmunol.5:520，2014)。因此，减少或没有fc效应功能的抗体可以通过生成例如包含来自igg4同种型的igg抗体的ch2区域与来自igg1同种型的igg抗体的ch3区域的嵌合fc区域，或者包含来自igg2的铰链区域与来自igg4的ch2区域的嵌合fc区域(参照例如lauc.etal，j.immunol.191：4769‑4777(2013))，或者变更的fc效应功能，例如具有能够带来减少或消除fc功能的突变的fc区域来制备。具有突变的上述fc区域在本领域是公知的(参照例如韩国公开专利第10‑2018‑0113904号)。[0054]“铰链”、“铰链区域”、“铰链区”或“抗体铰链区”是指连接ch1区域与ch2区域的重链恒定区的区域，包含铰链的上部、中心及下部部分(rouxetal，j.immunol.1998161：4083)。铰链提供抗体的结合区域与效应器区域之间的多种水平的灵活性，并且，在两个重链恒定区之间提供用于分子间二硫键合的部位。本说明书中提及的铰链对所有igg同种型来说始于glu216止于gly237(rouxetal，1998jimmunol161：4083)。野生型igg1、igg2、igg3及igg4铰链的序列是本领域公知的(参照例如kabateadetal，(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，5thedition，u.s.departmentofhealthandhumanservices，nihpublicationno.91‑3242；vidarssong.etal.，frontimmunol.5:520(线上公开2014‑10‑20))。[0055]术语“ch1区域”是指连接重链不变区域的铰链与可变区的重链恒定区。本说明书中提及的ch1区域始于a118止于v215。术语“ch1区域”不仅包括野生型ch1区域，还包括自然存在的其变体(例如，同种异型)。igg1、igg2、igg3及igg4的ch1区域序列(包括野生型及同种异型)在本领域是公知的(参照例如kabateaetal，(1991)同上，及vidarssong.etal.，frontimmunol.5:520(线上公开2014‑10‑20))。[0056]术语“ch2区域”是指连接重链不变区域的ch3区域与铰链的重链恒定区。本说明书中提及的ch2区域始于p238止于k340。术语“ch2区域”不仅包括野生型ch2区域，还包括自然存在的其变体(例如，同种异型)。igg1、igg2、igg3及igg4的ch2区域序列(包括野生型及同种异型)在本领域是公知的(参照例如kabateaetal，(1991)同上，及vidarssong.etal.，frontimmunol.5:520(线上公开2014‑10‑20))。例示性的ch2区域包括具有抗体的生物学活性的ch2区域，例如包括具有变形半衰期和/或减少的fc效应功能的区域的ch2区域(参照美国公开专利公报第20120100140号)。[0057]术语“ch3区域”是指朝向重链不变区域的ch2区域的作为c‑末端的重链恒定区。本说明书中提及的ch3区域始于g341止于k447。术语“ch3区域”不仅包括野生型ch3区域，还包括自然存在的其变体(例如，同种异型)。igg1、igg2、igg3及igg4的ch3区域序列(包括，野生型及同种异型)在本领域是公知的(参照例如kabateaetal，(1991)同上，及vidarssong.etal.，frontimmunol.5:520(线上公开2014‑10‑20))。例示性的ch3区域包括具有生物学活性的ch3区域，例如，包括具有变形半衰期的区域的ch3区域(参照美国公开专利公报第20120100140号)。[0058]本说明书中提及的“同种型”是指通过重链恒定区基因编码的抗体类型(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、igm、iga1、iga2、igd及ige抗体)。[0059]“同种异型”是指在特定同种型中自然发生的具有几个氨基酸差异的变体(例如，jefferisetal，(2009)mabs1：1)。在本说明书中公开的抗体可以具有任意的同种异型。igg1、igg2、igg3及igg4的同种异型在本领域中是公知的(参照例如kabateaetal，(1991)同上；vidarssong.etal.，frontimmunol.5：520(线上公开2014‑10‑20)以及lefrancmp，mabs1:4，1‑7(2009))。[0060]在本说明书中，语句“识别抗原的抗体”及“对抗原具有特异性的抗体”与术语“与抗原特异性结合的抗体”互换使用。[0061]在本说明书中，“分离的抗体”是指实际上没有具有不同的抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，与内皮素受体a特异性结合的分离的抗体除内皮素受体a外，实际上没有与其他抗原特异性结合的抗体)。但是，与内皮素受体a的表位特异性结合的分离的抗体与对来自不同种系的其他内皮素受体a具有交叉反应性。[0062]在本说明书中公开的术语“与……特异性结合”、“特异性识别……”、“特异性结合”、“选择性结合”及“选择性地与……结合”是与抗体相关的相似术语，是指与抗原(例如，表位或免疫复合物)结合的分子(例如，抗体)，上述结合是与本发明所属
