一种检测牛冠状病毒BCV的检测试剂盒及使用方法与流程

本发明涉及一种用于检测特定病毒的试剂盒及这种试剂盒在非疾病检测目的的使用方法，确切讲本发明涉及一种检测牛冠状病毒bcv的检测试剂盒及非疾病检测的使用方法。

背景技术：

牛冠状病毒(bovinecoronavirus,bcv)为不分段的单股正链rna病毒，有囊膜。病毒粒子具有多形性，但基本呈球形，直径为65～210nm，基因组大小为31043bp，主要编码5种结构蛋白，从5′端到3′端依次为核衣壳蛋白(n,52kd)，膜蛋白(m,25kd)，小衣壳蛋白(e,8kd)，纤突蛋白(s,180kd)和血凝素酯酶蛋白(he,65kd)。其中，n基因高度保守，常被用于bcv的核酸检测和鉴定；虽然m蛋白基因序列同源性不高，但蛋白结构化学性质上存在很大的保守性，是组成病毒粒子的关键部分；e蛋白位于膜蛋白的内部，在病毒粒子包装时发挥重要作用；s蛋白主要负责与宿主细胞受体相互作用、促进膜融合及诱导中和抗体，由s1、s2两个亚单位构成；he蛋白是由两个单体经二硫键连接形成的二聚体，可介导病毒粒子与多种动物的红细胞凝集。

自从1972年，mebus等在犊牛的腹泻病料中检测出bcv病毒以后，保加利亚、比利时、加拿大、荷兰、新西兰、日本、意大利等国也相继报道了该病毒。目前已遍布全世界，该病给世界各国养牛业造成了巨大的经济损失。我国最早于1990年姚火春等应用ha/hi方法检测我国部分地区的牛血清样本，结果显示bcv阳性率为44.3～80.2％，之后于1995年杨盛华等从猝死黄牛中分离到bcv病毒，2012年傅彩霞等用elisa方法检测来自北京地区密云、昌平和怀柔3个区县的31个规模化奶牛场的1650份血清，结果显示大多牛血清样本存在bcv抗体，平均阳性率达57.2％，表明bcv感染在我国部分牛群中普遍存在。建立牛冠状病毒快速特异的检测方法是有效控制和预防该病的关键，这样能够及早发现并隔离，防止传染其他健康牛，建立新型、灵敏度高、特异性好的牛冠状病毒检测方法迫在眉睫，并且要区分其他病毒细菌等病原也可能引起牛的腹泻，例如牛轮状病毒(brv)、牛病毒性腹泻病毒(bvdv)、牛传染性鼻气管炎病毒(ibcv)、牛肠道病毒(bev)、大肠杆菌(e.coli)、沙门氏菌(salmonella)和金黄色葡糖球菌(s.aureus)。因此，腹泻的临床病例需要通过实验室检测技术来确定，目前牛冠状病毒的检测方法主要包括病原学检测方法，血清学检测方法，分子生物学检测方法等，参见孙留霞,朱平军,李文华,张素丽,袁文菊.牛冠状病毒检测方法的研究进展[j].上海畜牧兽医通讯,2014(05):20-22.。病原学检测中的电镜观察法检测病毒结果准确快速，但是高昂的设备及对检测者的高专业要求限制了该方法的普及应用；病毒的分离与鉴定一般需要较长的周期，且牛冠状病毒基因组较大，在体外环境中不稳定，初代分离极为困难。血清学检测方法中的血凝和血凝抑制试验需要数量充足的新鲜的红细胞保证试验的准确；中和试验需要保证病毒能在某系细胞系增殖并产生细胞病变；酶联免疫吸附试验、反向被动血凝试验、荧光抗体技术及免疫荧光技术等在检测血清时不能区分犊牛的母源抗体、接种疫苗和野毒感染的结果，如崔鑫.新疆南疆部分规模奶牛场轮状和冠状病毒流行病学调查[d].塔里木大学,2019.，]张坤.新疆北疆地区规模化奶牛场犊牛病毒性腹泻相关病原的调查研究[d].石河子大学,2016.。分子生物学检测方法主要包括rt-pcr、巢式pcr、双重pcr及实时荧光定量pcr方法等，但也有其局限性，对复杂体系的扩增会出现非特异性产物扩增以及扩增效率不够高、检出限不够低等问题，实时定量pcr还需要昂贵的仪器，在基层实验室很难普及推广。这些缺点限制了上述方法在临床诊断中的应用。因此，目前亟需建立一种能够快速、特异的检测牛冠状病毒的方法。

