新型冠状病毒2019-nCoV实时荧光定量PCR检测引物和探针、试剂盒和方法与流程

本发明属于病毒检测技术领域，尤其涉及一种新型冠状病毒2019-ncov实时荧光定量pcr检测引物和探针、试剂盒和方法。

背景技术：

新型冠状病毒2019-ncov属于冠状病毒科、beta冠状病毒属，是2019年12月至2020年1月在武汉地区流行并被鉴定发现的一种新型冠状病毒。新型冠状病毒2019-ncov能致人疾病，能在人和动物之间传播，新型冠状病毒2019-ncov感染的症状有发热、喘息和肺炎等。

由于新型冠状病毒2019-ncov是2020年被鉴定发现的一种全新型冠状病毒，目前没有特异性的检测方法，而且这种病毒导致人呼吸道重症感染的情况比较常见，并有一定的传染性，确诊患者需要隔离治疗，故急切需要开发一种能够快速且准确对这种新型冠状病毒2019-ncov进行鉴定的分子方法，从而达到有效控制疫情流行传播，患者快速诊断隔离治疗的目的。

技术实现要素：

针对这种新型冠状病毒2019-ncov的全基因组序列信息，本发明提供了一种新型冠状病毒2019-ncov实时荧光定量pcr检测引物和探针、检测试剂盒和检测方法，目的在于满足快速、灵敏和准确诊断的需求。

本发明是这样实现的：

本发明的目的之一在于提供一种新型冠状病毒2019-ncov实时荧光定量pcr检测引物和探针，包括新型冠状病毒2019-ncov特异性引物如seqidno.4-5所示及其探针如seqidno.3所示。

本发明的目的之二在于提供一种新型冠状病毒2019-ncov实时荧光定量pcr检测试剂盒，包括所述的实时荧光定量pcr检测引物和探针，以及内标基因rnasep特异性引物如seqidno.4-5所示、及其探针如seqidno6所示。

进一步地，还包括：

阳性对照品：新型冠状病毒2019-ncov扩增序列质粒标准品；

内标溶液：含rnasep序列的病毒样颗粒溶液；

阴性对照品：rnasefreeh2o。

进一步地，还包括用于定量检测的阳性标准品，所述阳性标准品均为含浓度梯度的冠状病毒扩增序列质粒。

作为优选地，所述阳性标准品包括标准品1，浓度为1×10¹拷贝/ml；标准品2，浓度为1×10²拷贝/ml；标准品3，浓度为1×10³拷贝/ml；标准品4，浓度为1×10⁴拷贝/ml；标准品5，浓度为1×10⁵拷贝/ml，标准品⁶，浓度为1×10⁶拷贝/ml；标准品7，浓度为1×10⁷拷贝/ml。

本发明的目的之三在于提供一种新型冠状病毒2019-ncov实时荧光定量pcr检测方法，包括：以样品rna为模板，配制扩增反应体系进行实时荧光pcr扩增得到扩增曲线，对所述扩增曲线进行分析，并作出判断；所述扩增反应体系包括所述的新型冠状病毒2019-ncov的实时荧光定量pcr检测引物对和探针。

进一步地，所述扩增反应体系包括：样品模板、权利要求1所述的新型冠状病毒2019-ncov的实时荧光定量pcr检测引物和探针、5×pcrbuffer和enzymemix。所述扩增程序为：25℃2min；40℃10min；95℃5min；95℃3sec、60℃10sec，45个循环。

进一步地，对扩增曲线进行分析判断原则为：

当fam荧光通道中ct≤40时，判断样品为新型冠状病毒2019-ncov阳性；

当fam荧光通道中40<ct≤45时，重复一次实验，如果ct还是在此范围之内或小于40就判断样品为新型冠状病毒2019-ncov阳性，否则判断样品为新型冠状病毒2019-ncov阴性；

当fam荧光通道中无扩增曲线时，且hex通道中ct≤45时，判断样品为新型冠状病毒2019-ncov阴性；

当fam荧光通道中无扩增曲线时，且hex通道也无扩增曲线时，判断本次实验异常，需要重新提取标本rna和重新扩增。

本发明的目的之四在于提供所述的一种新型冠状病毒2019-ncov实时荧光定量pcr检测引物和探针在制备用于检测新型冠状病毒2019-ncov的试剂盒中的应用。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