技术领域：
：的普通技术人员的理解一致的。[0063]抗体通常通过以10‑5至10‑11m以下的解离常数(kd)反映的高亲和性与同族抗原特异性结合。大于约10‑4m的任意的kd通常看做非特异性结合的表现。本说明书中提及的与抗原“特异性结合”的抗体是指以高亲和性与抗原结合的抗体，以及虽然实际上与相同的抗原结合，但不以高亲和性与不相关的抗原结合的抗体，所谓高亲和性，是指例如在使用规定的抗原通过免疫分析技术决定时，具有10‑7m以下的kd，优选地，具有10‑8m以下的kd，更优选地，具有10‑9m以下的kd，最优选地，具有10‑8m至10‑10m以下的kd。[0064]根据本发明的优选实例，上述单克隆抗体或其片段在重链可变区中包含序列表中序列38的cdr1、序列表中序列39的cdr2，在轻链可变区在序列表中序列40的cdr1、序列表中序列41的cdr2以及序列表中序列42的cdr3。[0065]根据本发明的优选实例，上述单克隆抗体或其片段的重链可变区的cdr3为序列表中序列43的氨基酸序列。[0066]根据本发明的优选实例，上述单克隆抗体或其片段的重链可变区的cdr3为在选自由序列表中序列43中的第4位、第7位、第9位、第10位、第11位、第12位、第13位以及第14位氨基酸组成的组中的位置包含突变的序列。[0067]根据本发明的优选实例，上述重链可变区的cdr3在序列表中序列43中包含如下突变：第4位氨基酸被p(缬氨酸)置换；第7位氨基酸被l(亮氨酸)置换；第9位氨基酸被v(缬氨酸)置换；第10位氨基酸被i(异亮氨酸)或h(组氨酸)置换；第11位氨基酸被f(苯丙氨酸)或q(谷氨酰胺)置换；第12位氨基酸被e(谷氨酸)置换；第13位氨基酸被n(天冬酰胺)或c(半胱氨酸)置换；或者14位氨基酸被l(亮氨酸)置换。[0068]根据本发明的优选实例，上述重链可变区的cdr3为选自由序列表中序列44、序列表中序列45、序列表中序列46、序列表中序列47、序列表中序列48、序列表中序列49、序列表中序列50、序列表中序列51、序列表中序列52、序列表中序列53以及序列表中序列54组成的组中的氨基酸序列。[0069]根据本发明的优选实例，上述轻链可变区包含序列表中序列55的氨基酸序列。[0070]根据本发明的优选实例，上述重链可变区包含选自由序列表中序列56、序列表中序列57、序列表中序列58、序列表中序列59、序列表中序列60、序列表中序列61、序列表中序列62、序列表中序列63、序列表中序列64、序列表中序列65、序列表中序列66以及序列表中序列67组成的组中的氨基酸序列。[0071]根据本发明的再一实施方式，本发明提供编码上述单克隆抗体或其片段的核酸分子、包含上述核酸分子的载体或包含上述载体的宿主细胞。[0072]本发明的核酸分子可以为分离的或重组的，不仅包括单链及双链形态的dna及核糖核酸(rna)，还包括对应的互补序列。在“分离的核酸”为从天然生成的源头分离的核酸的情况下，为从存在于核酸被分离的个体的基因组中的周边基因序列中分离的核酸。在从模具中通过酶或化学方法合成的核酸，例如聚合酶链式反应(pcr)产物、互补dna(cdna)分子或寡核苷酸的情况下，可以理解为通过上述过程生成的核酸被分离的核酸分子。分离的核酸分子可以表现为单独片段的形态或更大的核酸构建物的成分的核酸分子。当核酸与其他核酸序列通过功能性关系配置时，“可操作的连接”。例如，前序列或分泌前导(leader)的dna在表达为分泌多肽之前的形态的前蛋白(preprotein)的情况下，与多肽的dna可操作的连接，启动子或增强子在给多肽序列的转录带来影响的情况下，与编码序列可操作的连接，或者核糖体结合部位在为促进编译而配置时与编码序列可操作的连接。通常，“可操作的连接”是指将要连接的dna序列进入相邻的位置，在分泌前导的情况下，是指相邻并存在于同一阅读框内。但是，增强子不需要位于相邻的位置。连接在便利的限制酶部位通过结扎来实现。若没有这样的部位，可以根据常用的方法使用合成寡核苷酸适配体或接头。[0073]在本说明书中，术语“载体”是指用于向能够复制核酸序列的细胞内导入的能够插入核酸序列的传递体。核酸序列可以为外源性(exogenous)或异种(heterologous)。载体可以为质粒、粘粒以及病毒(例如，噬菌体)，但不限定于此。本发明所属
