一种基于SjR2纳米金探针的LAMP检测体系及其应用的制作方法

本发明涉及一种基于sjr2纳米金探针的lamp检测体系及其应用，属于检测技术领域。

背景技术：

血吸虫病是世界上仅次于疟疾的第二大寄生虫病，流行于世界上74个国家和地区，主要集中于发展中国家。据最新文献资料统计，被血吸虫感染人数为3.91-5.97亿人，受感染威胁的人数达8亿人。我国主要流行日本血吸虫病，该病流行区分布于我国长江流域及其以南的江苏、浙江、安徽、江西、福建、上海、湖南、湖北、广东、广西、云南、四川等12个省、市、自治区。据2018年全国血吸虫病疫情通报，全国共有453个血吸虫病流行县，现有晚期血吸虫病病人约3万例。我国虽然在血吸虫病的防制工作中取得了世界瞩目的成就，但是我国的血防形势依然不容乐观。近年来，输入性血吸虫病的发病率呈现逐年升高的趋势，再加上局部地区疫情的明显回升以及已达标地区疫情尚不稳定，血吸虫病的传播风险在局部地区仍然较大，预示着我国的血防工仍然面临着严峻的考验。《“健康中国2030”规划纲要》提出，2030年全国要实现血吸虫病消除的目标，要达到这一目标，敏感、特异的血吸虫病诊断方法是血防工作中不可或缺的基石。然而，目前日本血吸虫病的确诊主要依据病原学检测，粪检法例如kato-katz法，仍是目前常用的确诊方法，但随着疫区病人感染率和感染度的逐年下降，粪检法检测的敏感性不断受到质疑。现有的大量研究资料均证实，粪检法受到虫体排卵波动性和粪便样本间差异的影响，一张kato-katz厚涂片法容易漏检低感染度病人，低估流行区真实的感染状态，影响考核疗效的准确性。此外，由于血吸虫的生活史的特殊性，粪检法需在病人感染后急性病变期才能检获虫卵，不具有早期诊断价值，且疫区居民对粪检法的依从性亦呈现逐年下降的趋势，更加凸显了粪检法的局限性，发展新的诊断方法显得尤为必要。

免疫学诊断方法因其有较高的敏感性和较好的群众依从性，而受到重视并获得快速发展，在对疫区化疗对象的大规模筛查和血清流行病学调查以及防治效果的评价等方面发挥了重要作用，但是到目前为止仍然没有理想的血吸虫病早期诊断和疗效考核的方法。理论上检测血吸虫循环抗原能满足早期诊断及疗效考核的要求，但对慢性轻度感染者敏感性不高，治疗后不同时间的阴转率也不高。血吸虫循环抗体检测试验，由于抗体在化疗后很长时间内仍在体内保持一定的水平，通常维持在一年以上，且其在体内的水平和转归具有个体差异性，其定性检测结果不能区别现症感染和既往感染，疗效考核价值不理想，无法有效控制传染源，成为长期以来血吸虫病防治工作中亟待解决的难题。

核酸检测技术的发展和应用为血吸虫病的早期诊断和疗效考核提供了新方法。就理论而言，检测日本血吸虫的特异性dna片段与日本血吸虫的病原检测具有同样的确诊价值。并且核酸检测技术在特异性、敏感性和稳定性上具有免疫学诊断所无法比拟的优越性。但以粪便作为检测样本建立的pcr法，仍然存在与粪检法同样的局限性，无早期诊断价值，更不能准确评价化疗效果。血吸虫作为一种多细胞的寄生虫，其在宿主体内移行、发育、成熟的整个过程中亦会有大量的血吸虫游离dna释放到外周血中，那么这部分游离dna亦可以用来诊断血吸虫病。更为重要的是，与粪便样本不同，血吸虫游离dna均匀分布于血清中，避免了随机取样带来的偏差，因此对血清样本dna的检测更具有实际应用价值。目前国内外已有应用各种pcr法检测日本血吸虫、曼氏血吸虫以及埃及血吸虫特异性dna的报道。然而，由于pcr法需要昂贵的实验仪器以及大量实验技术人员的支持，无法在经济落后、资源匮乏的农村地区广泛开展。日本学者notomi等报道的环介导的恒温扩增法(loop-mediatedisothermalamplification,lamp)由于具有高效、快速、简便易操作、结果直观、适合于现场检测等优点而获得了快速发展，并用于多种病原微生物的检测。申请者课题组在之前的研究中针对日本血吸虫逆转录转座子sjr2建立了敏感、特异的lamp检测方法，对日本血吸虫低感染度家兔模型(感染30条尾蚴)的检测结果显示，可于感染后3天检出血吸虫特异性dna，并于治疗后10周检测结果转为阴性。

