一种用于苹果病毒病检测的引物组、试剂盒和检测方法与流程

本发明涉及农业技术领域，尤其涉及一种用于苹果病毒病检测的引物组、试剂盒和检测方法。

背景技术：

苹果树是多年生植物，在自然界的长期繁殖过程中，感染并积累了多种病毒。目前世界上报道的苹果病毒病有39种，其中显性病毒有25种，潜隐性病毒14种。我国现已鉴定明确的苹果病毒病有6种，分别为苹果锈果类病毒(assv)、苹果花叶病毒(apmv)、苹果绿皱果病毒(agrcv)、苹果褪绿叶斑病毒(aclsv)、苹果茎痘病毒(aspv)和苹果茎沟病毒(asgv)，其中前3种属显性病毒，后3种为潜隐性病毒。苹果生产上规定只要脱除这六种病毒就可认为是无病毒。

非潜隐性的苹果病毒病根据症状即可识别，而潜隐性病毒的鉴定需借助一定的技术和方法才能鉴定。针对苹果锈果病毒(assvd)、苹果花叶病毒(apmv)、苹果褪绿叶斑病毒(aclsv)、苹果茎沟病毒(asgv)和苹果茎痘病毒(aspv)等几种苹果主要病毒，目前我国苹果潜隐性病毒的检测技术有血清学、木本指示植物法，酶联免疫吸附测定法(elisa)、分子杂交技术、聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)等方法。

传统技术常采用木本植物指示法和酶联免疫吸附测定法(elisa)进行病毒检测。木本指示植物法方法需时长而费工，酶联免疫吸附测定法检测技术具有较高灵敏度，但需要制备相应的抗血清，这就要求较高的设备条件和技术条件，加之苹果潜隐性病毒在苹果组织中的含量很低，而不少潜隐性病毒迄今尚未分离提纯成功。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明实施例提供了一种用于苹果病毒病检测的引物组、试剂盒和检测方法，主要目的是解决检测效率和灵敏度低问题。

为达到上述目的，本发明主要提供了如下技术方案：

本发明提供了一种用于苹果病毒病检测的引物组，所述引物组包括分别扩增苹果锈果类病毒、苹果花叶病毒、苹果褪绿叶斑病毒、苹果茎痘病毒和苹果茎沟病毒的引物对；所述扩增苹果褪绿叶斑病毒的引物对的核苷酸序列如seqidno.1和seqidno.2；所述扩增苹果茎沟病毒的引物对的核苷酸序列如seqidno.3和seqidno.4；所述扩增苹果茎痘病毒的引物对的核苷酸序列如seqidno.5和seqidno.6；所述扩增苹果花叶病毒的引物对的核苷酸序列如seqidno.7和seqidno.8；所述扩增苹果锈果类病毒的引物对的核苷酸序列如seqidno.9和seqidno.10。

本发明提供了一种用于苹果病毒病检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述方案所述引物组。

本发明提供了一种苹果病毒病的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：

1)提取脱毒试管苗总rna，再反转录为cdna；

2)利用权利要求1所述引物组对所述cdna进行pcr扩增，得到扩增产物；

3)对扩增产物进行凝胶电泳，观察电泳条带；

若扩增产物中检测到大小为331bp的扩增片段，则苹果褪绿叶斑病毒检测结果为阳性，若扩增产物中未检测到大小为331bp的扩增片段，则苹果褪绿叶斑病毒检测结果为阴性；