技术领域：
：的普通技术人员可以通过标准的重组技术构建载体(maniatis，etal.，molecularcloning，alaboratorymanual，coldspringharborpress，coldspringharbor，n.y.，1988以及ausubeletal.，in:currentprotocolsinmolecularbiology，john，wiley&sons，inc，ny，1994等)。[0074]在本说明书中，术语“表达载体”是指包含编码被转录的基因产物中的至少一部分的核酸序列的载体。在部分情况下，此后rna分子被编译为蛋白质、多肽或肽。表达载体中可以包含多种调节序列。在载体及表达载体中，与调节转录及翻译的调节序列一起，还可以包含提供其他功能的核酸序列。[0075]在本说明书中，术语“宿主细胞”包括真核生物及原核生物，是指能够进行可以复制上述载体或者可以表达通过载体编码的基因的任意转化的生物。宿主细胞可以通过上述载体转染(transfected)或转化(transformed)，这是指将外源性核酸分子传递或导入宿主细胞内的过程。[0076]优选地，本发明的宿主细胞可以为细菌(bacteria)细胞、cho细胞、hela细胞、hek293细胞、bhk‑21细胞、cos7细胞、cop5细胞、a549细胞、nih3t3细胞等，但不限定于此。[0077]根据本发明的另一实施方式，本发明提供包含上述抗体或其片段、上述核酸分子或上述载体的组合物。[0078]根据本发明的优选实例，本发明的组合物为用于治疗或预防高血压或癌症的药剂学组合物。[0079]本发明的药剂学组合物包含：(a)上述单克隆抗体或其片段、上述核酸分子或包含上述核酸分子的载体；以及(b)药学上可接受的载体。[0080]根据本发明还有一实施方式，本发明提供癌症或高血压的治疗方法，包括向对象(subject)给药药剂学上有效量的上述单克隆抗体或其片段、核酸分子或载体的步骤。[0081]本发明的又一实施方式，本发明提上述单克隆抗体或其片段、核酸分子或载体在制备用于治疗癌症或高血压的药剂学组合物中的用途。[0082]在本说明书中，“给药”是指使用本发明所属
技术领域：
：的普通技术人员公知的多种方法及传递系统中的任意方式，物理性地向对象导入治疗剂或包含治疗剂的组合物。用于本说明书中提及的抗体的优选给药途径包括静脉内、腹腔内、肌肉内、皮下、脊柱或其他胃肠外给药途径，例如通过注射或注入的途径。在本说明书中公开的“胃肠外给药”是指肠道及局部给药以外的其他给药方式，通常是指通过注射的给药方式，包括静脉内、腹腔内、肌肉内、动脉内、脊髓腔内、淋巴内、病灶内、囊内、眼窝内、心脏内、皮内、经由器官、皮下、皮肤底部、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外及胸骨内注射及注入，还包括生物体内电穿孔，但不限定于此。并且，本说明书中提及的抗体还可以通过非‑胃肠外给药途径，例如局部、上皮或粘膜给药途径给药，例如可以通过鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或外用途径给药。给药可以通过一次给药、多次给药和/或经过一次以上的延长的期间进行。[0083]本说明书公开的术语“治疗……”"、“治疗……的”及“治疗”是指以与疾病相关的症状、并发症、状态或生化学指标的进行、发生、严重度或复发的逆转、减轻、缓解、阻碍或延迟或预防的目的，对对象进行的，或者向对象给药活性剂的任意种类的介入或过程。治疗可以对具有疾病的对象或不具有疾病的对象(例如，为了预防)进行。[0084]本发明所要预防或治疗的癌症的种类包括白血病(leukemias)及急性淋巴细胞白血病(acutelymphocyticleukemia)、急性非淋巴细胞白血病(acutenonlymphocyticleukemias)、慢性淋巴细胞白血病(chroniclymphocyticleukemia)、慢性粒细胞白血病(chronicmyelogenousleukemia)、霍奇金淋巴瘤(hodgkin'sdisease)、非霍奇金淋巴瘤(non‑hodgkin'slymphomas)及多发性骨髓瘤(multiplemyeloma)等之类的淋巴瘤(lymphomas)、脑肿瘤(braintumors)、胶质母细胞瘤(glioblastoma)、神经母细胞瘤(neuroblastoma)、横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)、视网膜母细胞瘤(retinoblastoma)、肾母细胞瘤(wilmstumor)、骨肿瘤(bonetumors)及软组织肉瘤(soft‑tissuesarcomas)等之类的儿童实体瘤(childhoodsolidtumors)、肺癌(lungcancer)、乳腺癌(breastcancer)、前列腺癌(prostatecancer)、尿道癌(urinarycancers)、子宫癌(uterinecancers)、口腔癌(oralcancers)、胰腺癌(pancreaticcancer)、黑色素瘤(melanoma)及其他皮肤癌(skincancers)、胃癌(stomachcancer)、结肠癌(coloncancer)、卵巢癌(ovariancancer)、脑肿瘤(braintumors)、肝癌(livercancer)、喉癌(laryngealcancer)、甲状腺癌(thyroidcancer)、食管癌(esophagealcancer)及睾丸癌(testicularcancer)等之类的成人常见的实体瘤(commonsolidtumors)，但不限定于此，可以通过给药治疗多种癌症。[0085]在本说明书中，所要给药上述单克隆抗体或其片段、上述核酸分子或包含上述核酸分子的载体或包含其的药剂学组合物的对象(subject)包括人类或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊柱动物，例如哺乳类及非哺乳类，例如非人灵长类、羊、狗、牛、鸡、两栖类、爬虫类等。[0086]本发明的药剂学组合物包含的药剂学上可接受的载体包括制剂时通常使用的乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、海藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油等，但不限定于此。除上述成分外，本发明的药剂学组合物还可以包含润滑剂、湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂、保存剂等。适当的药剂学上可接受的载体及制剂详细记载于remington'spharmaceuticalsciences(19thed.，1995)。[0087]本发明的药剂学组合物可经口服或胃肠外给药的方式给药，优选地，可胃肠外给药，例如通过静脉内注入、局部注入及腹腔注入等方式给药。[0088]本发明的药剂学组合物的适当给药量根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病理状态、饮食、给药时间、给药途径、代谢速度及反应敏感性之类的因素而多种多样，具有普通熟练度的医生可以轻松决定及处方对预期治疗或预防有效的给药量。根据本发明的优选实例，本发明的药剂学组合物一日给药量为0.0001‑100mg/kg。[0089]本发明的药剂学组合物可以根据本发明所属
技术领域：
：的普通技术人员易于实施的方法，利用药剂学上可接受的载体和/或赋形剂来制剂化，可以制备为单位容量形态或者放入多容量容器内来制备。在此情况下，剂型可以为以油或水性媒介中的溶液、悬浮液或乳化液形态，或者也可以为提取剂、粉剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂形态，还可以包含分散剂或稳定剂。[0090]本发明的药剂学组合物可以作为单独的疗法来使用，也可以与其他常规的化学疗法或放射疗法一同使用，在利用这样的联合疗法的情况下，可以更为有效地治疗癌症。可以与本发明的组合物一同使用的化疗制剂包括顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、甲基苄肼(procarbazine)、氮芥(mechlorethamine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)，美法仑(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、双硫丹(bisulfan)、亚硝基脲(nitrosourea)、放线菌素d(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、thp‑阿霉素(doxorubicin)、博来霉素(bleomycin)、普卡霉素(plicomycin)、系列霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、他莫昔芬(tamoxifen)、紫杉醇(taxol)、转铂(transplatinum)、5‑氟尿嘧啶(5‑fluorouracil)、长春新碱(vincristin)、长春花素(vinblastin)以及甲氨蝶呤(methotrexate)等。能够与本发明的组合物一同使用的放射疗法由x射线照射及γ射线照射等。[0091]根据本发明的又一实施方式，本发明提供一种样品中包含的内皮素受体a的定量方法，包括使用上述单克隆抗体或其片段进行处理的步骤。