虽然lamp法有诸多优点，但仍需要进一步完善，集中体现在对扩增产物的观察和判断上。目前常用的产物鉴定方法有以下5种：(1)琼脂糖凝胶电泳法；(2)浊度观察法；(3)观察荧光法；(4)比色法；(5)胶纸条试纸检测法。琼脂糖凝胶电泳法由于在电泳过程中会形成大量气溶胶，容易污染实验环境而较少应用。浊度观察法和检测荧光法存在敏感性、特异性差的缺陷，不适合用于病原检测。本课题组在前期研究过程中发现lamp检测体系存在的不足之处即对扩增产物鉴定存在不稳定因素，主要表现为：需要在扩增反应结束后加入荧光染料来判定检测结果，一方面增加了污染的风险，另一方面，由于sybrgreeni是一种非特异性地嵌入到dna双链中的染料，容易出现假阳性结果。

近年来，由于纳米技术的渗透，尤其是纳米金探针(au-nanoparticleprobe，aunpprobe)的快速发展，使得比色法和胶纸条试纸检测法获得了快速发展，广泛应用于核酸扩增产物的检测，可提高检测的敏感性、特异性和稳定性，同时又降低了检测成本，更加适用于资源匮乏地区的现场检测。但是现有的用于检测日本血吸虫的纳米金探针lamp检测体系还存在对扩增产物鉴定特异性和稳定性不足的缺陷。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明提供一种基于sjr2纳米金探针的lamp检测体系检测日本血吸虫dna的方法。本发明针对lamp扩增产物设计互补的寡核苷酸探针，将烷巯基化的探针连接到纳米金颗粒上，制备特异性的sjr2纳米金探针，用于lamp扩增产物的鉴定，进一步提高lamp检测法的特异性和稳定性。

本发明的第一个目的是提供一种基于sjr2纳米金探针的lamp检测体系，包括采用lamp引物组合与纳米金连接制备纳米金探针，所述的lamp引物组合包括4条lamp引物，具体包括两条外引物sjr2f3和sjr2b3，两条内引物sjr2fip和sjr2bip，其中，

sjr2f3：cttcgtgtttccggggac

sjr2b3：ggagcataggcagagacaac

sjr2fip：cgaggagagcctgttcagcttttaccactcgaggccttgc

sjr2bip：agacagtcgattgtgcgctgtgagacaacggcgtgtgtc。

进一步地，所述的lamp引物组合通过巯基化的polya片段与纳米金连接。

进一步地，所述的polya片段为10个a碱基。

进一步地，lamp检测体系具体包括以下检测组分：

进一步地，所述的lamp检测体系的反应条件为60～65℃保温30～90min。

本发明的第二个目的是提供一种用于检测日本血吸虫dna的引物组，所述的引物组包括4条lamp引物，具体包括两条外引物sjr2f3和sjr2b3，两条内引物sjr2fip和sjr2bip，其中，

sjr2f3：cttcgtgtttccggggac

sjr2b3：ggagcataggcagagacaac

sjr2fip：cgaggagagcctgttcagcttttaccactcgaggccttgc

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本发明的第二个目的是提供一种包括所述的基于sjr2纳米金探针的lamp检测体系的试剂盒。