若扩增产物中检测到大小为161bp的扩增片段，则苹果花叶病毒检测结果为阳性，若扩增产物中未检测到大小为161bp的扩增片段，则苹果花叶病毒检测结果为阴性；

若扩增产物中检测到大小为265bp的扩增片段，则苹果茎痘病毒检测结果为阳性，若扩增产物中未检测到大小为265bp的扩增片段，则苹果茎痘病毒检测结果为阴性；

若扩增产物中检测到大小为524bp的扩增片段，则苹果茎沟病毒检测结果为阳性，若扩增产物中未检测到大小为524bp的扩增片段，则苹果茎沟病毒检测结果为阴性；

若扩增产物中检测到大小为278bp的扩增片段，则苹果锈果病毒检测结果为阳性，若扩增产物中未检测到大小为278bp的扩增片段，则苹果锈果病毒检测结果为阴性。

优选的，所述pcr扩增体系以25μl计包括：cdna2μl，ntp1μl，10*pcrbuffer2.5μl，mgcl21.5μl，引物对中的每个引物各1μl，taqdna聚合酶0.3μl，用无菌双蒸水补足25μl；所述引物对选自分别扩增aslsv、asgv、aspv、apmv及assvd病毒的引物对中的一种。

优选的，所述pcr扩增程序为：

aclsv的反应程序：94℃预变性5min；94℃1min、54℃30s、72℃2min，30个循环；72℃延伸10min；

asgv的反应程序：94℃预变性5min；94℃1min、58℃30s、72℃2min，30个循环；72℃延伸10min；

aspv的反应程序：94℃预变性5min；94℃1min、57℃30s、72℃2min，30个循环；72℃延伸10min；

apmv的反应程序：94℃预变性5min；94℃1min、53℃30s、72℃2min，30个循环；72℃延伸10min；

assvd的反应程序：94℃预变性5min；94℃1min、57℃30s、72℃2min，30个循环；72℃延伸10min。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明采用rt-pcr法检测苹果病毒，优化反应程序，确定各病毒适宜的退火温度，从而快速准确地检测样品是否携带病毒，检测快速、特异性好、可周年检测、可检测复合侵染、准确率和灵敏度高，并将此方法用于规模化的组培生产，为无病毒苗木的繁育提供技术支撑。

附图说明

图1是本发明实施例1提供的热处理加茎尖脱毒过程实物图，其中(1-1为继代培养15d即热处理0d；1-2为后热处理10d；1-3为热处理20d；1-4为热处理30d；1-5为热处理35d；1-6为热处理40d；1-7为1～2mm茎尖转接；1-8和1-9为试管苗热处理)。

图2是本发明实施例2提供的asgv凝胶电泳图，其中：1.sh38；2.sh40；3.长富2；4.蜜脆；5.玉华早富；6.红盖露；7.粉红女士；8.丽嘎；9-1.富士冠军；9-2.秦阳；10.礼泉短富；11.m26；12.t337；13.m9；

图3是本发明实施例2提供的aclsv凝胶电泳图，其中：1.sh38；2.sh40；3.长富2；4.蜜脆；5.玉华早富；6.红盖露；7.粉红女士；8.丽嘎；9-1.富士冠军；9-2.秦阳；10.礼泉短富；11.m26；12.t337；13.m9；

图4是本发明实施例2提供的aspv凝胶电泳图，其中：1.sh38；2.sh40；3.长富2；4.蜜脆；5.玉华早富；6.红盖露；7.粉红女士；8.丽嘎；9-1.富士冠军；9-2.秦阳；10.礼泉短富；11.m26；12.t337；13.m9；

图5是本发明实施例2提供的assvd凝胶电泳图，其中：1.sh38；2.sh40；3.长富2；4.蜜脆；5.玉华早富；6.红盖露；7.粉红女士；8.丽嘎；9-1.富士冠军；9-2.秦阳；10.礼泉短富；11.m26；12.t337；13.m9；

图6是本发明实施例2提供的apmv凝胶电泳图，其中：1.sh38；2.sh40；3.长富2；4.蜜脆；5.玉华早富；6.红盖露；7.粉红女士；8.丽嘎；9-1.富士冠军；9-2.秦阳；10.礼泉短富；11.m26；12.t337；13.m9。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效,以下以较佳实施例，对依据本发明申请的具体实施方式、技术方案、特征及其功效，详细说明如后。下述说明中的多个实施例中的特定特征、结构、或特点可由任何合适形式组合。