1、本发明提供了供了新型冠状病毒2019-ncov的实时荧光pcr检测引物对、探针、试剂盒及检测方法，更够快速、准确且灵敏地检测出新型冠状病毒2019-ncov，特异性强、灵敏度高，高达5拷贝/ml。在进行病毒定性分析的同时还能进行病毒定量分析，定量线性范围好；实验结果重复性好，精密度高。本发明检测时间周期短，能在30分钟内完成检测，适用于临床和床旁的快速检测诊断，极大的节约了诊断时间。

2、本申请经过大量的创新性试验得出本申请的引物对、探针、试剂盒及检测方法，解决了用一对引物对和一个探针就检测出新型冠状病毒2019-ncov，且使其特异性强，灵敏度高的问题，这也是本申请最大的技术难点。本发明采用单管双荧光通道同时检测新型冠状病毒2019-ncov和内参基因rnasep的存在，能检测肺泡灌洗液、鼻拭子、咽拭子、全血、血清、血浆、尿液和大便等标本中新型冠状病毒2019-ncovrna的存在。当肺泡灌洗液、鼻拭子、咽拭子、全血、血清、血浆、尿液和大便中存在反转录或者pcr抑制时，容易造成病毒核酸定量结果不准备甚至出现“假阴性”，针对这个难点与技术问题，本发明设计了内参基因，可对标本提取和扩增这整个过程进行质量监控，能监控rna是否成功提取以及后续的逆转录和pcr是否顺利进行，以及监控是否出现人工操作失误。实时荧光定量pcr产物容易形成气溶胶，造成下一次检测结果被污染，产生“假阳性”报告，针对这个难点与技术问题，本发明加入了ung酶和dutp，能在新的扩增反应前通过25℃加热将可能存在以前的pcr产物降解消除掉，从而极大的杜绝了污染的可能性。本发明采用了高效逆转录酶，能在10分钟完成逆转录，同时采用了快速taq酶，能在15分钟内完成pcr，从而保证能在30分钟内完成检测，比一般实时荧光定量pcr检测耗时缩短了2小时，满足了快速和准确检测诊断的需求。

3、本发明提供了新型冠状病毒2019-ncov的实时荧光pcr检测引物对、探针、试剂盒及检测方法，不仅缩短了操作时间，减少了污染，也降低了样品诊断的成本，具有潜在的应用价值。

附图说明

图1是新型冠状病毒2019-ncov标准品扩增曲线；

图2是新型冠状病毒2019-ncov标准品浓度标准曲线；

图3是96例咽拭子标本新型冠状病毒2019-ncov实时荧光定量pcr扩增曲线；

图4是96例咽拭子标本内参基因rnasep实时荧光定量pcr扩增曲线；

图5是本发明的定量线性范围分析；

图6是新型冠状病毒2019-ncov确诊患者的不同类型标本的2019-ncov病毒实时荧光定量pcr扩增曲线；

图7是不同标本类型的新型冠状病毒2019-ncov阳性标本内参基因rnasep扩增曲线。

具体实施方式

实施例1实时荧光定量pcr检测试剂盒的开发

1、本实施例中选取新型冠状病毒2019-ncov特异性的编码包膜蛋白的e基因序列设计出一对特异性引物和一条特异性的荧光探针，选用内标基因rnasep设计出一对特异性引物和一条特异性的荧光探针，构建实时荧光定量pcr技术可对新型冠状病毒2019-ncov进行检测。e基因是冠状病毒的重要结构基因，本发明设计的引物和探针仅与新型冠状病毒2019-ncov的e基因100％相似，而与其他冠状病毒包括sars、mers、229e、oc43、nl63和hku1不匹配，故能特异性结合新型冠状病毒2019-ncov的e基因并起始扩增，而不扩增其他型别冠状病毒。本发明本实施例中设计的引物序列及探针序列见下表1所示。

表1

试剂盒内还包括阳性对照：新型冠状病毒2019-ncov标准品；阴性对照：rnasefreeh2o；内标溶液：含rnasep序列的病毒样颗粒溶液；5×pcrbuffer和enzymemix。其中5×pcrbuffer和enzymemix的配制方法如下：