[0092]由于本发明的抗体或其片段与内皮素受体a特异性结合，因此利用其能够正确测定样品中包含的内皮素受体a的量。[0093]根据本发明的又一实施方式，本发明提供一种提供用于诊断由内皮素受体a的过表达引起的疾病的信息的方法，包括如下步骤：步骤(a)，获取从受试者向体外分离的样品；步骤(b)，使用上述单克隆抗体或其片段处理上述样品；以及步骤(c)，确认上述受试者的样品中包含的内皮素受体a的表达量是否比正常组样品中包含的内皮素受体a的表达量高。[0094]内皮素受体a通过与作为配体的内皮素‑1的结合来引起血管收缩作用(naturereviewsdrugdiscovery，2011，vol.10，47)；在膀胱癌、肺癌、卵巢癌、肾癌、结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、子宫癌、横纹肌肉瘤、胶质母细胞瘤等多种癌症中过表达，从而与癌细胞的增殖、移动、浸透、转移、血管新生等癌症的主要进行过程直接相关(naturereviewcancer，2013，vol.13，637)，因此，可以通过将上述内皮素受体a的表达量与正常人进行比较来提供用于诊断由内皮素受体a的过表达引起的疾病的信息。[0095]根据本发明的优选实例，上述由内皮素受体a的过表达引起的疾病为癌症或高血压。[0096]根据本发明的又一实施方式，本发明提供包含上述单克隆抗体或其片段的内皮素受体a定量试剂盒。[0097]本发明的定量试剂盒可以通过抗原抗体结合反应来分析对上述抗体的抗原，从而可以定量内皮素受体a的量，优选地，上述抗原抗体结合反应选自由常规的酶联免疫吸附测定(elisa，enzyme‑linkedimmunosorbentassay)、放射免疫分析(ria，radioimmnoassay)、夹心法(sandwichassay)、聚丙烯酰胺凝胶相的蛋白印迹法(westernblot)、免疫印迹分析(immunoblotassay)以及免疫组织化学染色方法(immnohistochemicalstaining)组成的组中，但不限定于此。[0098]用于抗原‑抗体结合反应的固定体可以使用选自由硝酸纤维素膜、聚偏氟乙烯(pvdf)膜、聚乙烯(polyvinyl)树脂或由聚苯乙烯(polystyrene)树脂合成的孔板(wellplate)及由玻璃制成的载玻片(slideglass)组成的组中的固定体，但不限定于此。[0099]优选地，上述第二抗体使用发生显色反应的普通的显色剂标记，可以使用选自由辣根过氧化物酶(hrp，horseradishperoxidase)、碱性磷酸酶(alkalinephosphatase)、胶体金(coloidgold)、异硫氰酸荧光素(fitc，聚l‑赖氨酸‑荧光素异硫氰酸酯(polyl‑lysine‑fluoresceinisothiocyanate))、罗丹明‑b‑异硫氰酸酯(ritc，rhodamine‑b‑isothiocyanate)等荧光物质(fluorescein)及色素组成的组中的任意标记体。优选地，诱导显色的基质根据标记体来使用，优选地，使用选自3,3',5,5'‑四甲基联苯胺(tmb，3,3',5,5'‑tetramethylbezidine)、2,2'‑叠氮基‑双(3‑乙基苯并噻唑啉‑6‑磺酸)(abts，2,2'‑azino‑bis(3‑ethylbenzothiazoline‑6‑sulfonicacid))以及邻苯二胺(opd，ophenylenediamine)组成的组中的一种，但不限定于此。[0100]发明的效果[0101]概要本发明的特征及优点如下：[0102](i)本发明提供一种单克隆抗体或其片段，通过抗原识别内皮素受体a的胞外结构域并与之特异性结合。[0103](ii)并且，本发明提供提供一种用于预防或治疗癌症或高血压的药剂学组合物，包含上述单克隆抗体或其片段，上述核酸分子或上述载体。[0104](iii)本发明的单克隆抗体表现出抑制内皮素受体a的信号传导过程的功能，并可以利用该功能有效地用作对于内皮素受体a相关的高血压或癌症的治疗剂。附图说明[0105]图1示出构建亲和力成熟噬菌体抗体文库的结果。[0106]图2示出与内皮素受体a选择性结合的发掘抗体的序列。[0107]图3示出表达的igg的结构。[0108]图4示出在动物细胞中发现的发掘抗体的纯化结果。[0109]图5为示出在表达内皮素受体a的作为动物细胞的cho‑k1细胞中200nm浓度的发掘抗体对由10nm的内皮素‑1诱导的信号传导的抑制能力的曲线图。[0110]图6为示出在过表达内皮素受体a的作为结肠癌细胞株的ht‑29细胞中200nm浓度的发掘抗体对由10nm的内皮素‑1诱导的信号传导的抑制能力的曲线图。