本发明提供了一种用于苹果病毒病检测的引物组，所述引物组包括分别扩增苹果锈果类病毒、苹果花叶病毒、苹果褪绿叶斑病毒、苹果茎痘病毒和苹果茎沟病毒的引物对；所述扩增苹果褪绿叶斑病毒的引物对的核苷酸序列如seqidno.1和seqidno.2；所述扩增苹果茎沟病毒的引物对的核苷酸序列如seqidno.3和seqidno.4；所述扩增苹果茎痘病毒的引物对的核苷酸序列如seqidno.5和seqidno.6；所述扩增苹果花叶病毒的引物对的核苷酸序列如seqidno.7和seqidno.8；所述扩增苹果锈果类病毒的引物对的核苷酸序列如seqidno.9和seqidno.10。

本发明提供了一种用于苹果病毒病检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述方案所述引物组；所述试剂盒优选的还包括ntp、10*pcrbuffer2.5μl、mgcl2、taqdna聚合酶和无菌双蒸水；更优选的，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品。

本发明提供了一种苹果病毒病的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：

1)提取脱毒试管苗总rna，再反转录为cdna；

2)利用权利要求1所述引物组对所述cdna进行pcr扩增，得到扩增产物；所述pcr扩增体系以25μl计优选的包括：cdna2μl，ntp1μl，10*pcrbuffer2.5μl，mgcl21.5μl，引物对中的每个引物各1μl，taqdna聚合酶0.3μl，用无菌双蒸水补足25μl；所述引物对选自分别扩增aslsv、asgv、aspv、apmv及assvd病毒的引物对中的一种；所述pcr扩增程序为：aclsv的反应程序：94℃预变性5min；94℃1min、54℃30s、72℃2min，30个循环；72℃延伸10min；asgv的反应程序：94℃预变性5min；94℃1min、58℃30s、72℃2min，30个循环；72℃延伸10min；aspv的反应程序：94℃预变性5min；94℃1min、57℃30s、72℃2min，30个循环；72℃延伸10min；apmv的反应程序：94℃预变性5min；94℃1min、53℃30s、72℃2min，30个循环；72℃延伸10min；

assvd的反应程序：94℃预变性5min；94℃1min、57℃30s、72℃2min，30个循环；72℃延伸10min；

3)对扩增产物进行凝胶电泳，观察电泳条带；

若扩增产物中检测到大小为331bp的扩增片段，则苹果褪绿叶斑病毒检测结果为阳性，若扩增产物中未检测到大小为331bp的扩增片段，则苹果褪绿叶斑病毒检测结果为阴性；

若扩增产物中检测到大小为161bp的扩增片段，则苹果花叶病毒检测结果为阳性，若扩增产物中未检测到大小为161bp的扩增片段，则苹果花叶病毒检测结果为阴性；

若扩增产物中检测到大小为265bp的扩增片段，则苹果茎痘病毒检测结果为阳性，若扩增产物中未检测到大小为265bp的扩增片段，则苹果茎痘病毒检测结果为阴性；

若扩增产物中检测到大小为524bp的扩增片段，则苹果茎沟病毒检测结果为阳性，若扩增产物中未检测到大小为524bp的扩增片段，则苹果茎沟病毒检测结果为阴性；

若扩增产物中检测到大小为278bp的扩增片段，则苹果锈果病毒检测结果为阳性，若扩增产物中未检测到大小为278bp的扩增片段，则苹果锈果病毒检测结果为阴性。

实施例1(脱毒过程)

2017年春季从铜川新区陕西省果树良种苗木繁育中心苹果资源圃，选择生产上推广的苹果品种丽嘎、富士冠军、长富2、红盖路、蜜脆、秦阳、粉红女士、礼泉短富、砧木t337、m9、m26、sh38及sh40；于4～5月份在生长健壮的母树取1cm的茎尖，用0.1％的hgcl2进行外植体消毒；

