一种检测血液中HBVpgRNA的试剂盒的制作方法

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种检测血液中hbvpgrna的试剂盒。

背景技术：

乙型肝炎病毒(hbv)感染是引起肝脏疾病，如肝硬化和原发性肝癌，最常见的病因之一。全球超过20亿人感染了乙肝病毒，约有2.4亿慢性乙型肝炎患者，我国约有9300万慢性乙肝病毒携带者，其中发展为慢性乙型肝炎的患者约2000～3000万人。

乙型肝炎病毒属于嗜肝性dna病毒，病毒侵入人体后，通过pres1区域与肝细胞膜上钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白受体结合，脱去包膜后进入肝细胞质，释放松环dna(rcdna)进入肝细胞核，在肝细胞核中rcdna转变成共价闭合环状dna(cccdna)，再以cccdna为模板转录出4种mrna，其中长度3.5kb的前基因组rna(pgrna)包含hbvdna上的所有遗传信息，并且pgrna能够在胞质中逆转录形成rcdna和病毒蛋白，最后装配成完整的hbv，释放至肝细胞外，而一部分rcdna进入细胞核中，再转变成cccdna，形成乙肝病毒持续复制的过程。

cccdna能以游离的形态长期稳定存在于肝细胞核中，所以cccdna的水平与乙肝复发有极大的相关性，而cccdna的检测需要对患者肝脏进行穿刺取样，侵入性检查会对患者造成一定伤害。有研究表明慢性乙肝患者血清中存在pgrna，pgrna来源于非整合的完整的hbv基因组，以衣壳化hbvpgrna病毒颗粒形式进入血液中，pgrna能够反映肝脏内cccdna的转录活动状态，在hbeag阳性hbv感染者中，血清pgrna与肝内cccdna的水平呈正相关，所以pgrna可以作为hbv病毒复制和预后的敏感性血清标志物，hbvpgrna持续阴性和低hbsag水平可以判定为慢性乙型肝炎的“准临床治愈”，在指导乙肝治疗安全停药方面具有重要意义。但目前市场上用于检测pgrna的技术和试剂盒较少，且pgrna的检测易受到来自dna的干扰，已有产品的灵敏度不能满足实际需求。虽然申请号为201611099305.8的中国发明专利，公开了一种组合物、其应用以及含有该组合物的试剂盒，其能够对血液中的hbvpgrna定量检测，且灵敏度可低至5个拷贝，但是其检测是基于数字pcr技术，而基于荧光定量pcr检测技术的试剂盒还无法达到上述灵敏度。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术的缺陷，本发明所要解决的技术问题是：提供一种利用荧光定量pcr检测技术的高灵敏度hbvpgrna检测试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种检测血液中hbvpgrna的试剂盒，包括扩增试剂，所述扩增试剂包括pcr反应液ⅰ，所述pcr反应液ⅰ包括seqidno:1、seqidno:2和seqidno:3所示的引物以及seqidno:4和seqidno:5所示的探针(见表1)。

表1

本发明的有益效果在于：本发明提供的试剂盒，利用rna单链需逆转录的特点，在逆转录引物的5’端增加一段特异的非hbv的序列，同时将合成该段序列的寡核苷酸作为cdna扩增的引物，达到特异性扩增pgrna的目的，使得检测过程中不受dna干扰，有效提高了试剂盒检测时的灵敏度，对乙肝病毒pgrna的检测下限(最低检出限)可达10copies/ml。

附图说明

图1所示为本发明具体实施方式的检测血液中hbvpgrna的试剂盒的灵敏度检测结果图；

图2所示为本发明具体实施方式的检测血液中hbvpgrna的试剂盒的特异性检测结果图。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。

本发明最关键的构思在于：在逆转录引物的5’端增加一段特异的非hbv的序列，同时将合成该段序列的寡核苷酸作为cdna扩增的引物。

请参照图1至图2所示，本发明的一种检测血液中hbvpgrna的试剂盒，包括扩增试剂，所述扩增试剂包括pcr反应液ⅰ，所述pcr反应液ⅰ包括seqidno:1、seqidno:2和seqidno:3所示的引物以及seqidno:4和seqidno:5所示的探针。

从上述描述可知，本发明的有益效果在于：本发明提供的试剂盒，利用rna单链需逆转录的特点，在逆转录引物的5’端增加一段特异的非hbv的序列，同时将合成该段序列的寡核苷酸作为cdna扩增的引物，达到特异性扩增pgrna的目的，使得检测过程中不受dna干扰，有效提高了试剂盒检测时的灵敏度，对乙肝病毒pgrna的检测下限(最低检出限)可达10copies/ml。

进一步的，所述pcr反应液ⅰ还包括pcr缓冲液、datp、dutp、dgtp和dctp。

进一步的，所述扩增试剂还包括内标，所述内标为克隆质粒。

进一步的，所述括扩增试剂还包括pcr反应液ⅱ，所述pcr反应液ⅱ包括taq酶、udg酶、mmlv逆转录酶和rnase抑制剂。

进一步的，所述括扩增试剂还包括阳性质控品、阴性质控品和定量参考品，所述阳性质控品为hbv阳性血清样本，所述阴性质控品为hbv阴性血清样本，所述定量参考品为定值的hbv阳性血清样本。

进一步的，上述的试剂盒还包括pgrna提取试剂，所述pgrna提取试剂包括裂解液、抑制物去除液、洗涤液a、洗涤液b、洗脱液和dna消化反应液。

从上述描述可知，通过设置pgrna提取试剂，便于利用同一试剂盒快速进行血液中hbvpgrna的检测。

进一步的，所述裂解液为硫氰酸胍，所述抑制物去除液为蛋白酶k，所述洗涤液a由硫氰酸胍和无水乙醇组成，所述洗涤液b由氯化钠和无水乙醇组成，所述洗脱液为灭菌纯化水，所述dna消化反应液为dnaseⅰ。