[0111]图7为示出在过表达内皮素受体a的作为结肠癌细胞株的hct‑116细胞中200nm浓度的发掘抗体对由10nm的内皮素‑1诱导的信号传导的抑制能力的曲线图。[0112]图8为示出5种前导(lead)抗体对活性型人类内皮素受体a与小鼠内皮素受体a之间的交叉结合能力的曲线图。[0113]图9为示出发掘抗体对过表达内皮素受体a的作为结肠癌细胞株的hct‑116的结肠癌细胞增殖抑制效果的曲线图。[0114]图10为5种前导抗体对过表达内皮素受体a的作为结肠癌细胞株的ht‑29及hct‑116的结肠癌细胞增殖抑制效果的曲线图。[0115]图11为示出5种前导抗体对通过结肠癌细胞株ht‑29制备的异种移植模型的结肠癌生长抑制效果的曲线图。[0116]图12示出5种前导抗体的分子排阻色谱‑高效液相色谱(size‑exclusionchromatography(sec)‑hplc)的分析结果。[0117]图13示出5种前导抗体的糖链结构分析结果。[0118]图14示出5种前导抗体的重量分析结果。[0119]图15示出5种前导抗体的热稳定性分析结果。[0120]图16为示出根据发掘抗体处理的内皮素受体a信号传导过程的产物erk、akt的水平减少的结果。具体实施方式[0121]以下，通过实施例更为详细地说明本发明。这些实施例仅用于更为具体地说明本发明，本发明所属
技术领域：
：的普通技术人员应该明了的是，根据本发明的要旨，本发明的范围不受这些实施例的限制。[0122]实施例[0123]实施例1.利用内皮素受体a特异性结合抗体克隆序列(ag8)构建噬菌体抗体文库[0124]为了以发掘的内皮素受体a特异性结合抗体(ag8，韩国授权专利第10‑2014383号)序列为基础来制作用于发掘对抗原的结合力和功效得到提高的抗体文库，通过制作利用简并nnk密码子的亲和力成熟(affinitymaturation)文库来使用全部20种氨基酸随机置换已知在抗原‑抗体结合中起到重要作用的互补决定区(cdr，complementarity‑determiningregions)中的抗体的重链(heavychain)的第cdr3序列区间的13个氨基酸序列。参照manfredtreetz&jose′danielcarballeira的论文(manfredtreetz&jose′danielcarballeira，iterativesaturationmutagenesis(ism)forrapiddirectedevolutionoffunctionalenzymes，natureprotocols，2(4)，891‑903.)和francesh.arnold&georgegeorgiou的著述(directedevolutionlibrarycreation:methodsandprotocols，humanapress，2010)进行用来制作利用聚合酶链式反应(pcr)技术的抗体文库的dna引物(primer)的设计和dna基因序列扩增及文库的构建。更详细地，在现有专利申请ag8的基因序列中保留形成抗体结构的重链框架与cdr1和cdr2区间的基因序列、轻链的框架与cdr1、cdr2及cdr3序列，只以使用二十余种氨基酸随机置换重链的cdr3序列的方式制备引物，利用基因扩增、克隆技术等制作亲和力成熟抗体文库质粒dna。之后，为了利用噬菌体展示技术筛选对内皮素受体显出选择性结合力的抗体，通过转化在大肠杆菌er2738中制备的亲和度成熟抗体文库的质粒dna来构建亲和力成熟噬菌体抗体文库，制作的抗体文库中随机选择的克隆的基因序列分析结果如图1所示。[0125]表1[0126][0127][0128][0129]在文库制作中使用的简并nnk引物序列(‘5→3’)[0130]表2[0131][0132][0133]根据随机选择制作的文库的序列分析(氨基酸序列)[0134]表3[0135][0136][0137][0138]根据随机选择制作的文库的序列分析(核苷酸序列)[0139]实施例2.转换为发掘的内皮素受体a特异性抗体的全长(full‑length)igg形态，在动物细胞中的表达及纯化[0140]利用制作的抗体文库，利用vcsm13辅助噬菌体(helperphage)生成利用文库的噬菌体后，通过利用磁性的生物淘选方法发掘对细胞外膜具有选择性的抗体来分析基因序列，结果如图2所示。用于发掘抗体的动物细胞表达、纯化及稳定化的免疫球蛋白(igg)形态的转换参照mazor，y的论文(mazor，y.，barnea，i.，keydar，i.，&benhar，i.(2007).antibodyinternalizationstudiedusinganoveliggbindingtoxinfusion.journalofimmunologicalmethods，321(1‑2)，41‑59.)来准备表达载体，并在动物细胞内表达及纯化。这时形成的抗体的结构如图3所示。