5×pcrbuffer配制：

配置混合后于冰箱-20℃保存。

enzymemix配制：

配置混合后于冰箱-20℃保存。

2、新型冠状病毒2019-ncov的实时荧光pcr检测方法

(1)病毒核酸的提取

①首先在缓冲液1、2中加入无水乙醇，分别加入25ml和30ml无水乙醇；在漂洗液中加入30μg/mlcarrierrna；

②取30μl蛋白酶放入1.5ml离心管中；

③将标本(如脑脊液、全血等)取200μl加入此管中，加入5μl内标溶液，充分混匀；

④再在每管分别加入200μl漂洗液(含30μg/mlcarrierrna)，混匀振荡30s，70℃温育10min；

⑤加入250μl无水乙醇，充分混匀振荡30s，室温裂解5min；

⑥将上述裂解液加入离心柱中，8000rpm，离心1min，弃收集管中的离心液；滤柱仍放回收集管上，将步骤③剩余的混合液全部吸入滤柱中，离心后弃离心液；

⑦滤柱中加入500μl缓冲液1，12000rpm，离心1min，弃收集管中的离心液；

⑧另取一支干净的2ml收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加入500μl缓冲液2，12000rpm，离心1min。重复步骤⑧一次；

⑨将滤柱移到一个干净的收集管中，12000rpm，离心3min，后将滤柱放在37℃15min以干燥滤膜；

⑩将滤柱放在1.5mleppendorf管上，向滤柱中加入50μlrnase-freeh2o，室温静置2min；12000rpm，离心2min，收集离心液即为提取的核酸；

按上述方法提取96份疑似呼吸道病毒感染病人咽拭子标本的核酸。

(2)实时荧光定量pcr扩增(每份25μl体系)

取5μlrna作为模板，同时加入20μlpcr反应液(实时荧光定量pcr反应液的配制体系如表2所示)至八联管中进行实时荧光定量pcr扩增。

表2实时荧光定量pcr反应液的配制体系

(3)实时荧光定量pcr反应程序为：25℃5min；40℃10min；95℃5min；95℃5sec、60℃15sec，45个循环。从60℃步骤开始收集荧光信号。本发明使用lightcycle480ii实时荧光定量pcr仪进行检测。

(4)得到实时荧光定量pcr扩增结果，对扩增曲线进行分析，并作出判断。判断规则为：

当fam荧光通道中ct≤40时，判断样品为新型冠状病毒2019-ncov阳性；

当fam荧光通道中40<ct≤45时，重复一次实验，如果ct还是在此范围之内或小于40就判断样品为新型冠状病毒2019-ncov阳性，否则判断样品为新型冠状病毒2019-ncov阴性；

当fam荧光通道中无扩增曲线时，且hex通道中ct≤45时，判断样品为新型冠状病毒2019-ncov阴性；

当fam荧光通道中无扩增曲线时，且hex通道也无扩增曲线时，判断本次实验异常，需要重新提取标本rna和重新扩增。

3、实验结果

新型冠状病毒2019-ncov标准品扩增曲线如图1所示，标准品是含冠状病毒扩增序列质粒，标准品1浓度为1×10¹拷贝/ml；标准品2浓度为1×10²拷贝/ml；标准品3浓度为1×10³拷贝/ml；标准品4浓度为1×10⁴拷贝/ml；标准品5浓度为1×10⁵拷贝/ml；标准品6浓度为1×10⁶拷贝/ml；标准品7浓度为1×10⁷拷贝/ml；

图2是新型冠状病毒2019-ncov标准品浓度标准曲线，所述标准浓度曲线方程为：y＝-3.53x+46.18，其中x是浓度的log值，y是ct值。

利用上述构建的方法检测疑似呼吸道病毒感染病人咽拭子标本96份，检测出新型冠状病毒2019-ncov阳性3例；图3是这2例新型冠状病毒2019-ncov阳性标本及94份阴性标本的病毒实时荧光定量pcr扩增曲线，根据这2例阳性结果的所述ct值结合标准曲线方程，由rochelightcycler480分析软件自动分析得到这2例新型冠状病毒2019-ncov阳性标本的病毒浓度，具体结果见表3。同时，这96份标本的内参基因rnasep扩增曲线正常，如图4所示，说明本次实验的提取和扩增过程正常，阳性和阴性结果准确。