技术实现要素：

为了克服现有技术中存在的缺陷和不足，本发明旨在建立一种可克服现有技术不足的牛冠状病毒bcv的检测试剂盒及这种试剂盒非疾病诊断的使用方法。

本发明的一种用于检测牛冠状病毒bcv的检测试剂盒内包括有扩增引物seqidno.3和seqidno.4。

优选地，本发明的用于检测牛冠状病毒的检测试剂盒内还有引物seqidno.1和seqidno.2。所述的引物序列seqidno.1和seqidno.2是用于扩增作为模板的n基因seqidno.5。

进一步，本发明的检测试剂盒内还有纳米金属粒子的pcr缓冲液、taqdna聚合酶，这样可大大方便检测工作。

更优选地，本发明的检测试剂盒中所使用含有纳米金属粒子的pcr缓冲液为晓东生物的产品npk02(威海晓东生物技术有限公司)。

本发明的任一试剂盒非疾病诊断的使用方法是：提取待检样本中病毒的rna，并将rna反转录为cdna得到扩增模板，将扩增模板用扩增引物seqidno.3和seqidno.4进行pcr扩增，pcr产物用琼脂糖电泳检测，根据电泳图中是否出现特定条带确定待检样本是否带有牛冠状病毒。

优选地，本发明的非疾病诊断使用检测试剂盒的方法是：

pcr时的反应体系为：

2×nanopcrbuffer12.5μl，

引物p3/p4(10μm)0.8μl，

pet-28a-n(+)1.0μl，

taqdna聚合酶(5u/μl)0.5μl，

ddh2o补至总体系25.0μl。

反应条件为：

95℃、5min；

35个循环：95℃、30s，51℃、30s，72℃、30s；

72℃、10min。

本发明提供了一种能够快速、特异的检测牛冠状病毒bcv检测试剂盒及使用方法。纳米pcr是一种敏感、便捷的新型pcr技术，其原理是在纳米pcr缓冲液中添加了粒径为1nm～100nm的纳米金属颗粒，当反应时产生具有超强导电性的纳米流体，从而加快温度升高和下降的速度，减少在非目标温度的停留时间，进而缩短了整个体系到达温度平衡所用的时间，因而减少了非特异性扩增反应，同时提高了扩增效率和敏感性。更为突出的是本发明的纳米pcr至少比常规pcr的敏感性要高出100倍，因此具有更好的应用前景。

附图说明

图1.为本发明不同退火温度的电泳图，其中：泳道m列为dnamarkertrans2k；泳道nc为阴性对照；泳道1～8分别为46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃不同的退火温度。

图2.为本发明不同引物添加量的电泳图，其中：泳道m为dnamarkertrans2k；泳道nc为阴性对照；泳道1～7为1.2μl、1.0μl、0.8μl、0.6μl、0.5μl、0.4μl、0.3μl不同引物的量。

图3.为本发明bcv纳米pcr(a)的电泳图，其中：泳道m为dnamarkertrans2k；泳道nc为阴性对照；泳道1～9分别为不同拷贝的检测结果，(1)拷贝数2×10⁹拷贝/μl、(2)拷贝数2×10⁸拷贝/μl、(3)拷贝数2×10⁷拷贝/μl、(4)拷贝数2×10⁶拷贝/μl、(5)拷贝数2×10⁵拷贝/μl、(6)拷贝数2×10⁴拷贝/μl、(7)拷贝数2×10³拷贝/μl、(8)拷贝数2×10²拷贝/μl、(9)拷贝数2×10¹拷贝/μl。

图4为本发明常规pcr(b)的电泳图，其中：泳道m为dnamarkertrans2k；泳道nc为阴性对照；泳道1～9分别为不同拷贝的检测结果，(1)拷贝数2×10⁹拷贝/μl、(2)拷贝数2×10⁸拷贝/μl、(3)拷贝数2×10⁷拷贝/μl、(4)拷贝数2×10⁶拷贝/μl、(5)拷贝数2×10⁵拷贝/μl、(6)拷贝数2×10⁴拷贝/μl、(7)拷贝数2×10³拷贝/μl、(8)拷贝数2×10²拷贝/μl、(9)拷贝数2×10¹拷贝/μl。

图5.为本发明的纳米pcr的特异性实验电泳图，其中泳道m为dnamarkertrans2k；泳道nc为阴性对照；泳道1～8分别为：牛冠状病毒(bcv)、牛轮状病毒(brv)、牛病毒性腹泻病毒(bvdv)、牛传染性鼻气管炎病毒(ibcv)、牛肠道病毒(bev)、大肠杆菌(e.coli)、沙门氏菌(salmonella)和金黄色葡球菌(s.aureus)。

具体实施方式

通过以下实施例对本发明作进一步的详细描述，以下内容仅用于理解本发明，而不应认为是对本发明限制。

实施例1：纳米pcr方法的建立

1、引物设计：

参照genbank中发表的bcv(登录号：mh475915)基因组序列的分析，应用primer3.0软件设计扩增bcv-n基因的全长序列引物，通过与已公布的n基因全长序列进行比对后筛选保守区域设计扩增396bp片段的引物。引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成：