在动物细胞中表达并利用亲和色谱法纯化为高纯度的蛋白质的sds‑page结果如图4所示。[0141]表4[0142][0143][0144]显出通过内皮素受体a的细胞信号传导的阻碍能力的5种抗体的scfv序列(氨基酸序列)[0145]表5[0146][0147][0148][0149][0150][0151][0152]显出通过内皮素受体a的细胞信号传导的阻碍能力的5种抗体的scfv序列(核苷酸序列)[0153]表6[0154]序列编号名称序列(sequence)38hcdr1gytftss39hcdr2mnpkngnt40lcdr1qginny41lcdr2vgs42lcdr3lqhntyplt[0155]发掘的抗体的重链的cdr1及cdr2序列与轻链的cdr1、cdr2及cdr3序列[0156]表7[0157]序列编号名称序列(sequence)43ag8akdrygsgtygfgmdv44#1nnkakdrygsgtyffgmdv45#2nnkakdrygsgtyqfgmdv46#3nnkakdrygsgtigfgmdv47#4nnkakdrygsgthgfgmdv48#5nnkakdrygsgtygfnmdv49#6nnkakdrygsgtygfcmdv50#7nnkakdrygsgtygfgldv51ef12akdpygsgtygfgmdv52gg12akdrygsgvygfgmdv53fg12akdryglgtygfgmdv54ab9akdrygsgtygegmdv[0158]发掘的抗体的重链的cdr3序列(hcdr3)[0159]表8[0160][0161]发掘的抗体的轻链的可变区(vl)序列[0162]表9[0163][0164][0165]发掘的抗体重链的可变区(vh)序列[0166]实施例3.确认利用表达源自人类的内皮素受体a的动物细胞发掘的内皮素受体a特异性抗体的信号传导过程阻碍能力[0167]为了利用fura‑2‑am荧光染料(thermofisher公司，美国)并通过测定细胞质内ca2+浓度来检测由内皮素‑1引起的内皮素受体a的信号传导过程，分别使用5μm的fura‑2‑am的荧光染料和不同浓度的图5中纯化的抗体处理105个表达内皮素受体a的动物细胞株(etaexpressedcho‑k1stablecellline，genscript公司，美国)后，使用10nm的内皮素‑1诱导信号传导过程后，使用荧光分光光度计(biotek公司，美国)在510nm发射(emission)波长下测定在340nm、380nm的励磁(excitation)波长下的荧光之比(emissionby340nmexcitation/emissionby380nmexcitation)来分析细胞质内ca2+浓度，如图5所示，导出了发掘抗体在细胞内的内皮素受体a的信号传导过程中的阻碍能力效率。[0168]实施例4.发掘的内皮素受体a特异性抗体在结肠癌细胞中的内皮素受体a信号传导阻碍确认及5种前导抗体的选定[0169]从韩国细胞株银行(首尔，韩国)获得作为结肠癌细胞株的ht‑29和hct‑116来使用，使用与实施例3相同的方法确认发掘抗体在ht‑29结肠癌细胞中对内皮素受体a信号传导过程的阻碍能力，导出如图6所示的结果，在hct‑116结肠癌细胞中对内皮素受体a信号传导过程的阻碍能力确认是在与实施例3相同的条件下分别使用25nm、200nm的发掘抗体进行处理，导出如图7所示的结果，从而确认发掘抗体对内皮素受体a的信号传导过程的阻碍能力。如图6和图7所示，确认发掘的抗体在ht‑29和hct‑116结肠癌细胞株中表现出阻碍由内皮素‑1引起的内皮素受体a的信号传导过程的拮抗效应(antagonisticeffect)。如前述图5、图6及图7所示的结果，最终验证并发掘确保了在源自人类的内皮素受体a表达细胞与作为过表达癌细胞的ht‑29、hct‑116中共同表现出阻碍根据内皮素受体a活性的信号传导过程的功效的4种抗体(gg12、ab9、ef12以及fg12)。[0170]实施例5.确认5种前导抗体的人类/小鼠内皮素受体a之间的交叉结合能力[0171]为了开发前导抗体(ag8、ab9、ef12、fg12及gg12)的药品，为了选定适当的动物模型，比较分析其他种系的内皮素受体a胞外结构域序列与人类内皮素受体a胞外结构域。分析结果，小鼠的内皮素受体a在作为胞外结构域的n‑末端、细胞外环(extracellularloop)1、2、3的各区域的氨基酸同一性平均约为80％以上。以分析的结果为基础，如前述专利(授权号：10‑2014383)记述的方法将小鼠内皮素受体a序列克隆为表达载体，在大肠杆菌条件下表达纯化活性型小鼠内皮素受体a，利用酶联免疫吸附测定技术实验发掘抗体在人类/小鼠内皮素受体a中的交叉结合能力，结果如图8所示。如图8所示，确认发掘的抗体在活性型小鼠内皮素受体a中具有的结合能力与在人类内皮素受体a中具有的结合能力非常相似。