表32例新型冠状病毒2019-ncov阳性标本病毒浓度

实施例2新型冠状病毒2019-ncov的实时荧光pcr试剂盒的性能测定

1、准确性验证

病毒核酸检测的金标准是基因组测序，将此试剂盒的检测结果与病毒基因组测序做比较，分析其准确性。本实施例选取了基因组测序确定为新型冠状病毒2019-ncov的4例标本，用本发明提供的试剂盒检测后结果如下表4。由结果可见，4份阳性标本全部被检出，表明本发明提供的新型冠状病毒2019-ncov的实时荧光pcr的准确性为100％。

表4本发明的准确性分析

2、特异性验证

试剂盒的特异性是通过检测其他病原体来评估，本实施例选择了32种呼吸道及其他常见病原体阳性标本或质粒模拟阳性标本，结果如下表5。经检测，此发明对32种呼吸道及其他常见病原体阳性标本无扩增，表明本发明提供的新型冠状病毒2019-ncov的实时荧光pcr的特异性为100％。

表5本发明的特异性分析

3、灵敏度检测

灵敏度也即最低检测限，是指将阳性标本经过梯度稀释后，在最低稀释梯度的同一个标本上中测到靶核酸的可能性在统计学上概率>95％。用于灵敏度评估的样本在每个需评估的浓度水平检测次数应不少于20次，以至少19次出现阳性扩增信号为合格。在此，我们将新型冠状病毒2019-ncov的阳性标准品质粒按一定拷贝数倍比稀释后，每一个稀释度平均分为20个样本，用此发明的方法进行检测，出现19次及以上阳性的该拷贝数即为最低检测限，结果见表6。经验证，在5拷贝/ml浓度时，检出率为95％，低于此浓度时，检出率不足95％。由此可见，表明本发明提供的新型冠状病毒2019-ncov的实时荧光pcr的灵敏度为5拷贝/ml。

表6本发明的灵敏度分析

4、精确性检测

精确性是指相同阳性样本多次检测，结果判读的一致性，以变异系数(cv)小于5判定为精确性良好。本实施例在每个浓度梯度分3次检测4份阳性标本，结果如下表7所示。经验证，在5～1×10⁸拷贝/ml范围内，此发明的批内cv<5％，且批间cv<5％，精密度良好。

表7本发明的精确性分析

5、线性范围分析

本实施例分析了在1、5、10、20、50、1×10²、1×10³、1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷和1×10⁸拷贝/ml范围内，此发明的线性范围，结果如下图5所示，此发明提供的新型冠状病毒2019-ncov的实时荧光定量pcr在5～1×10⁸拷贝/ml范围内呈良好的线性范围。

实施例3临床检测

用上述方法对新型冠状病毒2019-ncov阳性确诊患者来源的肺泡灌洗液、鼻拭子、咽拭子、全血、血清、血浆、尿液和大便进行了检测，结果如图6所示，新型冠状病毒2019-ncov阳性确诊患者来源的肺泡灌洗液、鼻拭子、咽拭子、全血、血清、血浆、尿液和大便均有扩增曲线，且肺泡灌洗液、鼻拭子、咽拭子和大便标本中病毒含量较高，病毒阳性对照和病毒阴性对照正常。同时，这些标本的内参基因rnasep扩增曲线正常，如图7所示，说明本次实验的提取和扩增过程正常，阳性和阴性结果准确。由此证明本方法可适用于新型冠状病毒2019-ncov感染疑似患者的肺泡灌洗液、鼻拭子、咽拭子、全血、血清、血浆、尿液和大便的检测。

所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>华中科技大学同济医学院附属同济医院

<120>新型冠状病毒2019-ncov实时荧光定量pcr检测引物和探针、试剂盒和方法

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>27

<212>dna

<213>人工序列（引物cov-f）(artificialsequence)

<400>1

gagacaggtacgttaatagttaatagc27

<210>2

<211>24

<212>dna

<213>人工序列（引物cov-r）(artificialsequence)

<400>2

caatattgcagcagtacgcacaca24

<210>3

<211>31

<212>dna

<213>人工序列（探针cov-fam）(artificialsequence)

<400>3

agttacactagccatccttactgcgcttcga31

<210>4

<211>19

<212>dna

<213>人工序列（引物rnasep-f）(artificialsequence)

<400>4

agatttggacctgcgagcg19

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列（引物rnasep-r）(artificialsequence)

<400>5

gagcggctgtctccacaagt20

<210>6

<211>23

<212>dna

<213>人工序列（探针rnasep-hex）(artificialsequence)

<400>6

ttctgacctgaaggctctgcgcg23