本发明的第三个目的是提供所述的基于sjr2纳米金探针的lamp检测体系在检测日本血吸虫感染宿主血清中血吸虫特异性dna的应用。

本发明的有益效果是：

本发明针对lamp扩增产物设计互补的寡核苷酸探针，将烷巯基化的探针连接到纳米金颗粒上，制备特异性的sjr2纳米金探针，用于lamp扩增产物的鉴定，进一步提高lamp检测法的特异性和稳定性，建立了更加敏感特异和高效简便的适宜于疫区现场应用的血吸虫特异性dna检测法，为我国血吸虫病消除战略提供新的技术手段。

附图说明

图1为sjr2lamp引物及探针设计位点；

图2为不同mg²⁺浓度对基于纳米金探针的lamp检测体系的影响；其中，mg²⁺浓度为15μl体系中的终浓度；终浓度为333mm、200mm、100mm、50mm、20mm、10mm的mg²⁺浓度分别为1m、600mm、300mm、150mm、60mm、30mm；图2a：1.阳性对照(日本血吸虫成虫dna)，2.阴性对照(正常兔的血清dna)；图2b：1.纳米金探针溶液，2.阳性对照(日本血吸虫成虫dna)，3.阴性对照(正常兔血清dna)，4.空白对照；

图3为纳米金探针和lamp扩增产物的体积比对溶液颜色的影响；从左至右纳米金探针溶液与lamp扩增产物溶液的体积比为0:10到10:0；1：阳性对照(日本血吸虫成虫dna)；2：阴性对照(正常兔血清dna)；

图4为基于纳米金探针核酸比色分析法的lamp检测体系的敏感性；其中，10^-1～10^-10依次为1:10～1:10¹⁰稀释后的日本血吸虫成虫dna；图a1带表第一次检测的敏感性，图a2代表第二次检测的敏感性；

图5为成虫dna系列稀释样本lamp扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；其中，10^-1～10^-10依次为1:10～1:10¹⁰稀释后的日本血吸虫成虫dnalamp扩增产物；m：100bpdnamarker；图b1代表第一次检测的核酸凝胶电泳结果，图b2代表第二次检测的核酸凝胶电泳结果；

图6为基于纳米金探针的lamp检测体系对不同虫种dna扩增产物的检测；其中，1-6依次为日本血吸虫、曼氏血吸虫、华支睾吸虫、肺吸虫、旋毛形线虫、埃及血吸虫；b：空白对照(未加模板)；

图7为lamp对不同虫种dna扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；其中，泳道1～7依次为日本血吸虫、曼氏血吸虫、华支睾吸虫、肺吸虫、旋毛形线虫、埃及血吸虫；m：transdnamarker。

图8为基于sjr2纳米金探针的lamp法对感染30条日本血吸虫尾蚴家兔血清dna的早期检测p：阳性对照(日本血吸虫成虫)，b：空白对照(ddh2o)，n：阴性对照(正常家兔血清)3d，1w～4w：依次为感染30条日本血吸虫尾蚴家兔感染后第3d及1w～4w的外周血清。

图9为基于sjr2纳米金探针的lamp法对感染30条日本血吸虫尾蚴家兔血清dna的疗效考核p：阳性对照(日本血吸虫成虫)，b：空白对照(ddh2o)，n：阴性对照(正常家兔血清)14w～18w：依次为感染30条日本血吸虫尾蚴家兔感染后第14w～18w(即治疗后第7w～11w)的外周血清。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1：sjr2特异的纳米金探针的设计