实施例1：

一种检测血液中hbvpgrna的试剂盒，包括表2所示组分，其中引物和探针的序列如seqidno:1-seqidno:5所示；

表2

其中，pcr反应液1中datp、dutp、dgtp、dctp为0.5-2mm、mg²⁺为2-4mm、引物为200-500nm、探针为100-300nm。

所述内标中克隆质粒的基因序列为：taggaggctgtaggcataaagttcgtagtggtgtcacacgtctgtctcgcacgctagctcctcaggtgtcgtagtgtggacacatacgggctaaacag。

所述定量参考品1、定量参考品2、定量参考品3、定量参考品4分别为1×10⁴copies/ml、1×10⁵copies/ml、1×10⁶copies/ml、1×10⁷copies/ml的阳性血清样本。

所述阳性质控品1和阳性质控品2分别为1×10³-5×10⁴copies/ml和1×10⁶-5×10⁷copies/ml的阳性血清样本。

实施例2：

利用实施例1的试剂盒，检测血液中hbvpgrna，具体步骤如下：

1、病毒核酸提取

1)配制相关试剂。

2)取2.0ml离心管n个并编号(n＝样本例数+阳性质控品×2+阴性质控品×1+定量参考品×4)，分别加入10μl抑制物去除液，400μl样本，再加入600μl裂解液+内标质粒混合液(裂解液：内标质粒＝600：1，现配现用)，震荡混匀，瞬时离心，置70℃金属浴10min后，瞬时离心，冷却至室温；

3)分别加入500μl乙醇，颠倒混匀，瞬时离心，再加入10μl磁珠悬液，颠倒混匀，室温静置10min，每隔1-2min再次颠倒混匀，保持磁珠混匀状态；

4)将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附至管壁后，吸弃废液；取下离心管，分别加入1ml洗涤液a，颠倒数次使磁珠均匀分散；

6)将离心管再次置于磁力架上，待磁珠完全吸附至管壁后，吸弃废液；取下离心管，分别加入1ml洗涤液b，颠倒数次使磁珠均匀分散；

7)将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附至管壁后，尽量将废液吸弃干净，然后再重复依次步骤6)和7)；

8)离心管开盖置于50℃金属浴30s～2min，待磁珠表面无水迹，加入20μl洗脱液，轻弹管壁使磁珠分散，再次置于50℃金属浴5min，期间若磁珠沉降至管底，再次轻弹管壁混匀；

9)将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附至管壁后，取上清即为hbv核酸。

2、pcr反应体系配制及加样

取pcr反应液1和pcr反应液2，根据样本例数按如下体系配制pcr反应体系：

pcr反应液ⅰ7.5μl×n；pcr反应液ⅱ1.5μl×n；

充分混匀后每管10μl分装至pcr管中，每管加入15μlhbv核酸样本，最终体系为25μl/管，混匀，瞬时离心。

3、pcr扩增检测

将上述pcr反应管放入荧光pcr仪中，程序设置如表3所示。

表3

其中，荧光信号收集在阶段3：60℃40sec(*标记)，收集的荧光信号为探针标记的荧光(fam/vic)。

4、结果分析

根据仪器自动分析后的图像适当调节基线的start值和stop值以及阈值(使阴性质控品的曲线平直或低于阈值线)，软件自动定量。

5、质量控制

1)内标：vic通道的33<ct值≤35，扩增曲线呈s形；

2)阴性质控品：fam通道无ct值；

3)阳性质控品1：定量值介于1×10³-5×10⁴copies/ml；

4)阳性质控品2：定量值介于1×10⁶-5×10⁷copies/ml；

5)定量参考品：均为阳性，线性相关系数介于0.98-1；

以上参数须全部满足，否则应重新测试。

实施例3：

对实施例1的试剂盒进行灵敏度和特异性的检测。

1)灵敏度检测

用阴性血清将hbv定量国家标准品梯度稀释至1e5、1e4、1e3、1e2、50、20、10copies/ml及以下，使用本试剂盒对hbvpgrna进行定量检测，检测结果见图1所示。

可以看出，本试剂盒的最低检出限可达到10copies/ml，且经重复实验，结果显示浓度为10copies/ml的病毒样本检出率为95％。

2)特异性检测

取临床hbv阴性标本用本试剂盒进行检测，阴性标本中包括甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、1型/2型单纯疱疹病毒、带状疱疹病毒、细胞巨化病毒、黄热病病毒等常见病原体核酸样本，检测结果均显示为阴性，符合率100％。检测结果如图2所示。

可以看出，本试剂盒具有良好的特异性。

综上所述，本发明提供的试剂盒，利用rna单链需逆转录的特点，在逆转录引物的5’端增加一段特异的非hbv的序列，同时将合成该段序列的寡核苷酸作为cdna扩增的引物，达到特异性扩增pgrna的目的，使得检测过程中不受dna干扰，有效提高了试剂盒检测时的灵敏度，对乙肝病毒pgrna的检测下限(最低检出限)可达10copies/ml。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<110>阿吉安（福州）基因医学检验实验室有限公司

<120>一种检测血液中hbvpgrna的试剂盒

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

taggaggctgtaggcataa19

<210>2

<211>14

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

aagccacccaaggc14

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

ctgtttagcccgtatgtgtcc21

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

ctttttcacctctgcctaatca22

<210>5

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

ctgtctcgcacgctagctcctca23