[0172]实施例6.确认发掘的5种前导抗体在结肠癌细胞中的增殖抑制功效[0173]在结肠癌细胞研究中像ht‑29细胞株一样广泛使用的hct‑116细胞株中，在存在内皮素‑1的条件下确认发掘抗体是否具有抑制结肠癌细胞增殖力的功效。利用cyquantnf荧光染料(invitrogen公司，美国)，通过测定细胞内dna的量来确认细胞的增殖度。使用不同浓度的纯化的发掘抗体处理hct‑116细胞株后，在37℃的细胞培养箱中共同培养1小时后，接种72小时后，使用cyquantnf荧光染料处理后，利用荧光分光光度计(tecan公司，瑞士)测定通过发射波长485nm的发出荧光之比(emissionby485nmexcitation)来测定细胞内dna的量，用这种方式确认发掘抗体是否能够通过与内皮素受体a的胞外结构域结合来抑制结肠癌细胞的增殖力，导出的结果如图9所示。如图9所示，本发明的抗体在hct‑116结肠癌细胞株中表现出阻碍由内皮素‑1引起的内皮素受体a的增殖力增加的效果。通过上述结果确认本发明的抗体具有有效阻碍结肠癌细胞的增殖的活性。使用与上述(实施例6)相同的方法在ht‑29和hct‑116结肠癌细胞株中确认5种前导抗体对结肠癌细胞增殖的抑制，导出的结果如图10所示。如图10所示，本发明的5种前导抗体表现出有效阻碍ht‑29和hct‑116结肠癌细胞株增殖的效果。通过上述结果确认本发明的5种前导抗体具有有效阻碍结肠癌细胞的增殖的活性。[0174]实施例7.确认发掘的5种前导抗体在结肠癌动物模型中的抗癌有效性[0175]利用balb/c无胸腺裸鼠(nudemouse)，制作在肋部(flanksregion)皮下注射(subcutaneousinjection)结肠癌ht‑29细胞株的异种移植(xenograft)模型，分别注射25μg的本发明的5种前导抗体，进行用于验证抗癌有效性的实验，导出的结果如图11所示。如图11所示，本发明的5种前导抗体在ht‑29结肠癌细胞株的异种移植模型中表现出阻碍结肠癌生长的效果。通过上述结果确认，本发明的5种前导抗体在动物模型中也具有有效阻碍结肠癌细胞增殖的活性，从而具有用作治疗剂的功效。[0176]实施例8.确认发掘的5种前导抗体在结肠癌动物模型中的抗癌有效性[0177]如图12所示，通过分子排阻色谱‑高效液相色谱(sec‑hplc)分离的结果确认5种发掘抗体凝集的百分比(％)表现为10％以下。如图13所示，分析糖链的结果，发掘抗体的糖链结构与人类igg标准品(humaniggstandard)没有太大差别。在图14为发掘的抗体的大小是否与理论值一致的分析，大体上在5da内表现出与序列相同的结果。为了确认热稳定性，使用ph4～ph8的缓冲溶液(使用乙酸钠(sodiumacetate)、柠檬酸钠(sodiumcitrate)、磷酸钾(potassiumphosphate)、组氨酸(histidine)、mes、琥珀酸盐(succinate)、4‑羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)、三羟甲基氨基甲烷(tris)、n，n‑二羟乙基甘氨酸(bicine)，磷酸盐缓冲溶液(pbs)作为缓冲溶液)对5种发掘抗体进行缓冲溶液更换(bufferexchange)。缓冲溶液更换后，将抗体的浓度浓缩为1mg/ml，向浓缩的发掘抗体添加作为能够预测蛋白质的结构变化的荧光的1000×proteinthermalshifttmdye(赛默飞世尔公司(thermofisherscientific))使其最终浓度稀释为1×。使用viia7(赛默飞世尔公司)，根据使用手册(proteinthermaltmstudies，赛默飞世尔公司)进行热稳定性分析。根据ph的热稳定性分析结果如图11所示。[0178]实施例9.确认发掘的5种前导抗体在结肠癌细胞中阻碍内皮素受体a信号传导的机制[0179]发掘抗体在hct‑116结肠癌细胞中阻碍内皮素受体a信号传导过程的能力是通过使用免疫印迹分析(immuniblotassay)方法确认作为内皮素受体a信号传导过程的最终活性产物的erk蛋白质和akt蛋白质的磷酸化来确认，导出的结果如图16所示。如图16所示，本发明的抗体在hct‑116结肠癌细胞株中表现出阻碍作为由内皮素‑1引起的内皮素受体a信号传导过程的最终活性产物的erk蛋白质和akt蛋白质的磷酸化的拮抗(antagonism)效果。通过上述结果确认发掘抗体具有有效抑制内皮素受体a的信号传导过程的活性。[0180]以上，详细记述了本发明的特定部分，本发明所属
技术领域：
：的普通技术人员应该明白的是，上述具体记述只不过是优选实例，本发明的范围不受其限制。因此，本发明实质上的范围应由随附的发明要求保护范围及其等价物定义。当前第1页12当前第1页12