基于纳米金探针核酸比色分析法的lamp检测中最关键的环节是纳米金与寡核苷酸探针的连接，最常见的功能化aunps的方法是在寡核苷酸探针的5’或者3’端修饰巯基(-sh)，纳米金粒子与巯基以au-s键的形式相连使寡核苷酸探针牢固地连接在金颗粒的表面。但是单纯利用巯基修饰的寡核苷酸功能化aunps有所缺陷，sh-dna呈倒伏状地吸附在aunps表面不利于dna杂交的进行，因此设计寡核苷酸探针时需要在5’或者3’端加一段a碱基(polya)然后再进行巯基化修饰，polya片段不仅可以将寡核苷酸探针固定在aunps表面，还可以屏蔽其上的其他dna碱基与aunps之间的非特异性位点结合，使功能性寡核苷酸序列远离aunps表面并保持直立构型，可以提高纳米金探针对靶序列的识别能力。本研究针对sjr2lamp扩增产物的茎环部位设计特异性寡核苷酸探针，寡核苷酸探针的位置选定在基因序列的b1c→b2c区段内(图1)，长度为20bp，序列为：5’-atggaacggtaaggactcgt-3’，并在其5’端加10个a碱基进行烷巯基化修饰，使得纳米金颗粒与探针之间以au-s键的形式结合，形成5’-sh-a10-探针的形式，制备sjr2lamp特异的纳米金探针。

实施例2：sjr2寡核苷酸探针与纳米金颗粒连接所需试剂

a.单一试剂

b.混合试剂

①磷酸盐缓冲液(100mm)：0.02mnah2po4·h2o，0.08mna2hpo4·7h2o

②洗涤液(终浓度)：100mmnacl、10mm磷酸盐缓冲液、0.01％sds

实施例3：sjr2寡核苷酸探针与纳米金颗粒连接的过程

①取2nmol的硫醇-探针(20μl100μm储存液)加入到5ml15nm的纳米金溶液中，放置在恒温振荡器中以45℃，150rpm的条件温育24小时；

②随后加入以下溶液：500μl100mm的磷酸盐缓冲液，5μl10％的sds和200μl2m的nacl，重新放置在恒温振荡器中以同样条件孵育48小时；

③15,000rpm，4℃离心30min，去除上清液，加入5ml洗涤液洗涤一次；

④相同条件再次离心，得到的纳米金探针沉淀重悬于800μl缓冲液(同洗涤液)中，放置在4℃冰箱中避光保存。

实施例4：基于sjr2纳米金探针核酸比色分析法的lamp检测

基于sjr2纳米金探针核酸比色分析法的lamp检测原理：当纳米金溶液中电解质(离子强度)发生改变时，纳米金颗粒会发生非交联聚集，溶液颜色由原来的红色变为蓝色，纳米金探针与lamp扩增产物中的靶序列互补杂交将阻止由增加的离子强度诱导的非交联聚集，溶液颜色仍保持红色。因此若lamp扩增产物中加入纳米金探针后在高浓度盐溶液中仍然保持红色，则判断为阳性反应，若溶液变为蓝色则判断为阴性反应。

lamp反应体系见表1：

表1

lamp反应条件为65℃水浴60min。

lamp引物见表2：

表2

基于sjr2纳米金探针核酸比色分析法的lamp产物的分析

a.与荧光染料法检测结果的比较

将纳米金探针核酸比色分析法对lamp产物的检测结果与荧光染料可视法的检测结果进行比较，对比是否一致；

b.与琼脂糖凝胶电泳法检测结果的比较

将lamp扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，与上述结果再进行比较，对比是否一致。

实施例5：基于sjr2特异的纳米金探针的lamp检测体系的优化

a.对基于sjr2特异的纳米金探针的lamp检测体系中mg²⁺浓度的优化

mg²⁺浓度对于杂交后纳米金探针的聚集发挥关键作用。若mg²⁺浓度过低，不利于纳米金颗粒的聚集易造成假阳性的结果，若mg²⁺溶液的浓度过高，对纳米金颗粒的聚集作用过强，纳米金探针与靶序列的结合抵抗不了盐浓度对其的聚集作用，易造成假阴性的结果。实验结果证明在mg²⁺终浓度大于等于50mm的情况下阳性反应和阴性反应均能通过肉眼明确区分，阳性反应溶液颜色保持红色，阴性反应溶液颜色变为蓝色或紫色；当mg²⁺终浓度在小于50mm的情况下，不能把阳性反应与阴性反应区分开，溶液颜色均显示红色(图2)。因此，把基于纳米金探针的lamp检测体系中mg²⁺终浓度定为50mm。