2、标准品的制备：

bcv病毒在vero细胞增殖后提取rna，反转录后作为模板用p1/p2引物扩增n基因全长序列，获得的产物大小为1344bp。将其经过胶回收纯化后连接到pet-28a载体中构建重组质粒，并且测序正确后，将其保存于-80℃冰箱，并命名为pet-28a-n(+)，作为pcr阳性模板。

3、纳米pcr与常规pcr扩增条件和体系的优化：

纳米pcr反应体系预设定为：

2×nanopcrbuffer12.5μl，

引物p3/p4(10μm)0.8μl，

pet-28a-n(+)1.0μl，

taqdna聚合酶(5u/μl)0.5μl，

ddh2o补至总体系25.0μl。

反应条件预设定为：

95℃、5min；

35个循环：95℃、30s，51℃、30s，72℃、30s；

72℃、10min。

常规pcr反应体系中，在反应buffer中无纳米颗粒，其他的反应条件与优化的纳米pcr相同。

4、退火温度的优化：

利用pcr仪器将温度进行梯度设置为46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃，进行退火温度的优化，反应体系和其他反应条件均相同。用seqidno.3/4引物，进行pcr，反应结束后取pcr产物用1.0％的琼脂糖电泳检测。如图1所示，最佳的退火温度为51℃。

最终的反应条件设定为：

95℃、5min；

35个循环：95℃、30s，51℃、30s，72℃、30s；

72℃、10min。

5、引物添加量的优化：

引物(浓度都为10μm/l)的使用体积从0.5μl到1.2μl进行优化，反应条件为优化后的退火温度为准。其他条件都不变，如图2所示，最终引物的量为0.8μl(10μmol/l)为最佳。

6、敏感性试验：

测定阳性模板pet-28a-n(+)质粒浓度，并换算成拷贝数，按照10倍倍比稀释后。分别利用纳米pcr和常规pcr进行扩增，以比较其两者的敏感性；试验重复3次。

构建的重组质粒的浓度测定为154ng/μl，根据公式计算得出的拷贝浓度为2×10¹⁰拷贝数/μl。将重组质粒进行10倍倍比稀释，得到浓度标准品为(2×10¹拷贝数/μl～2×10⁹拷贝数/μl)。

纳米pcr能检测到20拷贝数/μl(图3)，而常规pcr的最低检测量为2×10³拷贝/μl(图4)，表明纳米pcr至少比常规pcr的敏感性要高出100倍。

7、特异性检测试验：

应用纳米pcr分别对牛轮状病毒(brv)、牛病毒性腹泻病毒(bvdv)、牛传染性鼻气管炎病毒(ibcv)、牛肠道病毒(bev)、大肠杆菌(e.coli)、沙门氏菌(salmonella)和金黄色葡球菌(s.aureus)进行检测，以此验证其纳米pcr的特异性；试验重复3次。

采用seqidno.3/4引物分别对牛冠状病毒(bcv)、牛轮状病毒(brv)、牛病毒性腹泻病毒(bvdv)、牛传染性鼻气管炎病毒(ibcv)、牛肠道病毒(bev)、大肠杆菌(e.coli)、沙门氏菌(salmonella)和金黄色葡球菌(s.aureus)进行纳米pcr检测，结果只有牛冠状病毒(bcv)能扩增出396bp的目的片段，其他病原未扩增出条带(图4)，试验表明bcv纳米pcr检测具有良好的特异性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>青海省畜牧兽医科学院

<120>一种检测牛冠状病毒bcv的检测试剂盒及使用方法

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>24

<212>dna

<213>人工序列牛冠状病毒n基因长片段上游引物(bcv-n1344f)

<400>1

atgtcttttactcctggtaagcaa24

<210>2

<211>29

<212>dna

<213>人工序列牛冠状病毒n基因长片段下游引物(bcv-n1344r)

<400>2

ttatatttctgaggtgtcttcagtatagg29

<210>3

<211>26

<212>dna

<213>人工序列牛冠状病毒n基因短片段上游引物(bcv-n396f)

<400>3

ctactattcttggttctctggaatta26

<210>4

<211>25

<212>dna

<213>人工序列牛冠状病毒n基因短片段下游引物(bcv-n396r)

<400>4

cttcctgagccttcaatatagtaac25

<210>5

<211>1344

<212>dna

<213>人工序列牛冠状病毒n基因部分片段(ngenepartialfragmentofbovinecoronavirus，bcv)

<400>5

atgtcttttactcctggtaagcaatccagtagtagagcgtcctttggaaatcgttctggt60

aatggcatccttaagtgggccgatcagtccgaccaatctagaaatgttcaaaccaggggt120

agaagagctcaacccaagcaaactgctacttctcagcaaccatcaggagggaatgttgta180

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