2017年8月份，在陕西新世界果业集团有限公司组培中心将培养3代继代15d的丽嘎、富士冠军、长富2、红盖路、蜜脆、礼泉短富、粉红女士、秦阳；砧木t337、m9、m26、sh38、sh40苹果试管苗嫩茎，每瓶接种5个，每个品种20瓶，置于人工气候箱中，每天光照14h，光强2000～3000lx，湿度为40％，热处理起点温度为28℃，以后每天升高1℃，当升至38℃时，恒温处理30d后选择绿色苗的茎尖2次剥取1～2mm的茎尖进行组织培养，继代培养2～3代后，经病毒检测(苹果锈果类病毒、苹果花叶病毒、苹果褪绿叶斑病毒、苹果茎痘病毒及苹果茎沟病毒)，获得无病毒原种。试管苗热处理后再取材进行茎尖培养，无消毒和培养基适应过程，经过连续继代培养的试管苗在人工气候箱中38℃恒温培养30d，试管苗的成活率为48％～76％；黄化苗的茎尖转接不能成活，绿色苗的茎尖转接成活率为22％～46％(见表1)。

结果表明：m26等砧木耐热程度较好，玉华早富等富士系耐热程度次之，嘎啦系耐热最差。热处理后死亡率和黄化率仍然很高，但是由于试管苗繁殖速度快，瓶苗基数大，脱毒效果好，因此通过试管苗热处理的方法短期内可获得大量的脱毒苗，在产业化育苗的操作上有一定的可行性。

本发明先后对红盖露、秦阳、玉华早富、富士冠军、长富2、蜜脆、丽嘎、礼泉短富、粉红女士苹果品种和t337、m9、m26、sh38、sh40砧木进行了茎尖培养加热处理脱毒，其实物图如图1所示。

表1.苹果试管苗脱毒过程统计表

对比例1

本对比例1与实施例1不同之处在于热处理过程不同；本对比例1利用剥取小于0.2mm的茎尖进行组织培养并分化成苗，可使苹果的潜隐病毒脱除率达到70％～80％；但是在植物的组织培养中，芽尖愈小，愈难以建立外植体；本对比例1对各品种的芽尖培养试验，成活率均小于3％，并且经6次转接才开始分化。

通过对比实施例1与对比例1发现，采用本发明的热处理过程和增大茎尖尺寸的手段，试管苗的成活率为48％～76％，绿色苗的茎尖转接成活率为22％～46％；成活率大于对比例1，转接率高。因此，采用本发明的脱毒方法可以提高试管苗成活率，提高茎尖转接率。

本发明脱毒方法中，采用人工气候箱，增加湿度，并控制在40％，升温方式采用每天1℃的恒速升温模式，该方式可延长试管苗的寿命；并且增大茎尖取材体积同时多次剥取茎尖次数，剥取1～2mm的茎尖，降低操作难度，使茎尖的转接成活率达到达22％～46％，脱毒率可达到85.6％～100％。

实施例2(检测过程)

总rna提取及cdna的合成：2018年1月开始，选择经过热处理培养2～3代后的红盖露、秦阳、玉华早富、富士冠军、长富2、蜜脆、丽嘎、礼泉短富、粉红女士苹果品种和t337、m9、m26、sh38、sh40砧木试管苗，每个品种随机抽样，取每瓶试管苗的叶或茎在通风厨提取rna，取0.1g材料采用rnaplant试剂盒提取苹果的总rna，dnasei进行纯化后，总rna完整性好，质量高，很好地避免了rna的降解；经dnasei去除dna后，用nanodrop2000c核酸测定仪测定rna纯度和浓度，并通过琼脂糖凝胶电泳检测rna的完整性；取≦1μg纯化后的rna用revertaidfisrtstrandcdnasynthesiskit反转录试剂盒进行反转录，按说明书进行操作得到cdna。

引物合成：设计aslsv、asgv、aspv、apmv、assvd的引物序列，如表2所示，由上海生工合成。

pcr扩增体系及反应程序：针对每个品种取上述反应产物2μl，向其中加入下列试剂：dntp1μl，10*pcrbuffer2.5μl，mgcl21.5μl，引物1、2各1μl，taqdna聚合酶0.3μl，用无菌双蒸水补足25μl。