b.lamp扩增产物与纳米金探针溶液比例的优化

同一浓度的日本血吸虫成虫dna进行lamp扩增反应，反应完成后纳米金探针溶液与lamp扩增产物按照0:10到10:0的比例混合，再在其中分别加入5μl150mmmgso4溶液观察溶液颜色的变化。结果如图3所示，当纳米金探针与lamp的扩增产物以4:6的比例混合时，阳性反应与阴性反应开始出现颜色差异，但是差异不是特别明显，当纳米金探针与lamp扩增产物的比例范围在4:6到8:2之间时，阳性反应与阴性反应均能通过颜色明显区分，但是从颜色深浅程度以及实验操作角度考虑，两者之间5:5的比例最合适。

实施例6：基于sjr2特异的纳米金探针的lamp检测体系的敏感性

系列稀释(1:10¹～1:10¹⁰)的日本血吸虫成虫dna进行两次lamp扩增反应，反应产物利用sjr2纳米金探针核酸比色分析法进行检测，并与supergreenι荧光染料的检测结果进行比对如图3所示，第一次检测显示纳米金探针核酸比色分析法在成虫dna模板稀释至1:10⁵(dna模板浓度为1.99pg/μl)时转为阴性(图4a1)，第二次检测显示纳米金探针核酸比色分析法在成虫dna模板稀释至1:10⁶(dna模板浓度为199fg/μl)时转为阴性(图4a2)，与荧光染料法及琼脂糖凝胶电泳法(图5)检测的敏感性一致。

实施例7：基于sjr2特异的纳米金探针的lamp检测体系的特异性

利用lamp法对日本血吸虫、曼氏血吸虫、华支睾吸虫、肺吸虫、旋毛形线虫以及埃及血吸虫dna进行扩增反应，扩增产物用纳米金探针核酸比色分析法进行检测，结果如图6所示，除日本血吸虫dna、曼氏血吸虫dna的扩增显示阳性反应(红色)外，其余模板扩增结果均为阴性反应，与荧光染料法及琼脂糖凝胶电泳法(图7)的检测结果一致。

实施例8：基于sjr2纳米金探针的lamp检测体系用于极低感染度家兔模型的早期诊断

应用30条日本血吸虫尾蚴感染家兔模型，于感染后3d、1w～20w采血，收集血清。在感染后7w收集家兔粪便，计算粪便中的epg为14，表明感染家兔为极低感染度血吸虫病模型。应用优化后的纳米金探针lamp法可从感染30条日本血吸虫尾蚴的家兔模型感染后3d及1w～4w的外周血清中扩增到日本血吸虫特异性dna片段，对低感染度动物模型血清具有较好的早期诊断效果(如图8所示)。

实施例9：基于sjr2纳米金探针的lamp检测体系用于极低感染度家兔模型的早期诊断及疗效考核价值

应用30条日本血吸虫尾蚴感染家兔模型，于感染后第7周，应用150mg/kg吡喹酮进行口服治疗，于感染前、感染后3d、1w～20w采血，收集家兔血清，提取血清dna待检。经吡喹酮(pzq)治疗后，纳米金探针lamp法对家兔血清的检测结果于治疗后第10w转为阴性，具有较好的疗效考核价值(如图9所示)。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110>苏州大学

<120>一种基于sjr2纳米金探针的lamp检测体系及其应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>（人工序列）

<400>1

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<210>2

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<213>（人工序列）

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<213>（人工序列）

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<213>（人工序列）

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