反应程序首先94℃预变性5min，接下来aclsv的反应程序：94℃1min，54℃30s，72℃2min；asgv的反应程序：94℃1min，58℃30s，72℃2min；aspv的反应程序：94℃1min，57℃30s，72℃2min；apmv的反应程序：94℃1min，53℃30s，72℃2min；assvd的反应程序：94℃1min，57℃30s，72℃2min；扩增30个循环。最后72℃延伸10min；pcr产物在1％琼脂糖凝胶中电泳，eb染色；凝胶成像系统观察电泳结果并照相记录。

表2.苹果病毒检测引物

检测结果参见图2～图6，其中图2是asgv凝胶电泳图；图3是aclsv凝胶电泳图；图4是aspv凝胶电泳图；图5是assvd凝胶电泳图；图6是apmv凝胶电泳图；1.sh38；2.sh40；3.长富2；4.蜜脆；5.玉华早富；6.红盖露；7.粉红女士；8.丽嘎；9-1.富士冠军；9-2.秦阳；10.礼泉短富；11.m26；12.t337；13.m9。

用rt-pcr试验体系进行病毒检测；苹果褪绿叶斑病毒，苹果花叶病毒，苹果茎痘病毒，苹果茎沟病毒，苹果锈果病毒pcr扩增特异性片段大小分别为331bp、161bp、265bp、524bp、278bp。在pcr产物中，检测有相应大小的扩增片段为阳性(即有毒)，无相应扩增片段为阴性(即无该病毒)，通过对反应程序的优化，找到每个病毒最适退火温度，本发明中目的条带大小吻合，且条带清晰，与已有报道资料相比，本试验体系检测结果真实可靠。

本发明采用rt-pcr法，先后检测了苹果品种玉华早富，红盖路，蜜脆，富士冠军，丽嘎，礼泉短富、秦阳，长富2号，粉红女士；苹果砧木m26、m9、t337、sh38、sh40，获得了14个品种的无病毒种源，脱毒率达85.6％～100％。

表3.苹果样品检测结果

注：“+”为阳性，带毒；“-”为阴性，无病毒；

本发明中，采用rnaplant试剂盒提取苹果试管苗叶片的总rna，所提取的rna完整性及纯度颇好，获得了良好的rt-pcr扩增效果，具有提取时间短，提取成本低等优点。本发明在提取苹果组培苗的总rna后，可以明显的看到dna的污染；选用takara公司的产品dnaseⅰ，获得了高质量的rna；在经过dnaseⅰ处理之后，虽然rna的产量降低了，但是纯度提高了，rt-pcr可以得到预期的结果，符合试验要求、完整的高纯度rna。

本发明采用rt-pcr法检测苹果病毒，优化反应程序，确定各病毒适宜的退火温度，从而快速准确地检测样品是否携带病毒，准确率和灵敏度高，特异性好、结果真实可靠，并将此方法用于规模化的组培生产，为无病毒苗木的繁育提供技术支撑。

本发明实施例中未尽之处，本领域技术人员均可从现有技术中选用。

以上公开的仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保范围之内。因此，本发明的保护范围应以上述权利要求的保护范围为准。

<110>徐世彦

陕西省果业研究发展中心

<120>一种用于苹果病毒病检测的引物组、试剂盒和检测方法

<160>10

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tcatggaaagacaggggcaa20

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gccaacttcaggcattgtagaa22

<210>3

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

gccacttctaggcagaactcttgaa25

<210>4

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

aaccccttttgtcctcagtacgaa24

<210>5

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

ctataggcttgaggaacataaggt24

<210>6

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

tgcctcaaagtacacccctcagt23

<210>7

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

caaccgagaggttgcaaatgg21

<210>8

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

ttctagcaggtcttcatcga20

<210>9

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

cgaggagaagaaggaactcac21

<210>10

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

ggtattgtgttttaccctggga22